Etablierung eines Porcine Ex Vivo Cornea Modells zur Untersuchung von medikamentösen Behandlungen gegen bakterielle Keratitis

Hornhautinfektionen sind wichtige Ursachen für Erblindung und treten in epidemischen Ausmaßen in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen auf. Die Ätiologie der Krankheit variiert von Region zu Region, aber Bakterien machen die steile Mehrheit dieser Fälle aus. Pseudomonas aeruginosa ist ein wichtiger Erreger, der eine schnell fortschreitende Krankheit verursacht. In vielen Fällen, Patienten mit stromalen Narben, unregelmäßigen Astigmatismus links, erfordern Transplantation oder im schlimmsten Fall, verlieren ein Auge^1,2.

Bakterielle Keratitis verursacht durch P. aeruginosa ist eine schwierige Augeninfektion zu behandeln, vor allem aufgrund der zunehmenden Entstehung von antimikrobiellen resistenten Stämmen von P. aeruginosa. Innerhalb des letzten Jahrzehnts hat sich gezeigt, dass das Testen und Entwickeln neuer Behandlungen für Hornhautinfektionen im Allgemeinen und solche, die durch Pseudomonas sp. verursacht werden, im Besonderen unerlässlich ist, um den aktuellen Trend der Antibiotikaresistenz zu bekämpfen³.

Für die Prüfung der Wirksamkeit neuer Behandlungen von Hornhautinfektionen sind konventionelle mikrobiologische In-vitro-Methoden aufgrund des Unterschieds in der bakteriellen Physiologie während der Laborkultur und bei Infektionen in vivo sowie aufgrund des Fehlens der Wirtsschnittstelle^4,5ein schlechtes Ersatzzeichen. In-vivo-Tiermodelle sind jedoch teuer, zeitaufwändig, können nur eine kleine Anzahl von Repliken liefern und Bedenken hinsichtlich des Tierschutzes aufkommen lassen.

In diesem Artikel zeigen wir ein einfaches und reproduzierbares organotypisches Ex-vivo-Schweinemodell der Keratitis, das verwendet werden kann, um verschiedene Behandlungen auf akute und chronische Infektionen zu testen. Wir haben P. aeruginosa für dieses Experiment verwendet, aber das Modell funktioniert auch gut mit anderen Bakterien und Organismen wie Pilzen und Hefe, die Keratitis verursachen.

Albino Laborkaninchen wurden im Labor für andere geplante experimentelle Arbeiten unter Home Office genehmigt Protokolle geopfert. Die Augen waren für den experimentellen Einsatz in diesen Studien nicht erforderlich, so dass sie für dieses Protokoll verwendet wurden.

1. Sterilisation

1. KRITISCHER SCHRITT: Alle Zangen und Scheren durch Einweichen für 1 h in 5% (v/v) Lösung von Distel in destilliertem Wasser, mit einer Bürste reinigen, mit Leitungswasser abspülen und im Ofen bei 185 °C für mindestens 2 h sterilisieren.
2. Sterilisieren Sie alle anderen Glaswaren und Reagenzien durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 Minuten oder bereiten Sie Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Führen Sie die folgenden Verfahren in einem Sicherheitsschrank der Klasse II für Mikrobiologie durch.

2. Probensammlung

1. Sammlung von Schweineaugen
   1. Große weiße Landrassesauen, ein Kreuz mit einem Hampshire-Schwein wurde verwendet. Die Tiere wurden mit einem elektrischen Strom betäubt und die Augen wurden 2 h später im Schlachthof enukleiert.
   2. KRITISCHER SCHRITT: Übertragen Sie die Augen nach der Enuklede in einer sterilen Phosphatgepufferten-Saline-Lösung (PBS), um zu verhindern, dass sie austrocknen, und verarbeiten Sie sie sofort nach ihrer Ankunft.
2. Sammlung von Kaninchenaugen
   1. Verbrauchen Sie die Hornhäuten und senden Sie in sterilem PBS ins Labor.

