Summary

Abgabe von Antikörpern in das Gehirn mittels fokussiertem Scanning-Ultraschall

Published: July 18, 2020
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Summary

Hier wird ein Protokoll zur vorübergehenden Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) entweder fokal oder in einem Mausgehirn vorgestellt, um fluoreszenzmarkierte Antikörper zu liefern und Mikroglia zu aktivieren. Ebenfalls vorgestellt wird eine Methode zum Nachweis der Abgabe von Antikörpern und der Aktivierung von Mikroglia durch die Histologie.

Abstract

Nur ein kleiner Teil der therapeutischen Antikörper, die auf Hirnerkrankungen abzielen, wird vom Gehirn aufgenommen. Fokussierter Ultraschall bietet die Möglichkeit, die Aufnahme von Antikörpern und das Engagement durch vorübergehende Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu erhöhen. In unserem Labor entwickeln wir Therapieansätze für neurodegenerative Erkrankungen, bei denen ein Antikörper in verschiedenen Formaten mittels Mikrobläschen über die BHS abgegeben wird, begleitet von einer fokussierten Ultraschallanwendung durch den Schädel, der auf mehrere Stellen abzielt, ein Ansatz, den wir als Scanning-Ultraschall (SUS) bezeichnen. Die mechanische Wirkung von Mikroblasen und Ultraschall auf Blutgefäße erhöht den parazellulären Transport über die BHS, indem sie Tight Junctions vorübergehend trennt und die vesikelvermittelte Transzytose verbessert, so dass Antikörper und Therapeutika effektiv kreuzen können. Darüber hinaus erleichtert Ultraschall auch die Aufnahme von Antikörpern aus dem interstitiellen Gehirn in Gehirnzellen wie Neuronen, in denen sich der Antikörper im gesamten Zellkörper und sogar in neuritische Prozesse verteilt. In unseren Studien werden fluoreszierend markierte Antikörper hergestellt, mit intern hergestellten lipidbasierten Mikroblasen gemischt und in Mäuse injiziert, unmittelbar bevor SUS auf das Gehirn aufgetragen wird. Anschließend wird die erhöhte Antikörperkonzentration im Gehirn quantifiziert. Um Veränderungen in der normalen Homöostase des Gehirns zu berücksichtigen, kann die Mikroglia-Phagozytose als zellulärer Marker verwendet werden. Die generierten Daten deuten darauf hin, dass die Ultraschallabgabe von Antikörpern ein attraktiver Ansatz zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen ist.

Introduction

Therapeutischer Ultraschall ist eine aufstrebende Technologie, die darauf abzielt, Hirnerkrankungen auf nichtinvasive Weise zu behandeln, zum Teil durch Erleichterung des Zugangs von Therapeutika zum Gehirn1,2,3. Da nur ein kleiner Teil der therapeutischen Antikörper, die auf Hirnerkrankungen abzielen, vom Gehirn aufgenommen und im Gehirn zurückgehalten werden4, bietet therapeutischer Ultraschall die Möglichkeit, ihre Aufnahme und ihr gezieltes Engagement zu erhöhen5,6.

In unserem Labor entwickeln wir Therapieansätze für neurodegenerative Erkrankungen, bei denen ein Antikörper in verschiedenen Formaten mittels Mikrobläschen über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) abgegeben wird. Um dies zu erreichen, wird Ultraschall durch den Schädel an mehreren Stellen in das Gehirn angewendet, wobei ein Scanning-Modus verwendet wird, den wir als Scanning-Ultraschall (SUS) bezeichnen7. Die mechanische Wechselwirkung zwischen der Ultraschallenergie, den intravenös injizierten Mikrobläschen und dem Gefäßsystem des Gehirns trennt vorübergehend die Engstellen der BHS in einem gegebenen Beschallungsvolumen, so dass Antikörper und andere Ladungen, einschließlich therapeutischer Wirkstoffe, diese Barriere effektiv überwinden können7,8,9 . Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Ultraschall die Aufnahme von Antikörpern aus dem interstitiellen Gehirn in Gehirnzellen wie Neuronen erleichtert, wo sich der Antikörper im gesamten Zellkörper und sogar in neuritischen Prozessen verteilt5,10.

Die Alzheimer-Krankheit ist durch eine Amyloid-β- und Tau-Pathologie gekennzeichnet11, und eine Vielzahl von Tiermodellen steht zur Verfügung, um pathogene Mechanismen zu sezieren und therapeutische Strategien zu validieren. Ein SUS-Ansatz, bei dem Ultraschall in einem sequentiellen Muster über das gesamte Gehirn angewendet wird, kann, wenn er über mehrere Behandlungssitzungen wiederholt wird, die Amyloid-Plaque-Pathologie im Gehirn von Amyloid-β-ablagernden Amyloid-Vorläuferprotein-mutierten Mäusen (APP) reduzieren und Mikroglia aktivieren, die das Amyloid aufnehmen, was zu einer Verbesserung der kognitiven Funktion führt7. Die BBB-Öffnung mit Ultraschall und Mikroblasen reduziert auch die Tau-Pathologie bei pR5, K3 und rTg4510 tau-transgenen Mäusen5,12,13. Während Mikroglia extrazelluläre Proteinablagerungen entfernen, ist einer der zugrunde liegenden Clearance-Mechanismen für intraneuronale Pathologien, die durch SUS induziert werden, die Aktivierung der neuronalen Autophagie12.

