Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Weißes Fettgewebe (WAT) stellt die Hauptstelle für die Energiespeicherung bei Säugetieren dar. In diesem Gewebe speichern Adipozyten oder "Fettzellen" überschüssige Kalorien in Form von Triglyceriden, die in großen unilokulären Lipidtröpfchen verpackt sind. Darüber hinaus sezernieren Adipozyten eine Vielzahl von Faktoren, die verschiedene Aspekte der Energiehomöostase regulieren ^1,2,3. Adipozyten machen den Großteil des WAT-Volumens aus; Adipozyten machen jedoch nur weniger als 50 % der Gesamtzellen aus, die in WAT ^4,5 gefunden werden. Das nicht-adipozyten-Kompartiment der WAT oder stromal-vaskulären Fraktion (SVF) ist recht heterogen und enthält vaskuläre Endothelzellen, geweberesidente Immunzellen, Fibroblasten und Adipozyten-Vorläuferzellpopulationen (APC).

WAT ist außergewöhnlich in seiner bemerkenswerten Fähigkeit, mit steigender Nachfrage nach Energiespeichern zu expandieren. Die Aufrechterhaltung dieser Gewebeplastizität ist von entscheidender Bedeutung, da eine angemessene Speicherung von Lipiden in WAT vor schädlicher ektopischer Lipidablagerung in Nicht-Fettgewebe schützt⁶. Die Art und Weise, wie die einzelnen WAT-Depots diese Expansion als Reaktion auf einen Kalorienüberschuss erfahren, ist eine kritische Determinante für die Insulinsensitivität bei Fettleibigkeit⁷. Die pathologische WAT-Expansion, die bei adipösen Personen mit metabolischem Syndrom beobachtet wird, ist durch eine bevorzugte Expansion der viszeralen WAT-Depots auf Kosten des metabolisch günstigen subkutanen Fettgewebes gekennzeichnet. Darüber hinaus ist die Insulinresistenz bei Adipositas mit einem pathologischen Umbau der WAT verbunden. Dies ist gekennzeichnet durch hypertrophes Wachstum der vorhandenen Adipozyten (Vergrößerung), unzureichende Angiogenese, chronische metabolische Entzündung, Akkumulation extrazellulärer Matrixkomponenten (Fibrose) und Gewebehypoxie ^8,9. Diese WAT-Phänotypen der Adipositas sind mit Lebersteatose und Insulinresistenz verbunden, ähnlich wie bei der Lipodystrophie (Fehlen einer funktionellen WAT). Im Gegensatz dazu wird eine gesunde WAT-Expansion in der metabolisch gesunden adipösen Population beobachtet und ist durch eine bevorzugte Expansion der protektiven subkutanen WAT und eine Depotexpansion durch Adipozytenhyperplasie gekennzeichnet¹⁰. Die Rekrutierung neuer Adipozyten wird durch die De-novo-Differenzierung von Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) (als "Adipogenese" bezeichnet) vermittelt. Die Adipozytenhyperplasie fällt mit einem relativ niedrigeren Grad der WAT-Fibrose und der metabolischen Entzündung zusammen ^6,11. Eine Vielzahl von Zelltypen innerhalb der WAT-Mikroumgebung beeinflussen direkt die Gesundheit und Erweiterbarkeit von WAT bei Adipositas¹². Daher hat die Definition der Funktion der verschiedenen Zelltypen, die in WAT vorhanden sind, nach wie vor eine hohe Priorität für das Feld.