3. Vorbereitung des korneoskleralen Knopfes

1. Verwenden Sie sterile Zangen, um das Gewebe um den Augapfel zu halten und es auf eine Petrischale zu übertragen. Entfernen Sie die Bindehaut und Muskelgewebe um den Augapfel auf einer Petrischale mit Skalpellklinge Nr. 15 und Zange.
2. Heben Sie den Augapfel vorsichtig an, während Sie den Sehnerv mit Derzange halten und in ein 0,5 L Glas mit sterilem PBS übertragen.
3. Sobald alle Augen von umgebendem Gewebe befreit sind, bewegen Sie sie mit sterilen Zangen in ein anderes 0,5 L Glas gefüllt mit 3% (v/v) Povidon Jod in PBS und lassen Sie für 1 min.
4. Übertragen Sie Augäpfel auf ein anderes 0,5 L Glas mit sterilem PBS.
5. Verwenden Sie Zangen, um das Auge noch auf einer Petrischale zu halten und machen Sie einen Schnitt in der Nähe der Hornhaut mit einem Skalpell Klinge Nr. 10A.
6. KRITISCHER SCHRITT: Halten Sie die Kante des Schnitts und verwenden Sie eine Schere, um die Hornhaut zu verbrauchen, so dass ca. 3 mm Sklera um die Hornhaut herum liegen. Stellen Sie sicher, dass das scharfe Ende der Schere nicht die Iris oder das Aderhautgewebe durchbohrt und sich im supraaderoidalen Raum befindet.
7. Halten Sie die korneosklerale Taste mit Zangen und verwenden Sie ein weiteres Paar spitzeRendzange, um das Uvealgewebe sanft zu trennen.
8. Heben Sie den korneoskleralen Knopf von der verbleibenden Kugel und spülen Sie ihn kurz in 1,5% (v/v) Povidon-Jodlösung in PBS in einer 12-Well-Platte aus.
9. Legen Sie den korneoskleralen Knopf in eine weitere 12 Wellplatte, die mit sterilem PBS gefüllt ist.
10. Nach der Verarbeitung aller Augen(empfohlen maximal 40 Augen in einer Charge),legen Sie jeden korneoskleralen Knopf auf eine einzelne Petrischale (34 mm Durchmesser) Epithelseite nach oben und gießen Sie in 3 ml Kulturmedium vorgewärmt auf 37 °C.
    ANMERKUNG: Die Zusammensetzung des Kulturmediums ist wie folgt: Dulbeccos modifiziertes Eagle es Medium (DMEM): Schinken [1:1] ergänzt durch 5 'g'mL^-1 Insulin und 10 ng'mL^-1 epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 10% (v/v) fetales Kalbsserum (FCS), 100 U'mL^-1 Penicillin, 100 U-mL^-1 Streptomycin und 2,5 g^{-mL -1} Amphotericin B. Optional kann das Medium mit 50 g l^-1 Dextran ergänzt werden, um eine Schwellung der ausgeschnittenen Hornhaut während der weiteren Inkubationsschritte zu verhindern.
11. Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator.

4. Wartung der korneoskleralen Tasten

1. Verwenden Sie nach 24 Stunden die aseptische Technik, um Medien zu entfernen und durch 3 ml frische vorgewärmte Kulturmedien zu ersetzen, die Antibiotika enthalten. Halten Sie die korneoskleralen Knöpfe in den Medien mit Antibiotika für 48 h, um die Hornhäuten zu desinfizieren. Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator.
2. KRITISCHER SCHRITT: Entfernen Sie nach 48 Stunden die Medien und spülen Sie Diehornhäuten mit 2 ml PBS ab. Dann halten Sie die korneoskleralen Knöpfe in antibiotikafreien Medien mindestens zwei oder idealerweise drei Tage vor einer experimentellen Infektion, um Restantibiotika aus dem Gewebe zu entfernen.
3. Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator. Wechseln Sie die Medien innerhalb dieser drei Tage mindestens ein einziges Mal. Verwerfen Sie Hornhäuten, wenn sich Trübung im antibiotikafreien Medium entwickelt.

5. Vorbereitung eines Inokulums

1. 10 ml LB-Brühe in einen 50 ml Kegelkolben mit Schaumstoffstopfen gießen.
2. Übertragen Sie eine Kolonie von P. aeruginosa Stamm PAO1 oder Stamm PA14 von einer frischen Agarplatte und inkubieren bei 37 °C für 3-4 h, bis die Bakterien in der Mitte-Log-Phase sind.
3. Übertragen Sie die Bakterienkultur in ein 50 ml-Rohr und eine Zentrifuge bei 3.000 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet in PBS wieder auf.
4. Wiederholen Sie Schritt 5.3 zwei weitere Male, um die Zellen zu waschen. Setzen Sie das Zellpellet in PBS wieder auf und passen Sie die optische Dichte bei 600 nm auf etwa 0,6 an, indem Sie steriles PBS als Rohling verwenden.

