Summary

Einfacher Nachweis der primären Cilia durch Immunfluoreszenz

Published: May 15, 2020
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Summary

Primäre Zilien sind extrazelluläre Strukturen, die mit dem Centriole verbunden sind. Der primäre Ziliennachweis durch immunfluoreszierende Färbung ist ein relativ einfaches Verfahren, das zu extrem hochwertigen Bildern führt. In diesem Protokoll wurden Fibroblasten, die primäre Zilien exdrücken, fixiert, immungefärbt und in einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop abgebildet.

Abstract

Primäre Zilien werden während des Zellzyklusfortschritts dynamisch reguliert, insbesondere während der G0/G1-Phasen des Zellzyklus, die vor der Mitose resoorbiert werden. Primäre Zilien können mit hochentwickelten Methoden visualisiert werden, einschließlich Transmissionselektronenmikroskopie, 3D-Bildgebung oder mit Software zur automatischen Detektion von Primärzilien. Jedoch, immunfluoreszierende Färbung der primären Zilien ist erforderlich, um diese Methoden durchzuführen. Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur einfachen Detektion von primären Zilien in vitro durch Färbung von acetyliertem Alpha-Tubulin (Axonem) und Gamma-Tubulin (Basalkörper). Dieses immunfluoreszierende Färbeprotokoll ist relativ einfach und führt zu qualitativ hochwertigen Bildern. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie vier Zelllinien (C2C12, MEF, NHLF und Hautfibroblasten), die primäre Zilien exdrücken, mit einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop fixiert, immungefärbt und abgebildet wurden.

Introduction

Primäre Zilien sind sensorische, einsame, membrangebundene, nichtmotile Strukturen, die mit dem Mutterzenriole der Zelle assoziiert sind. Primäre Zilien sind auf den meisten Wirbeltierzellen mit Ausnahme von roten Blutkörperchen, Adipozyten1und Hepatozyten2gefunden. Primäre Zilien werden als läntiges Axonem gebildet, das aus Mikrotubuli besteht, deren Hauptbestandteil das -Tubulin ist. Das Axonem wächst aus dem Basalkörper, der aus dem Tubulin strukturiert ist. Die Länge der primären Zilien variiert zwischen 2–10 m; jedoch können sich seine Abmessungen während der Glykolation, des Hungers, der Hypoxie, des zytotoxischen Stresses oder nach der Exposition gegenüber ionisierender Strahlungändern 3,4,5,6,7. In der Regel haben Zellen nur ein primäres Cilium, das an Morphogenese und Zellsignalbahnen beteiligt ist, die für die Zellproliferation und -differenzierung wichtig sind8,9.

Primäre Zilien werden während des Zellzyklusverlaufs dynamisch reguliert, insbesondere während der G0/G1-Phasen, und vor dem Eintritt in die Mitose in einem Prozess im Zusammenhang mit der Tubulin-Deacetylierung, die durch HDAC6 (Histondeacetylase 6)10vermittelt wird, resosorbiert. Das genaue Moment der primären Zilienresorption hängt vom Zelltyp und der Expression von Genen ab, die direkt an diesem Prozess beteiligt sind, wie Aurora A, Plk1, TcTex-1111,12,13. Je nach Zelltyp exprimieren die primären Zilien verschiedene Arten von Rezeptoren, Ionenkanälen und aktiven Signalsignalen. Dazu gehören die wichtigsten Signalrezeptoren, die Proliferation und Überleben beeinflussen, EGFR, PDGFR, und FGFR. Ebenfalls enthalten sind einige der Signalwege, die die Funktion eines oder mehrerer Organe beeinflussen können, einschließlich Igel, Kerb, und Wnt. Dank dieser Rezeptoren und Signalwege, die primäre Zilien führen auch eine chemosensorische Funktion. Diese Funktion ermöglicht primäre Zilien, spezifische Liganden für Kerbe, Hormone und biologisch aktive Substanzen wie Serotonin oder Somatostatin zu erkennen. Andere spezifische Funktionen, die von primären Zilien unterschiedlicher Länge gezeigt werden, sind die Reaktion auf Temperatur-, Schwerkraft- und Osmolalitätsänderungen14.