In den letzten zehn Jahren wurden verschiedene Strategien eingesetzt, um native APCs aus Mensch und Maus zu definieren und zu isolieren WAT^{SVF 13}. Bei solchen Strategien werden APCs basierend auf der Zelloberflächenexpression gemeinsamer mesenchymaler Stamm-/Vorläuferzellmarker unter Verwendung von Antikörper-basierten Zelltrennungstechniken isoliert. Zu diesen Ansätzen gehören die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit fluorophormarkierten Antikörpern oder die immunomagnetische Bead-Trennung (d. h. chemisch modifizierte Antikörper). Zu den Zelloberflächenproteinen, die für die Isolierung von APCs vorgesehen sind, gehören PDGFRα, PDGFRβ, CD34 und SCA-1. Diese Ansätze haben dazu beigetragen, APCs zu bereichern; Die Zellpopulationen, die auf der Grundlage dieser Marker isoliert werden, sind jedoch recht heterogen. Jüngste Einzelzell-RNA-Sequenzierungsstudien (scRNA-seq) haben die molekulare und funktionelle Heterogenität von Stromazellen innerhalb der isolierten stromal-vaskulären Fraktion (SVF) der murinen WAT 14,15,16,17 hervorgehoben. Aus unseren eigenen scRNA-seq- und funktionellen Analysen haben wir funktionell unterschiedliche immunmodulierende und adipogene PDGFRβ+ perivaskuläre Zellsubpopulationen im stromalen Kompartiment von intraabdominalen WAT bei adulten Mäusen identifiziert und charakterisiert¹⁵. Fibroinflammatorische Vorläufer (FIPs) stellen eine prominente Subpopulation von PDGFRβ+-Zellen dar und können auf der Grundlage der LY6C-Expression (LY6C+ PDGFRβ+-Zellen) isoliert ^werden15. FIPs fehlt es an adipogener Kapazität, sie üben eine starke entzündungsfördernde Reaktion auf verschiedene Reize aus, produzieren Kollagen und sezernieren anti-adipogene Faktoren¹⁵. Die proinflammatorische und fibrogene Aktivität dieser Zellen nimmt in Verbindung mit Fettleibigkeit bei Mäusen zu, was diese Zellen als Regulatoren des WAT-Umbaus impliziert. Die LY6C-CD9-PDGFRβ+-Subpopulation repräsentiert Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs). Diese APCs sind in der Expression von Pparg und anderen pro-adipogenen Genen angereichert und differenzieren sich in vitro und in vivo leicht zu reifen^{Adipozyten 15}. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung dieser unterschiedlichen Zellpopulationen aus intraabdominalen WAT-Depots adulter Mäuse unter Verwendung von FACS und die immunmagnetische Bead-Trennung mit biotinylierten Antikörpern zur Verfügung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um funktionell unterschiedliche Fettvorläufer-Subpopulationen aus mehreren intraabdominalen WAT-Depots von adulten männlichen und weiblichen Mäusen zu isolieren¹⁵. Die isolierte Untersuchung dieser funktionell unterschiedlichen Zellpopulationen kann wesentlich zu unserem aktuellen Verständnis der molekularen Mechanismen beitragen, die die Adipogenese und den Umbau des intraabdominalen Fettgewebes bei Gesundheit und Krankheit regulieren.

Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung von adipösen Vorläuferzellen aus murinen Nebenhoden-WAT; Das gleiche Verfahren kann jedoch verwendet werden, um entsprechende Zellen aus dem mesenterialen und retroperitonealen WAT-Depot sowohl männlicher als auch weiblicher Mäuse zu isolieren¹⁵. Ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung und Isolierung dieser Depots bei Mäusen findet sich in Bagchi et ^al.18. Dieses Protokoll wurde für die Verwendung von Mäusen im Alter von 6-8 Wochen optimiert. Die Häufigkeit und Differenzierungsfähigkeit von APCs kann im Zusammenhang mit dem Altern abnehmen.

Alle Tierprotokolle und -verfahren wurden vom Institutional Animal Use and Care Committee des Southwestern Medical Center der University of Texas genehmigt.

1. Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus gonadalem weißem Fettgewebe

1. Präparieren Sie das gonadale weiße Fettgewebe von 6-8 Wochen alten Mäusen und legen Sie die Fettpolster in 1x PBS-Lösung.
2. Kombinieren Sie bis zu 4 Fettdepots (2-4 Depots von 1-2 Mäusen empfohlen) und zerkleinern Sie das Gewebe in einem 10 mL Becherglas mit 200 μl Verdauungspuffer (1x HBSS, 1,5% BSA und 1 mg/mL Kollagenase D).
3. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 mL Verdauungspuffer.
4. Die Mischung bei 37 °C im Wasserbad 1 h lang unter Schütteln inkubieren.
5. Filtern Sie das verdaute Gewebe durch ein 100 μm Zellsieb, um unverdautes Gewebe zu entfernen.
6. Die filtrierte Probe mit PBS mit 2 % FBS auf 30 mL verdünnen und 5 min bei 4 °C bei 600 x g zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand, der reife Adipozyten enthält.
7. Fahren Sie sofort mit der bevorzugten Zellisolationsmethode fort.

2. Isolierung von APCs und FIPs mittels FACS

1. Lösen Sie das Pellet in 1 mL 1x RBC-Lysepuffer auf, indem Sie das Röhrchen leicht schütteln.
2. 1-2 min bei RT inkubieren.
3. 10 ml 2 % FBS/PBS zugeben und durch ein 40-μm-Zellsieb in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben.
4. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.
5. Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Pellet in 400-800 μl 2 % FBS/PBS, das den Fc-Block (1:200) enthält.
6. Bei 4 °C 10 min inkubieren.
7. Übertragen Sie 400 μl bis 800 μl Zellsuspensionen mit ≤10⁶ Zellen pro ml auf 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie Antikörper hinzu. Die Antikörperkonzentrationen sind im Abschnitt Materialtabelle aufgeführt.
   1. Bereiten Sie separate Kontrollröhrchen für 1) ungefärbte Zellen, 2) einfarbige Kontrollen und 3) FMO-Kontrollen (Fluoreszenz minus eins) vor.
   2. Färben Sie die Proben mit PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C Antikörpern.
8. Bei 4 °C 15 min lichtgeschützt inkubieren.
9. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.
10. Medien aspirieren und Zellen in 400 μl 2 % FBS/PBS resuspendieren.
11. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.
12. Aspirieren Sie Medien und resuspendieren Sie die Zellen in 400-800 μl mit 2 % FBS/PBS. Führen Sie sie dann durch 40 μm Filterkappen in 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen für FACS.
13. Führen Sie die folgenden Schritte für das Gating aus.
    1. Verwenden Sie fleckenfreie und einfarbige Regler zur Kompensation.
    2. Verwenden Sie FMO-Steuerelemente, um experimentelle Gatter festzulegen.
    3. Verwenden Sie die in Abbildung 1 gezeigte Gating-Strategie, um APCs und FIPs zu erhalten. Gate APCs als CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C^- CD9^- und FIPs als CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C⁺ Zellen.
14. Sammeln Sie sortierte Zellen in Röhrchen mit 500 μl 100 % Serum und halten Sie die Zellen auf Eis.
15. Zellen bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Fügen Sie 2% FBS/PBS hinzu, um die Zellen zu waschen, indem Sie erneut bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, verwenden Sie die pelletierten Zellen.
16. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in dem entsprechenden Volumen des gonadalen APC-Kulturmediums (für die Zellkultur) oder einem geeigneten Puffer für die anschließende Analyse.

