Summary

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Published: June 10, 2020
doi:

Summary

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Promotor-Reporter, Live-Zell-Mikroskopie und individuelle Inklusionsextraktion in einem gerichteten vorwärts genetischen Ansatz, um Entwicklungsmutanten von Chlamydia trachomatiszu identifizieren und zu isolieren.

Abstract

Der intrazelluläre bakterielle Erreger Chlamydia trachomatis durchläuft einen Entwicklungszyklus, der aus zwei morphologisch diskreten Entwicklungsformen besteht. Der nicht-reproduzierende Elementarkörper (EB) initiiert eine Infektion des Wirts. Einmal im Inneren, unterscheidet sich der EB in den Retikulatkörper (RB). Die RB durchläuft dann mehrere Replikationsrunden, bevor sie sich wieder auf die infektiöse EB-Form unterscheidet. Dieser Zyklus ist für das Überleben der Chlamydien von entscheidender Bedeutung, da das Nichtumschalten des Wechsels zwischen Zelltypen eine Hostinvasion oder Replikation verhindert.

Einschränkungen in genetischen Techniken aufgrund der obligaten intrazellulären Natur von Chlamydien haben die Identifizierung der molekularen Mechanismen behindert, die an der Zelltypentwicklung beteiligt sind. Wir haben ein neuartiges Dual-Promoter-Reporter-Plasmidsystem entwickelt, das in Verbindung mit der Live-Zellmikroskopie die Visualisierung des Zelltypwechsels in Echtzeit ermöglicht. Um Gene zu identifizieren, die an der Regulierung der Zelltypentwicklung beteiligt sind, wurde das Live-Zell-Promotor-Reporter-System für die Entwicklung eines vorwärtsgenetischen Ansatzes genutzt, indem chemische Mutagenese des Dual-Reporter-Stamms, Bildgebung und Verfolgung von Chlamydien mit veränderter Entwicklungskinetik kombiniert wurden, gefolgt von klonaler Isolierung von Mutanten. Dieser vorwärtsgenetische Workflow ist ein flexibles Werkzeug, das für gezielte Verhöre in eine Vielzahl von genetischen Pfaden modifiziert werden kann.

Introduction

Chlamydia trachomatis (Ctr) ist ein obligate intrazellulärer Erreger, der durch einen biphasischen Entwicklungszyklus fortschreitet, der für sein Überleben und seine Proliferation wesentlich ist1. Dieser Zyklus besteht aus zwei Entwicklungsformen, dem Elementarkörper (EB) und dem Retikulatkörper (RB). Die EB ist Replikation inkompetent, aber vermittelt Zellinvasion durch Effektor induzierte Endozytose2. Einmal im Host, reift der EB zum replizierenden RB. Die RB führt mehrere Replikationsrunden durch, bevor sie wieder in die EB konvertiert, um nachfolgende Infektionsrunden zu initiieren.

Die begrenzte Palette genetischer Werkzeuge hat den größten Teil der Chlamydienforschung auf biochemische Studien oder den Einsatz von Ersatzsystemen beschränkt. Infolgedessen war die Aufklärung der Genregulation und die Kontrolle des Entwicklungszyklus schwierig3,4. Eine der wichtigeren Herausforderungen im Chlamydienfeld ist die hochauflösende zeitliche Verfolgung des Chlamydien-Entwicklungszyklus und die Identifizierung der Proteine, die an seiner Regulierung beteiligt sind. Die Genexpression während des Chlamydien-Entwicklungszyklus wurde traditionell mit destruktiven “Endpunkt”-Methoden wie RNAseq, qPCR und fester Zellmikroskopie5,6durchgeführt. Obwohl diese Methoden unschätzbare Informationen geliefert haben, sind die angewandten Techniken mühsam und haben eine geringe zeitliche Auflösung5,6.