6. Infizieren der korneoskleralen Taste

1. Entfernen Sie Die Medien von der Petrischale und spülen Sie Corneas zweimal mit 1 ml sterilem PBS aus.
2. Drücken Sie vorsichtig die Zange, während Sie die Hornhaut dazwischen halten. Verwenden Sie ein 10A Skalpell, um vier Schnitte – zwei vertikale, zwei horizontale – im mittleren Abschnitt des korneoskleralen Knopfes durch die Epithelschicht zum darunter liegenden Stroma zu machen.
3. Legen Sie eine sterile Glasform in eine 6-Well-Platte mit dem breiten Teil nach oben und legen Sie die Hornhaut in der Mitte der Glasform, Epithelseite nach unten. Machen Sie den Schnitt rechts in der Mitte des unteren Teils der Glasform.
4. KRITISCHER SCHRITT: Gießen Sie 1 ml 1% (w/v) niedriger Schmelzpunkt Agar in DMEM gelöst, um die Glasform vollständig mit Hornhaut zu füllen.
5. Lassen Sie den Agar setzen und dann die Glasform invertieren, so dass das Hornhautepithel nach oben zeigt.
6. Pipette 15 l der Bakterienkultur mit OD_600nm = 0,6 (für P. aeruginosa entspricht dies etwa 1 x 10⁷ Koloniebildenden Einheiten (CFU) in 15 l) direkt in einen Schnittbereich und dann 85 l PBS nach oben geben, um das Hornhautepithel feucht zu halten. Verdünnen Sie die verbleibende Bakterienkultur und Platte auf Agar, um koloniebildende Einheiten für das Inokulum zu zählen.
7. Fügen Sie 1 ml DMEM ohne Antibiotika auf den Boden jedes Brunnens mit der Glasform. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte mit den infizierten korneoskleralen Knöpfen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%_CO2 für bis zu 24 h.
8. Richten Sie bei jedem Experiment nicht infizierte Kontrollhornhaut ein. Um die nicht infizierte Kontrolle einzurichten, ersetzen Sie die 15 L der Bakterienkultur in Schritt 6.6 durch sterile PBS.

7. Homogenisierung der Hornhaut zur Ernte der Bakterien

1. Entsorgen Sie das DMEM-Medium von der Unterseite der 6-Well-Platte und fügen Sie 1 ml sterile PBS hinzu, um den Boden des Brunnens zu spülen.
2. Entfernen Sie PBS vorsichtig durch Pipettieren, ohne den zentralen Teil der korneoskleralen Taste zu berühren. Entfernen Sie den Glasring mit sterilen Zangen und legen Sie ihn in das 5% Distel.
3. Spülen Sie die Oberseite der korneoskleralen Taste mit 1 ml PBS zweimal [optional] vorsichtig ab.
4. Halten Sie die Kante des korneoskleralen Knopfes mit feinen Spitzenzangen und lösen Sie sie vom Darunterliegenden Agar.
5. Übertragen Sie die Hornhaut auf ein 50 ml Rohr gefüllt mit eiskalten 1-2 ml PBS.
6. Verwenden Sie einen feinen Spitzenhomogenisator, um die Oberseite der infizierten Hornhaut zu schieren. Das Gewebe muss nicht vollständig liquidiert werden. Der Homogenisator hilft, Bakterien vom Hornhautepithel und dem Schnittbereich zu lösen.
7. Wirbeln Sie die Hornhaut in PBS für ein paar Sekunden, um den Inhalt zu mischen.
8. Fügen Sie 20 l des Homogenats auf 180 l PBS hinzu und führen Sie serielle Verdünnungen in einer 96-Well-Platte durch.
9. Die Suspension wird seriell auf 10^-4 und 10^-5 Verdünnung und Pipette 10 l des verdünnten Homogenats mit Bakterien auf eine Blutagarplatte verdünnt. Inkubieren Sie die Platte für 8 Stunden und zählen Sie die Anzahl der KBE. Bei der Prüfung der Wirkung antimikrobieller Mittel muss der entsprechende Verdünnungsfaktor experimentell gefunden werden.