3. Immunomagnetische Trennung von adipogenen und nicht-adipogenen Fraktionen

1. Isolieren Sie SVF aus gonadalem weißem Fettgewebe gemäß den Schritten 1.1-1.7.
2. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das SVF-Pellet in 10 mL 1x handelsüblichem MS-Puffer.
3. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb.
4. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.
5. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 100 μl 1x MS-Puffer.
6. Führen Sie die CD31⁺ - und CD45⁺ -Zelldepletion wie unten beschrieben durch (Abbildung 2A, Schritt 1). Dies geschieht, um endotheliale und hämatopoetische Zellen zu entfernen.
   1. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und stellen Sie die Konzentration auf ≤ 1 x 10⁸ Zellen/ml ein.
   2. Die Biotin-konjugierten CD31- und CD45-Antikörper in der Zellsuspension jeweils in einer Konzentration von ≤ 0,25 μg pro 10⁶ Zellen zugeben und 15 min auf Eis inkubieren.
   3. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 4 mL 1x MS Puffer.
   4. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.
   5. Den Überstand aspirieren und das Pellet mit 100 μl 1x MS-Puffer resuspendieren.
   6. Fügen Sie 10 μl Streptavidin-Nanokügelchen hinzu und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis.
   7. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 4 mL 1x MS-Puffer.
   8. Bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, dann den Überstand ansaugen.
   9. Die Zellen werden in 2,5 mL 1x MS-Puffer resuspendiert und in ein 5 mL Polypropylen-Röhrchen überführt.
   10. Legen Sie das Rohr für 5 Minuten in das Magnetgestell.
   11. Sammeln Sie unmarkierte Zellen, indem Sie die Zellsuspension in ein sauberes 15-ml-Zentrifugenröhrchen gießen.
       HINWEIS: Vermeiden Sie das Schütteln oder Abtupfen von hängenden Tröpfchen, da dies zu einer Kontamination durch unerwünschte Zellfraktionen führt.
   12. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten und wiederholen Sie die Schritte 3.6.9. bis 3.6.11. Zwei weitere Male für insgesamt 3 Wäschen.
7. Trennung von adipogenen und nicht-adipogenen Fraktionen (Abbildung 2A, Schritt 2)
   1. Arbeiten Sie weiter mit der unmarkierten Fraktion (z. B. CD45-CD31-Fraktion).
   2. Das 15-ml-Röhrchen mit den unmarkierten Zellen wird 5 Minuten lang bei 4 °C bei 600 x g zentrifugiert.
   3. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl 1x MS-Puffer.
   4. Biotin-konjugierte LY6C- bzw. CD9-Antikörper in einer Konzentration von ≤ 0,25 μg pro 10⁶ Zellen zugeben und 15 min auf Eis inkubieren.
   5. Führen Sie die Schritte 3.6.3 aus. bis 3.6.12. , um die zweite Trennung abzuschließen.
   6. Sammeln Sie ungebundene Fraktionen. Unmarkierte Zellen (LY6C-CD9^-) stellen eine adipogene Fraktion dar, die APCs enthält (Abbildung 2A, Schritt 3).
   7. Röhrchen aus dem Magneten nehmen, gebundene Zellen resuspendieren und in 1x MS-Puffer eluieren. Eluate oder markierte Fraktion (LY6C⁺ CD9⁺) stellt eine nicht-adipogene Fraktion dar, die FIPs enthält (Abbildung 2A, Schritt 3).
   8. Zentrifugieren Sie markierte und unmarkierte Fraktionen bei 600 x g für 5 min und pelletieren Sie die Zellen bei 4 °C.
8. Fahren Sie sofort mit der Zellkultur fort (Schritt 6) oder verwenden Sie undifferenzierte Vorläufer für bevorzugte Analysen (Schritt 4 und/oder Schritt 5).