Primäre Zilien können durch verschiedene Methoden visualisiert werden, wie Live-Visualisierung, Transmissionselektronenmikroskopie, 3D-Bildgebung, oder durch Software für die automatische Detektion von primären Zilien5,15,16,17. Diese Methoden sind jedoch hochspezialisierte und laufende Forschung braucht grundlegende, schnelle und einfache Methoden für die Färbung primäre Zilien in jeder Phase der Forschung. Beschrieben ist eine einfache und nützliche Methode zum Nachweis von primären Zilien in kultivierten Zellen.

Protocol

1. Zubereitung von Kulturmedien, Lösungen und Gerichten Autoclave die Abdeckungen (22 x 22 mm). Bereiten Sie 6 Brunnenplatten vor. Fetales Rinderserum (FBS) und Antibiotikum Penicillin/Streptomycin auftauen und das Kulturmedium auf Raumtemperatur (RT) erwärmen. Trypsin-EDTA verwenden (0,25%) und 1x PBS (Phosphat gepufferte Saline mit Kalzium und Magnesium) um die Zellen zu durchführen. Frisches 4% Paraformaldehyd (PFA) in dH2O (800 mg PFA in 20 ml dH2O) zubereiten. Die PFA mus…

Representative Results

Die immunfluoreszierende Färbung der primären Zilien ist ein relativ einfaches Verfahren, das zu qualitativ hochwertigen Bildern führt. In diesen Experimenten wurden Fibroblasten, die primäre Zilien exdrücken, fixiert, immungefärbt und in einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop nach dem oben beschriebenen Protokoll abgebildet. Das primäre Cilium wurde mit Acetylat-Tubulin und -Tubulin nachgewiesen. Die Bewertung der primären Zilien kann auf verschiedenen Ebenen durchgeführt werden und jede Änderung in …

Discussion

Mehrere Autoren haben verschiedene Methoden für den Nachweis von primären Zilien beschrieben, manchmal auch verschiedene Fixierungsmethoden beschreiben, die ihre Erkennung beeinflussen können6,20,21,22. Unabhängig davon ist es schwierig, ein vollständiges und einfaches Protokoll für die Erkennung zu finden. Die Verfügbarkeit einer solchen Methode wäre zweifellos eine große Hilfe für d…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Verteidigungsministerium der Tschechischen Republik unterstützt – Langfristiger Organisationsentwicklungsplan Medizinische Aspekte von Massenvernichtungswaffen der Fakultät für Militärische Gesundheitswissenschaften, Universität für Verteidigung; Ministerium für Bildung, Jugend und Sport, Tschechische Republik (Spezifisches Forschungsprojekt Nr.: SV/ FVZ201703) und PROGRES Q40/06. Danke auch an Daniel Diaz für seine freundliche Unterstützung in der englischen Sprachrevision.

Materials

6-well plate TPP 92406 Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488 Jackson ImmunoResearch 111-546-047 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γ Sigma-Aldrich T5192 Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12 ATCC CRL-1772 Myoblast (mouse)
Cy3 Sigma-Aldrich C2181 Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma-Aldrich D9542
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium Thermo Scientific 11960044 High glucose, No glutamine, Gibco
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8662 With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific 16000044 Sterile-Filtered, Gibco
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
MEF ATCC SCRC-1039 Mouse embryonic fibroblast
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin Sigma-Aldrich T7451 Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse
NHLF Lonza CC-2512 Primary lung fibroblasts (human)
Normal Goat Serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G Powder
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Scientific P36961
Skin fibroblasts Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové.
Square Cover Slips Thermo Scientific 22X22-1.5 Borosilicate glass, 22x22mm, Square
Triton X-100 Sigma-Aldrich 11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Scientific 25200072 Sterile-Filtered, Gibco

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Filipova, A., Diaz Garcia, D., Dvorak, J., Filip, S., Jelicova, M., Sinkorova, Z. Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (159), e61155, doi:10.3791/61155 (2020).

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