Das Design der Glasformen ist eine innovative und originelle Idee, deren Verwendung es uns ermöglichte, das Modell in konsistenter Weise mit minimalen/keinen Problemen mit Verunreinigungen einzurichten. Die Formen wurden von einem Glasgebläse an der University of Sheffield auf der Grundlage eines Entwurfs(Abbildung 1A) hergestellt. Das Versuchsaufbau behält die konvexe Form der Hornhaut bei und hält Bakterien auf der Oberseite des Epithels, wo die Infektion stattfindet (Abbildung 1B).

Porcine Corneas in der Regel nach wenigen Tagen in mittel anschwellen. Dies ist normal und wir fanden heraus, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen Hornhäuten mit und ohne Zugabe von Dextran gab, der in der Regel hinzugefügt wird, um eine Schwellung der Hornhaut zu verhindern (Abbildung 1H). Die Hornhäuten sind in der Regel verwundet, um den Bakterien zu helfen, das Epithel zu durchdringen. Obwohl es keinen signifikanten Unterschied im Verlauf der Infektion zwischen verwundeten (schnitt) und unverwundeten (ungeschnittenen) Hornhäuten gab, stellten wir weitere Unterschiede zwischen den Replikationen in ungeschnittenen Hornhäuten fest (Abbildung 1C). Wenn die Hornhäuten zweimal mit PBS gewaschen werden, werden überschüssige Bakterien entfernt, die sich nicht am Epithel anheften. Es gab einen signifikanten Unterschied in der KBE zwischen gewaschenen und ungewaschenen Schweinehornhäuten, die 24 Stunden lang mit P. aeruginosa PAO1 infiziert waren(Abbildung 1D). Es gab keinen signifikanten Unterschied bei den KBE-Zahlen zwischen Schweinen und Kaninchenhornhäuten, die mit PA14 und PAO1 infiziert waren (Abbildung 1E,1F). Die Ergebnisse für beide Modelle waren reproduzierbar. Nach 24 Stunden entwickelt die mit dem Pseudomonas-Stamm infizierte Hornhaut immer Opazität und die Schnittfläche wird im Vergleich zur nicht infizierten Hornhaut sichtbarer und offener (Abbildung 1G).

Abbildung 1: Ex-vivo-Hornhaut mit Pseudomonas aeruginosainfiziert. (A) Schematisches Bild einer Glasform, die zur Aufrechterhaltung der Hornhautform und zur Erleichterung der Einführung von Bakterien und Behandlungen verwendet wird. Die Dicke der Glasformen beträgt 1,5 mm und entspricht der Dicke der Reagenzgläser aus Borosilikatglas. (B) Schematisches Bild des Versuchsaufbaus. (C) Prüfung der Auswirkungen der Verwundung auf die endgültige KBE-Zahl nach homogenisierung. Ungeschnittene (n = 16) und geschnittene (n = 28) Hornhäuten waren 24 Stunden lang mit P. aeruginosa PAO1 und P. aeruginosa PA14 infiziert. Die Hornhäuten wurden vor der Homogenisierung mit 1 ml PBS gewaschen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. (D) Prüfung der Wirkung des Waschens von Hornhäuten mit 2 x 1 ml PBS (n = 6) und nicht waschen (n = 6) auf die endgültige KBE-Zahl nach einer Infektion mit P. aeruginosa PAO1 für 24 Stunden. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. (E) Endgültige KBE-Zahl bei mit P. aeruginosa PAO1 und P. aeruginosa PA14 infizierten Schweinehornhäuten 24 Stunden lang (n = 10). Corneas wurden gewaschen und geschnitten. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. (F) Endgültige KBE-Anzahl bei Kaninchenhornhäasen, die mit P. aeruginosa PAO1 und P. aeruginosa PA14 für 24 Stunden infiziert sind (n = 6). Corneas wurden gewaschen und geschnitten. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. (G) Bilder von ex vivo mit P. aeruginosa PAO1 infizierten Ex-vivo-Schweinehornhäuten für 24 Stunden. Die Kontrolle wurde verwundet, aber es wurden keine Bakterien hinzugefügt. Die infizierten Hornhäuten wurden verwundet und 107 KBE wurden der Schnittseite hinzugefügt. Aus der Kontrollhornhaut wurde keine KBE geborgen. (H) Endgültige KBE nach 24 Stunden Infektion mit P. aeruginosa PAO1 von Hornhäuten, die mit Dextran behandelt wurden (n = 2) und solchen ohne Dextran (n = 9). Corneas wurden gewaschen und geschnitten. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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