Hier skizzieren wir einen experimentellen Prozess, bei dem fluoreszierend markierte Antikörper hergestellt und dann mit hauseigenen lipidbasierten Mikrobläschen gemischt werden, gefolgt von einer retroorbitalen Injektion in anästhesierte Mäuse. Die retroorbitale Injektion ist eine Alternative zur Schwanzveneninjektion, die sich als ebenso wirksam und einfacher erwiesen hat, wiederholt durchzuführen. Unmittelbar danach wird SUS auf das Gehirn angewendet. Um die therapeutische Antikörperaufnahme zu bestimmen, werden Mäuse geopfert und die erhöhte Antikörperkonzentration im Gehirn anschließend quantifiziert. Als Stellvertreter für die Veränderung der Homöostase des Gehirns wird die mikrogliale phagozytäre Aktivität durch Histologie und volumetrische 3D-Rekonstruktion bestimmt.

Die generierten Daten deuten darauf hin, dass die Ultraschallabgabe von Antikörpern ein potenziell attraktiver Ansatz zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen ist. Das Protokoll kann in ähnlicher Weise auf andere Arzneimittelkandidaten sowie auf Modellladungen wie fluoreszierend markiertes Dextrans definierter Größen angewendet werden14.

Protocol

Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der University of Queensland genehmigt. 1. Eigene Mikroblasenaufbereitung Wiegen Sie ein 9:1 molares Verhältnis von 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino(Polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz) ab. Pro 1 ml Mikroblasenlösung werden 0,5 mg Lipidmischung benötigt. Alternativ können Lipide bereits in Chloroform gekauft werden, wenn mit vorgelösten Lipiden mit Schritt…

Representative Results

Mit diesem Protokoll werden fluoreszenzmarkierte Antikörper an das Gehirn abgegeben und können zusammen mit der Mikroglia-Aktivierung nachgewiesen werden. Die Schlussfolgerung, die gezogen werden kann, ist, dass die Verwendung von fokussiertem Ultraschall und Mikroblasen die Aufnahme von Antikörpern im Gehirn deutlich verbessert und Antikörper an das gesamte Gehirn oder die Hemisphäre einer Maus abgeben kann, wenn sie in einem Scanning-Modus verwendet wird. Abbildung 1 zeigt das TIPS-Ul…

Discussion

Fluoreszenzmarkierte Antikörper können mit fokussiertem Ultraschall zusammen mit Mikrobläschen, die in einem Scanning-Modus angewendet werden, an das Gehirn abgegeben werden. Antikörperabgabe, Mikrogliamorphologie und lysosomale Vergrößerung können durch Fluoreszenzmikroskopie nach Rasterultraschall nachgewiesen werden. Mikroglia können in ihren Lysosomen Antikörper und Antigene aufnehmen, an die die Antikörper in einem Fc-Rezeptor-vermittelten Prozess gebunden sind4.

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken der Unterstützung durch den Nachlass von Dr. Clem Jones AO, dem National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], der Metal Foundation und der Regierung des Bundesstaates Queensland (DSITI, Department of Science, Information Technology and Innovation).

Materials

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti 850365C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] Avanti 880128C
AlexaFluor 647 antibody labeling kit Thermo Fisher A20186
CD68 antibody AbD Serotec MCA1957GA Use 1:1000 dilution
Chloroform Sigma-Aldrich 372978
Coulter Counter (Multisizer 4e)
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Thermo FIsher A-11008 Use 1:500 dilution
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-11077 Use 1:500 dilution
head holder (model SG-4N, Narishige Japan)
Iba1 antibody Wako 019-19741 Use 1:1000 dilution
Image analysis software Beckman Coulter #8547008
Isoflow flow solution Beckman Coulter B43905
Near infrared imaging system Odyssey Fc Licor 2800-03
Octafluoropropane Arcadophta 0229NC
Propylene Glycol Sigma-Aldrich P4347
TIPS (Therapy Imaging Probe System) Philips Research TIPS_007
Bitplane

Referenzen

  1. Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer’s double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
  2. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
  3. Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
  4. Golde, T. E. Open questions for Alzheimer’s disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
  5. Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
  6. Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
  7. Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
  8. Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
  9. Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
  10. Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases – current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
  11. Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. Molecular Pathogenesis of the Tauopathies. Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).
  12. Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
  13. Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
  14. Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).

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Diesen Artikel zitieren
Leinenga, G., Bodea, L., Koh, W. K., Nisbet, R. M., Götz, J. Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound. J. Vis. Exp. (161), e61372, doi:10.3791/61372 (2020).

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