Summary

Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung

Published: April 29, 2021
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Summary

Hier wird ein System zur Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter , nicht lokalisierter Vibration berichtet. Dieses System ermöglicht es den Forschern, nicht lokalisierte Schwingungen mit gut kontrollierten Eigenschaften bei nanoskaliger Verschiebung hervorzurufen und Kalziumströme während der Reaktionen von C. elegans auf die Schwingungen zu quantifizieren.

Abstract

Nicht lokalisierte mechanische Kräfte wie Schwingungen und akustische Wellen beeinflussen eine Vielzahl biologischer Prozesse von der Entwicklung bis zur Homöostase. Tiere bewältigen diese Reize, indem sie ihr Verhalten ändern. Das Verständnis der Mechanismen, die einer solchen Verhaltensänderung zugrunde liegen, erfordert eine Quantifizierung der neuronalen Aktivität während des interessierenden Verhaltens. Hier berichten wir über eine Methode zur Kalziumbildgebung bei freiem Verhalten von Caenorhabditis elegans mit nicht lokalisierten Schwingungen spezifischer Frequenz, Verschiebung und Dauer. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingungen unter Verwendung eines akustischen Wandlers und die Quantifizierung evozierter Kalziumreaktionen bei Einzelzellauflösung. Als Beweis für das Prinzip wird die Calciumreaktion eines einzelnen Interneurons, AVA, während der Fluchtreaktion von C. elegans auf Vibration demonstriert. Dieses System wird das Verständnis neuronaler Mechanismen erleichtern, die Verhaltensreaktionen auf mechanische Reize zugrunde liegen.

Introduction

Tiere sind oft nicht lokalisierten mechanischen Reizen wie Vibrationen oder akustischen Wellenausgesetzt 1,2. Da diese Reize die Homöostase, Entwicklung und Fortpflanzung beeinflussen, müssen Tiere ihr Verhalten ändern, um mit ihnen fertig zu werden 3,4,5. Die neuronalen Schaltkreise und Mechanismen, die einer solchen Verhaltensänderung zugrunde liegen, sind jedoch kaum verstanden.

Mechanosensorisches Verhalten im Fadenwurz, Caenorhabditis elegans, ist ein einfaches Verhaltensparadigma, bei dem Würmer normalerweise ihr Verhalten von der Vorwärtsbewegung zu einer Rückwärtsfluchtreaktion ändern, wenn sie auf nichtlokalisierte Schwingungen stoßen6. Der neuronale Schaltkreis, der diesem Verhalten zugrunde liegt, besteht hauptsächlich aus fünf sensorischen Neuronen, vier Paaren von Interneuronen und mehreren Arten von Motoneuronen 7,8. Darüber hinaus gewöhnen sich Würmer an solche mechanischen Reize nach dem Training im Abstand mit wiederholter Stimulation 9,10,11. Daher stellt diese einfache Verhaltensreaktion ein ideales System dar, um neuronale Mechanismen zu untersuchen, die sowohl dem nicht lokalisierten Schwingungsverhalten als auch dem Gedächtnis zugrunde liegen. Ein Protokoll für die Kalziumbildgebung bei sich frei verhaltenden Würmern unter dem Einfluss von nicht lokalisierten Schwingungen wird veranschaulicht. Im Vergleich zu zuvor gemeldeten Systemen ist dieses System insofern einfach, als es keine zusätzliche Kamera für die Verfolgung benötigt. Es ermöglicht uns jedoch, die Frequenz, Verschiebung und Dauer der nicht lokalisierten Schwingung zu ändern. Da die Aktivierung der AVA-Interneuronen die Rückwärtsfluchtreaktion induziert, wurden Würmer, die GCaMP, einen Kalziumindikator, und TagRFP, ein calciuminsensitives fluoreszierendes Protein, unter der Kontrolle eines AVA-spezifischen Promotors mitexprimieren, als Beispiel verwendet (siehe Tabelle der Materialien für Details). Das Protokoll demonstriert die Aktivierung von AVA-Neuronen, wenn ein Wurm von der Vorwärts- zur Rückwärtsbewegung wechselt. Dieses Protokoll erleichtert das Verständnis des neuronalen Schaltkreismechanismus, der dem mechanosensorischen Verhalten zugrunde liegt.