4. Bewertung der Reinheit von adipogenen und nicht-adipogenen Fraktionen durch Durchflusszytometrie

1. Resuspendieren Sie bead-isolierte Zellfraktionen in 200-400 μl 2 % FBS/PBS mit Fc-Block (1:200).
2. Bei 4 °C 10 min inkubieren.
3. Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie Antikörper hinzu. Die Antikörperkonzentrationen sind in der Materialtabelle aufgeführt.
   1. Bereiten Sie separate Kontrollröhrchen für 1) ungefärbte Zellen, 2) einfarbige Kontrollen und 3) FMO-Kontrollen vor.
   2. Fügen Sie den Proben CD45-, CD31-, CD9- und LY6C-Antikörper hinzu.
4. Bei 4 °C 15 min lichtgeschützt inkubieren.
5. Bei 600 x g 5 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.
6. Überstand aspirieren und resuspendieren Sie die Zellen in 400 μl 2 % FBS/PBS.
7. Die Suspension bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
8. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 400-800 μl 2 % FBS/PBS. Filtern Sie durch 40 μm Filterkappen in 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen für die Analyse durch Durchflusszytometrie.
9. Durchflusszytometrische Analyse zur Beurteilung der Reinheit
   1. Verwenden Sie fleckenfreie und einfarbige Regler zur Kompensation.
   2. Verwenden Sie FMO-Steuerelemente, um experimentelle Gatter festzulegen.
   3. Verwenden Sie die Gating-Strategie für aktive Zellen und einzelne Zellen, wie in Abbildung 2B gezeigt.
   4. Führen Sie das Gating wie in Abbildung 2B für CD45, CD31, LY6C und CD9 dargestellt durch.
   5. Verwenden Sie Durchflusszytometrie-Software, um die Häufigkeiten von CD45^-, CD31^-, LY6C^-, ^CD9-Zellen (APCs) und CD45-CD31-LY6C⁺-Zellen (FIPs) innerhalb isolierter Fraktionen zu bewerten.

5. Genexpressionsanalyse mittels quantitativer PCR zur Beurteilung der Reinheit von FIPs und APCs

1. Extrahieren Sie mRNA aus magnetisch oder FACS-isolierten Zellen mit einem handelsüblichen Extraktionskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Verwenden Sie 1 μg RNA zur Synthese von cDNA mit einem cDNA-Reverse-Transkriptase-Kit (siehe Materialtabelle), indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.
3. Bestimmung der relativen mRNA-Spiegel von APC- und FIPs-selektiven Genen (Tabelle 1) durch quantitative PCR unter Verwendung des SYBR Green PCR Master Mix.
   1. Richten Sie die Probenreaktion für die PCR wie folgt ein: 5 μl 2x SYBR grüner Farbstoff, 1 μl cDNA (~50 ng/ μL), 0,5 μl jedes Vorwärts- und Rückwärtsprimers (10 μM) und 3 μl Wasser.
   2. Verwenden Sie die folgenden Standard-PCR-Bedingungen für den quantitativen PCR-Lauf: Haltephase: 50 °C für 2 Minuten, 95 °C für 10 Minuten; PCR-Stufe (40 Zyklen): 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min.
4. Normalisieren Sie die Werte auf die Werte des Haushaltsgens (Rps18), indem Sie ΔΔ-Ct berechnen.
5. Um die statistische Signifikanz zu bewerten, führen Sie den ungepaarten Student's t-Test durch.

6. Zellkultur und Differenzierung

1. Zentrifugieren Sie magnetisch oder FACS-isolierte Zellen bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.
2. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl gonadalem APC-Kulturmedium und plattieren Sie 40 K Zellen/Well aus jeder Fraktion in einer 48-Well-Kulturplatte.
3. Ersetzen Sie das Medium alle 1-2 Tage. APCs beginnen, sich in Adipozyten zu differenzieren, wenn sie sich der Konfluenz nähern. FIPs, die in denselben Medien aufbewahrt werden, sind resistent gegen Adipogenese.

Dieses Protokoll beschreibt zwei Strategien, die die Isolierung unterschiedlicher stromaler Zellpopulationen aus intraabdominalen WAT-Depots adulter Mäuse ermöglichen. APCs und FIPs können durch FACS (Abbildung 1) oder immunmagnetische Bead-Trennung mit biotinylierten Antikörpern (Abbildung 2) isoliert werden. Bei beiden Ansätzen werden Reagenzien und Antikörper verwendet, die alle kommerziell erhältlich sind. Die immunomagnetische Kügelchentrennung führt zur Trennung von adipogenen von nicht-adipogenen Zellen aus dem gWAT SVF. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass 75% der Zellen innerhalb der adipogenen Fraktion LY6C-CD9-APCs repräsentierten. >75% der nicht-adipogenen Fraktion entfielen auf FIPs (LY6C+-Zellen).

