Summary

Genetischer Variantennachweis im CALR-Gen mittels hochauflösender Schmelzanalyse

Published: August 26, 2020
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Summary

Die hochauflösende Schmelzanalyse (HRM) ist eine empfindliche und schnelle Lösung für den genetischen Variantennachweis. Es hängt von Sequenzunterschieden ab, die dazu führen, dass Heteroduplexe die Form der Schmelzkurve verändern. Durch Kämmen von HRM und Agarosegelelektrophorese können verschiedene Arten von genetischen Varianten wie Indels identifiziert werden.

Abstract

Die hochauflösende Schmelzanalyse (HRM) ist eine leistungsstarke Methode für die Genotypisierung und das Scannen genetischer Variationen. Die meisten HRM-Anwendungen hängen von sättigenden DNA-Farbstoffen ab, die Sequenzunterschiede erkennen, und Heteroduplexen, die die Form der Schmelzkurve verändern. Eine ausgezeichnete Instrumentenauflösung und eine spezielle Datenanalysesoftware sind erforderlich, um die kleinen Schmelzkurvenunterschiede zu identifizieren, die eine Variante oder einen Genotyp identifizieren. Verschiedene Arten von genetischen Varianten mit unterschiedlichen Häufigkeiten können im Gen speziell für Patienten mit einer bestimmten Krankheit, insbesondere Krebs, und im CALR-Gen bei Patienten mit Philadelphia-Chromosom-negativen myeloproliferativen Neoplasmen beobachtet werden. Einzelne Nukleotidveränderungen, Insertionen und/oder Deletionen (Indels) im interessierenden Gen können durch die HRM-Analyse nachgewiesen werden. Die Identifizierung verschiedener Arten von genetischen Varianten basiert hauptsächlich auf den Kontrollen, die im qPCR-HRM-Assay verwendet werden. Mit zunehmender Produktlänge wird der Unterschied zwischen Wildtyp- und Heterozygotenkurven jedoch kleiner und die Art der genetischen Variante ist schwieriger zu bestimmen. Wenn Indels die vorherrschende genetische Variante sind, die im interessierenden Gen erwartet wird, kann daher eine zusätzliche Methode wie die Agarosegelelektrophorese zur Klärung des HRM-Ergebnisses verwendet werden. In einigen Fällen muss ein nicht schlüssiges Ergebnis durch Standard-Sanger-Sequenzierung erneut überprüft / erneut diagnostiziert werden. In dieser retrospektiven Studie wandten wir die Methode auf JAK2 V617F-negative Patienten mit MPN an.

Introduction

Somatische genetische Varianten im Calreticulin-Gen (CALR) wurden 2013 bei Patienten mit myeloproliferativen Neoplasmen (MPN) wie essentieller Thrombozythämie und primärer Myelofibrose erkannt1,2. Seitdem wurden mehr als 50 genetische Varianten im CALR-Gen entdeckt, die eine +1 (−1+2) Frameshift3induzieren. Die beiden häufigsten CALR-Genvarianten sind eine 52 bp Deletion (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), auch Typ-1-Mutation genannt, und eine 5 bp Insertion (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), auch Typ-2-Mutation genannt. Diese beiden genetischen Varianten machen 80% aller CALR-Genvarianten aus. Die anderen wurden als Typ 1-ähnlich oder Typ 2-ähnlich klassifiziert, wobei Algorithmen verwendet wurden, die auf der Erhaltung einer α Helix in der Nähe des Wildtyps CALR4basieren. Hier stellen wir eine der hochempfindlichen und schnellen Methoden zum CALR-Genvariantennachweis vor, die Hochauflösende Schmelzanalysemethode (HRM). Diese Methode ermöglicht den schnellen Nachweis genetischer Varianten vom Typ 1 und Typ 2, die die Mehrheit der CALR-Mutationen ausmachen5. HRM wurde 1997 in Kombination mit der Echtzeit-»Polymerase-Kettenreaktion« (qPCR) als Werkzeug zum Nachweis der Mutation im Faktor V Leiden6eingeführt. Im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung, die die goldene Standardtechnik darstellt, ist HRM eine empfindlichere und weniger spezifische Methode5. Die HRM-Methode ist eine gute Screening-Methode, die eine schnelle Analyse einer großen Anzahl von Proben mit einem großen Kosten-Nutzen-Verhältnis ermöglicht5. Es ist eine einfache PCR-Methode, die in Gegenwart eines Fluoreszenzfarbstoffs durchgeführt wird und keine spezifischen Fähigkeiten erfordert. Ein weiterer Vorteil ist, dass das Verfahren selbst die analysierte Probe nicht beschädigt oder zerstört, so dass wir die Probe für die Elektrophorese oder Sanger-Sequenzierung nach dem HRM-Verfahren wiederverwendenkönnen 7. Der einzige Nachteil ist, dass es manchmal schwierig ist, die Ergebnisse zu interpretieren. Darüber hinaus erkennt HRM die genaue Mutation bei Patienten mit Nicht-Typ-1- oder Typ-2-Mutationen nicht8. Bei diesen Patienten sollte eine Sanger-Sequenzierung durchgeführt werden (Abbildung 1).