Innerhalb des letzten Jahrzehnts hat die genetische Manipulation von Ctr mit der Einführung der Plasmidtransformation und Methoden zur Mutagenese7,8,9Fortschritte gemacht. Für diese Studie wurde ein Plasmid-basiertes System entwickelt, um die Chlamydienentwicklung bei einzelnen Einschlüssen in Echtzeit im Verlauf einer Infektion zu überwachen. Es wurde ein Chlamydien-Transformant erstellt, das sowohl einen RB- als auch einen EB-Zell-spezifischen Promoter-Reporter ausdrückte. Der RB-spezifische Reporter wurde durch Dieminierung des Promotors des frühen RB-Gens euo vor dem fluoreszierenden Protein Clover konstruiert. EUO ist ein Transkriptionsregulator, der eine Teilmenge der späten EB-assoziierten Gene10unterdrückt. Der Promotor von hctB, der ein Histon-ähnliches Protein kodiert, das an der EB-Nukleoidkondensation beteiligt ist, wurde direkt vor mKate2 (RFP) geklont, um den EB-spezifischen Reporter11zu erstellen. Das Rückgrat für hctBprom-mKate2/euoprom-Clover war p2TK2SW27. Die hctB- und euo-Promotoren wurden aus der genomischen DNA von Ctr-L2 verstärkt. Jede Promotorsequenz bestand aus 100 Basenpaaren vor dem vorhergesagten Transkriptionsstartort für das angegebene Chlamydasid-Gen plus den ersten 30 Nukleotid (10 Aminosäuren) des jeweiligen ORF. Die fluoreszierenden FP-Varianten wurden kommerziell als Ctr-Codon-optimierte Genblöcke erhalten und im Rahmen mit den ersten 30 Nukleotiden jedes Chlamydengens und Promotors geklont. Der incD-Terminator wurde direkt flussabwärts von mKate2 geklont. Der zweite Promoter-Reporter wurde flussabwärts des IncD-Terminators eingesetzt. Das Ampicillinresistenzgen (bla) in p2TK2SW2 wurde durch das AadA-Gen (Spectinomycin-Resistenz) von pBam4 ersetzt. Dies führte zum endgültigen Konstrukt p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Abbildung 1A), das in Ctr-L27umgewandelt wurde. Dieser RB/EB-Reporterstamm ermöglichte die Beobachtung des Entwicklungszyklus innerhalb einzelner Einschlüsse mittels Live-Zellmikroskopie (Abbildung 1B,C).

Unter Verwendung unseres Promoter-Reporter-Konstrukts in Kombination mit chemischer Mutagenese wurde ein Protokoll entwickelt, um einzelne Klone zu verfolgen und zu isolieren, die Entwicklungsanomalien aus mutagenisierten Populationen von Ctr serovar L2 aufwiesen. Dieses Protokoll ermöglicht die direkte Überwachung einzelner Chlamydieneinschlüsse, die Verfolgung der Genexpressionsprofile im Laufe der Zeit, die Identifizierung von Chlamydienklonen, die ein verändertes Entwicklungsgenexpressionsmuster exprimieren, und die klonale Isolierung von Chlamydien von einzelnen Einschlüssen.

Obwohl dieses Protokoll speziell für die Identifizierung von Genen erstellt wurde, die an der Entwicklung von Chlamyden beteiligt sind, könnte es leicht angepasst werden, um eine beliebige Anzahl von Chlamydien-Genwegen zu hinterfragen.

Protocol

Alle in diesem Protokoll verwendeten Python-Skripte sind auf Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing 1. Mutagenize Reporter Chlamydia HINWEIS: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs wurden direkt mit Ethylmethansulfonat (EMS) in den axtischen Medien CIP-1 mutagenisiert, da dieses Medium den EB-Stoffwechsel und die Aufrechterhaltung der EB-Infektion12unterstützt. Einen Chlamydie…

Representative Results

Die direkte EMS-Mutagenese unseres Promotor-Reporters-Chlamydienstamms führte zu einer Verringerung der Infektiosität um 75 %. Mit Hilfe des beschriebenen Live-Zell-Bildgebungsprotokolls wurden 600 Einschlüsse über einen Zeitraum von 24 h abgebildet und nachverfolgt. Die fluoreszierende Ausdruckskinetik beider Reporter in jeder Einschlussaufnahme wurde mithilfe benutzerdefinierter Python-Notebook-Skripte visualisiert. Zwei Visualisierungsansätze wurden implementiert, um kandidaten mutagenisierte Chlamydien …