Abbildung 1: Isolierung von PDGFR-β + Stromazell-Subpopulationen aus gonadaler WAT durch FACS. (A) Schematischer Überblick über das Verfahren: Die stromale Gefäßfraktion (Nicht-Adipozytenzellen) wurde durch enzymatische Gewebeverdauung und Zentrifugation von reifen Adipozyten getrennt. Die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) wurde dann verwendet, um endotheliale (CD31+) und hämatopoetische (CD45+) Zellen der Linie zu entfernen und LY6C+ PDGFRβ+ Zellen (FIPs) und LY6C-CD9- PDGFRβ+ Zellen (APCs) zu isolieren. (B) Repräsentative FACS-Sammelstellen. Panel A wird mit Genehmigung von Ref.11 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Trennung von adipogenen und nicht-adipogenen Stromazellen durch immunomagnetische Kügelchentrennung. (A) Schematische Übersicht über das Vorgehen: Schritt 1: CD31+ & CD45+ Zellen binden an den Magneten. Dadurch werden sowohl endotheliale als auch hämatopoetische Zellen entfernt. Die Eluate, die CD31- und CD45-Zellen enthalten, wurden gesammelt und dann mit Antikörpern inkubiert, die LY6C bzw. CD9 erkennen. Schritt 2: CD9+ und LY6C+ Zellen binden an den Magneten. Schritt 3: Der Überstand (ungebundene Fraktion), der CD9- & LY6C-Zellen enthält, wurde entnommen, da es sich um die adipogene Fraktion (APCs) handelt. Nicht-adipogene CD9+- und LY6C+-Zellen, die an Nanokugeln gebunden sind, wurden als die nicht-APC-Fraktion, die FIPs enthält, eluiert. (B) Durchflusszytometrische Analyse zur Beurteilung der Häufigkeit von APCs (LY6C-CD9-) und FIPs (LY6C+) innerhalb adipogener bzw. nicht-adipogener Fraktionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Lichtmikroskopie und Genexpressionsanalyse zeigen, dass APCs, die durch FACs oder durch magnetische Bead-Trennung von gWAT von 6-8 Wochen alten Mäusen isoliert wurden, sich innerhalb von 7-10 Tagen nach der ersten Beschichtung der Zellen in gonadalen APC-Kulturmedien zu einem hohen Grad in lipidhaltige Adipozyten differenzierten (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu blieben nicht-adipogene Vorläufer (wie z. B. fibroinflammatorische Vorläufer oder FIPs) fibroblastenartig undwurden nicht zu Adipozyten, wenn sie in denselben Kulturmedien (gonadale APC-Kulturmedien) gehalten wurden (Abbildung 3). Es sollte beachtet werden, dass nur wenige Zellen in den Nicht-APCs-Kulturen eine gewisse Lipidakkumulation zeigten (Abbildung 3D). Diese entstehen wahrscheinlich durch APC-Kontamination während der Zellisolierung. Zusätzliche Wäschen können die Reinheit dieser Fraktion verbessern.

Abbildung 3: In vitro Differenzierung von PDGFR-β + Stromazellpopulationen, die aus gWAT adulter Mäuse isoliert wurden. (A-D) Repräsentative Hellfeldbilder von differenzierten Stromazell-Subpopulationen, die durch immunomagnetische Bead-Trennung (A-B) oder FACS (C-D) aus 6-8 Wochen alten gWAT SVF der Maus isoliert wurden. Die Bilder wurden sieben Tage nach dem Plattieren von Zellen in gonadalen APC-Kulturmedien aufgenommen. Innerhalb von 7-10 Tagen nach der Beschichtung durchlaufen APCs eine spontane Adipozytendifferenzierung. Vergrößerung 10X. Skala = 250 μM. (E-F) mRNA-Spiegel von Adipozyten-selektiven Genen in differenzierten Kulturen, gezeigt in A-D. Die Balkendiagramme stellen den Mittelwert + SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: qPCR-Primer-Sequenzen, die zur Validierung der Isolierung von FIPs und APCs verwendet werden

T.A.P. ist Mitarbeiter und Anteilseigner von Novo Nordisk A/S