HRM basiert auf der Amplifikation der spezifischen DNA-Region in Gegenwart von sättigendem DNA-Fluoreszenzfarbstoff, der in doppelsträngige DNA (dsDNA) eingebaut wird. Der Fluoreszenzfarbstoff emittiert Licht, wenn er in die dsDNA eingebaut wird. Nach einem fortschreitenden Temperaturanstieg zerfällt dsDNA in einzelsträngige DNA, die auf der Schmelzkurve als plötzliche Abnahme der Fluoreszenzintensität nachgewiesen werden kann. Die Form der Schmelzkurve hängt von der DNA-Sequenz ab, die zum Nachweis der Mutation verwendet wird. Schmelzkurven von Proben werden mit Schmelzkurven bekannter Mutationen oder Wildtyp-CALR verglichen. Unterschiedliche Schmelzkurven stellen eine andere Mutation dar, die nicht Typ 1 oder Typ 2ist 9.

Der Algorithmus für den somatischen genetischen Variantennachweis im CALR-Gen durch HRM, Agarosegelelektrophorese und Sequenzierungsmethode ( Abbildung 1 ) wurde in der vor10veröffentlichten retrospektiven Studie verwendet und validiert.

Protocol

Die Studie wurde vom Komitee für medizinische Ethik der Republik Slowenien genehmigt. Alle Verfahren standen im Einklang mit der Erklärung von Helsinki. 1. Fluoreszenzbasierte quantitative real-time PCR (qPCR) und Post-qPCR-Analyse mittels HRM Resuspend Primer, die in der Materialtabelle aufgeführt sind, auf 100 μM mit sterilem, RNase- und DNase-freiemH2O(siehe Materialtabelle). Machen Sie einen 10 μM Arbeitskonzentrationsprimer. Die …

Representative Results

Die erfolgreich amplifizierte DNA-Region von Interesse mit einem exponentiellen Anstieg der Fluoreszenz, der die Schwelle zwischen den Zyklen 15 und 35 überschreitet, und sehr engen Werten des Quantifizierungszyklus (Cq) in allen replizierten Proben und Kontrollen (Abbildung 2) ist eine Voraussetzung für die zuverlässige Identifizierung genetischer Varianten durch HRM-Analyse. Dies wird durch eine präzise Bestimmung der DNA mit Fluoreszenzfärbung und einer gleichen Menge an DNA im qPCR …

Discussion

Das hochauflösende Schmelzen von DNA ist eine einfache Lösung für die Genotypisierung und das Scannen genetischer Varianten14. Es hängt von Sequenzunterschieden ab, die zu Heteroduplexen führen, die die Form der Schmelzkurve verändern. Verschiedene Arten von genetischen Varianten mit unterschiedlichen Häufigkeiten können in dem Gen beobachtet werden, das für eine bestimmte Gruppe von Patienten mit Krebsspezifisch ist 1,2,</su…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken allen akademischen Experten und Mitarbeitern des Spezialisierten Hämatologielabors, Abteilung für Hämatologie, Abteilung für Innere Medizin, Universitätsklinikum Ljubljana.

Materials

E-Gel EX 4% Agarose Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific 4415440 Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4346907
MicroAmp Optical adhesive film Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4311971
NuGenius Syngene NG-1045 Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51306 DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32856
QUBIT dsDNA HS assay Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder Invitrogen, Thermo Fischer Scientific 10488058 Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4453534
Water nuclease free VWR, Life Science 436912C RNase, DNase and Protease free water

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Diesen Artikel zitieren
Pajič, T., Belčič Mikič, T., Podgornik, H., Klun, J., Šućurović, S., Zver, S., Sever, M. Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis. J. Vis. Exp. (162), e61642, doi:10.3791/61642 (2020).

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