Discussion

Die Zersebung der Mechanismen, die den Chlamydien-Entwicklungszyklus steuern, wurde durch die Einschränkungen der derzeit verfügbaren genetischen Werkzeuge behindert. Mit unserem Promoter-Reporter Chlamydia in Verbindung mit der automatisierten Live-Zell-Mikroskopie wurde ein System entwickelt, das die Überwachung der Zelltypentwicklung bei einzelnen Einschlüssen über einen Zeitraum von 24 stunden ermöglicht. Dieses System hat in Kombination mit chemischer Mutagenese und direkter Inklusionsisolierung eine …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Anders Omsland von der Washington State University für die Versorgung der CIP-1 axenic Medien. Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium R01AI130072, R21AI135691 und R21AI113617 unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde durch Start-up-Fonds der University of Idaho und des Center for Modeling Complex Interactions durch ihr NIH-Stipendium P20GM104420 bereitgestellt.

Materials

24-well polystyrene plates Corning 3524 Cell culture growth for reinfection of isolates
6-well glass bottom plates Cellvis P06-1.5H-N Cell culture growth for imaging
96-well glass bottom plates Nunc 165305 Cell culture growth for imaging
Bold line CO2 Unit OKO Labs CO2 UNIT BL Stage incubator CO2 control
Bold line T Unit OKO Labs H301-T-UNIT-BL-PLUS Stage incubator temperature control
Borosilicate glass capillary tubes Sutter Instrument B1005010 Capillary tubes
BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) Semrock FF01-514/30-25 Fluoescent filter cube
BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) Semrock FF02-641/75-25 Fluoescent filter cube
CellTram Vario Eppendorf 5196000030 Microinjector
Chlamydia trachmatis serovar L2 ATCC VR-577 Chlamydia trachomatis
CIP-1 media In house NA Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5
mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and
CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house.
Cos-7 cells (ATCC) ATCC CRL-1651 African green monkey kidney cell (host cells)
Cycloheximide MP Biomedicals 194527 Host cell growth inhibitor
Ethyl methanesulfonate, 99% Acros Organics AC205260100 Mutagen
Fetal Plex Gemini Bio-Products 100-602 Supplement for base growth media
Fiji/ImageJ https://imagej.net/Fiji NA Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S CO2 incubator Eppendorf CO1700100X Cell culture incubation
gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) Integrated DNA Technologies NA gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2
Gentamycin 10mg/ml Gibco 15710-064 Antibiotic for growth media
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Corning 21-020-CM Host cells rinse
Heparin sodium Amersham Life Science 16920 inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs
HEPES 1M GE Life Sciences SH30237.01 pH buffer for growth media
InjectMan Eppendorf 5179 000.018 Micromanipulator
Jupyter Notebook https://jupyter.org/ NA Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/
Lambda 10-3 Sutter Instrument LB10-3 Filter wheel controler
Oko Touch OKO Labs Oko Touch Interface to control the Bold line T and CO2 Unit
Prior XY stage Prior H107 Motorized XY microscope stage
PrismR Centrifuge Labnet C2500-R Temperature controlled microcentrifuge
Problot Hybridization oven Labnet H1200A Rocking Incubator for infection with Chlamydia
Proscan II Prior H30V4 XYZ microscope stage controler
Purifier Class 2 Biosafety Cabinet Labconco 362804 Cell culture work
RPMI-1640 (no phenol red) Gibco 11835-030 Base growth media for imaging
RPMI-1640 (phenol red) GE Life Sciences SH30027.01 Base growth media
scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) scopeLED F140 Excitation light
Sonic Dismembrator Model 500 Fisher Scientific 15-338-550 Sonicator, resuspending chlamydial pellet
Stage incubator OKO Labs H301-K-FRAME Cluster well plate incubation chamber
sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) In house NA Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4)
T-75 Flasks Thermo Scientific 156499 Cell culture growth
TE 300 inverted microscope Nikon 16724 microscope
THOR LED Thor Labs LEDD1B White light
Trypsin Corning 25-052-CI Dislodges host cells from flask for seeding into plates
Zyla sCMOS Andor ZYLA-5.5-USB3 imaging camera
µManager 2.0gamma https://github.com/micro-manager/micro-manager NA Open sourse automated microscope control software package

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (160), e61365, doi:10.3791/61365 (2020).

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