Protocol

1. Kultivierung von Würmern bis zur Kalziumbildgebung Übertragen Sie vier Tage vor einem Calcium-Imaging-Experiment zwei erwachsene ST12-Würmer auf eine neue Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) -Platte (Table of Materials), auf der Escherichia coli OP50 in einem quadratischen Muster (ca. 4 mm x 4 mm) mit einem Zellstreuer gestreift sind, so dass der Wurm während der Kalziumbildgebung die meiste Zeit in den Bakterien verbringt12. Inkubieren Sie diese NG…

Representative Results

Hier wird ein Wurm, der sowohl GCaMP als auch TagRFP unter Kontrolle des AVA-Interneuron-spezifischen Promotors exprimiert, als Beispiel für die Kalziumbildgebung bei freiem Verhalten von C. elegans verwendet. GCaMP- und TagRFP-Kanaldaten wurden als eine Reihe von Bildern, von denen einige in Abbildung 6 dargestellt sind, und als Film (Supplemental Movie 1) erhalten. Die Verschiebung der Petriplatte, die durch unser nicht lokalisiertes Schwingungssystem induziert w…

Discussion

Im Allgemeinen erfordert die Quantifizierung der neuronalen Aktivität die Einführung einer Sonde und / oder Einschränkungen der Körperbewegung von Tieren. Für Studien des mechanosensorischen Verhaltens stellen jedoch die invasive Einführung einer Sonde und der Fesseln selbst mechanische Reize dar. C. elegans bietet ein System, um diese Probleme zu umgehen, weil seine Eigenschaften transparent sind und weil es einen einfachen, kompakten neuronalen Schaltkreis hat, der nur 302 Neuronen umfasst. Durch die Kom…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Stämme. Diese Veröffentlichung wurde unterstützt durch JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant Nr. JP18H02483), zu innovativen Bereichen des Projekts “Science of Soft Robot” (Förderkennzeichen JP18H05474), die PRIME der Japan Agency for Medical Research and Development (Fördernummer 19gm6110022h001) und die Shimadzu-Stiftung.

Materials

Data anaylsis software
DualViewImaging.nb author For analysis of acquired data
Mathematica12 Wolfram For running data anaysis software DualViewImaging
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314) strain Caenorhabditis Genetics Center KG1180 Light-insensitive mutant
lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter author ST12 lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays
Laser Doppler vibrometer
Lase Doppler vibrometer Polytec Japan IVS-500 For quantifying  frequency and displacement generated by the accoustic transducer
Mouse macro system
Assay.txt Autor Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows
HiMacroEx Vector https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html Free download software for controling mouse cursor based on a script
Nematode growth media plate
Agar purified, powder Nakarai tesque 01162-15 For preparation of NGM plates
Bacto pepton Becton Dickinson 211677 For preparation of NGM plates
Calcium chloride Wako 036-00485 For preparation of NGM plates
Cholesterol Wako 034-03002 For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate Nakarai tesque 28727-95 For preparation of NGM plates
LB broth, Lennox Nakarai tesque 20066-95 For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous TGI M1890 For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate Nakarai tesque 28720-65 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Nakarai tesque 31320-05 For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm) Nunc 150270 For preparation of NGM plates
Nonlocalized vibration device
Amplifier LEPY LP-A7USB For stimulation with controllable vibration
Acoustic transducer MinebeaMitsumi LVC25 For stimulation with controllable vibration
WaveGene Ver. 1.5 Thrive http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html Free download software for controling vibration property
Noninvasive calcium imaging
2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller Thorlabs BBD202 Compatible controller for MLS203-1 stages
479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter Semrock FF01-479/585-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter Semrock FF505/606-Di01-25×36 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock FF01-512/25-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter Semrock FF01-630/92-25 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)
Computer Dell Precision T7600 Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM
High-speed x-y motorized stage Thorlabs MLS203-1 Fast XY scannning stage
Image splitting optics Hamamatsu photonics A12801-01 For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics
LED light source CoolLED pE-4000 For generating 470 nm and 560 nm excitation light
Microscope Olympus MVX10
sCMOS camera Andor Zyla
x 2 Objective lens Olympus MVPLAPO2XC Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Plasmid
pKDK66 plasmid author pKDK66 Co-injection marker
pTAK83 plasmid author pTAK83 Plasmid for expression of TagRFP under the control of  the flp-18 promoter
pTAK144 plasmid author pTAK144 Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of  the flp-18 promoter
Tracking software
homingback.vi author SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage
LabVIEW National instruments For running tracking software
Zyla Control ver.2.6CI.vi author For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Shigyou, K., Maeoka, H., Igarashi, R., Sugi, T. Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration. J. Vis. Exp. (170), e61626, doi:10.3791/61626 (2021).

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