Summary

Funktionalisierte spirozyklische Heterocyclensynthese und Zytotoxizitätstest

Published: February 09, 2021
doi:

Summary

Hier beschreiben wir einen Bioassay unter Verwendung von 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT), um zuvor synthetisierte spirocyclische Oxime zu testen.

Abstract

Spirozyklische Heterocyclen wurden kürzlich in der Literatur als potenzielle Medikamente für die Krebstherapie beschrieben. Die Synthese dieser neuartigen orthogonalen Ringsysteme ist eine Herausforderung. Eine effiziente Methodik zur Synthese dieser Verbindungen wurde kürzlich veröffentlicht, die die Festphasensynthese in vier Schritten anstelle der zuvor berichteten fünf Schritte beschreibt. Der Vorteil dieser kürzeren Synthese ist der Wegfall der Verwendung toxischer Reagenzien. Es erwies sich heraus, dass REM-Linkerharz (Low Loading) Regenerating Michael (REM) entscheidend für die Synthese war, da hochladende Versionen die Zugabe von Reagenzien mit sperrigem Phenyl und aromatischen Seitenketten verhinderten. Der kolorimetrische 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay wurde verwendet, um die Zytotoxizität der mikromolaren Konzentrationen dieser neuartigen spirocyclischen Moleküle in vitro zu untersuchen. MTT ist kommerziell leicht erhältlich und liefert relativ schnelle, zuverlässige Ergebnisse, was diesen Assay ideal für diese spirocyclischen Heterocyclen macht. Orthogonale Ringstrukturen sowie Furfurylamin (eine Vorstufe der Synthesemethode, die ein ähnliches 5-gliedriges Ringmotiv enthält) wurden getestet.

Introduction

Es ist bekannt, dass die kleinmolekulare Hemmung der Interaktion von E3-Ubiquitin-Ligase-Maus-Doppelminuten-2-Homolog (MDM2) mit p53 die p53-vermittelte Induktion der Tumorzellapoptose 1,2,3 wiederherstellt. MDM2 ist ein negativer Regulator des p53-Signalwegs und wird in Krebszellenoft überexprimiert 4,5,6,7,8,9. Neuere kristallographische und biochemische Studien haben gezeigt, dass kleine Moleküle, die ein spirozyklisches Gerüst enthalten, MDM2-p53-Wechselwirkungen wirksam hemmen können10. Das spirozyklische Gerüst (Abbildung 1, blau schattiert) gilt als privilegiertes Motiv, da die Derivatisierung dieses starren orthogonalen Ringsystems zur Entdeckung neuartiger therapeutischer Medikamente geführt hat. Der Zugang zu dieser interessanten Architektur stellt eine Herausforderung dar, wenn traditionelle organische Synthesetechniken verwendet werden. Obwohl die therapeutischen Wirkungen spirozyklischer Moleküle in biologischen Systemen untersucht wurden, ist die Synthese dieser Moleküle immer noch ein umständlicher Prozess. Unerwünschte Nebenprodukte, raue Bedingungen und gefährliche Übergangsmetalle sind oft problematisch.

Die mögliche Verwendung des spirozyklischen Motivs in der Arzneimittelentwicklung führte zur Entwicklung eines Protokolls, das die Festphasensynthese verwendet, um eine Bibliothek von Molekülen mit dem Motiv zusätzlich zu anderen austauschbaren funktionellen Gruppen11,12 zu erzeugen. Die Trennung von Produkten und Reaktanten zwischen den Schritten könnte durch die einfache Verwendung eines REM-Linkers erreicht werden, der an einer Harzperle und einem Festphasenfilterbehälter befestigt ist. Dies würde die Stufen reduzieren und möglicherweise die Erträge erhöhen. Dieser synthetische Ansatz könnte eine Vielzahl potenzieller Arzneimittelkandidaten hervorbringen. Die Wirksamkeit dieser Moleküle in einem biologischen System würde jedoch weitere Untersuchungen erfordern.

Um die Zytotoxizität dieser spirocyclischen Verbindungen zu bestimmen, wurde der MTT-Assay13,14 verwendet. Diese Methode misst die Zelllebensfähigkeit und kann zur indirekten Bestimmung der Zellzytotoxizität verwendet werden. Verschiedene Konzentrationen der Inhibitoren wurden kultivierten Zellen in einer 96-Well-Platte zugesetzt, und der Anteil lebender Zellen wurde durch kolorimetrische Analyse des Ausmaßes der Reduktion von gelbem MTT durch mitochondriale Dehydrogenasen zur violetten Formazanverbindung gemessen (Abbildung 2). Die Aktivität wird am häufigsten als IC 50-Wert angegeben – die Konzentration, bei der das Zellwachstum im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle um50% gehemmt wird. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für den MTT-Test und die vorläufigen Ergebnisse dieser neuartigen spirocyclischen Moleküle.

Protocol

HINWEIS: Mehrere Chemikalien und biologische Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Konsultieren Sie vor der Verwendung die relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Verwenden Sie vor Beginn des Experiments geeignete persönliche Schutzausrüstung (von der Occupational Safety and Health Administration zugelassene Schutzbrille, geeignete Handschuhe, Laborkittel, durchgehende Hosen und geschlossene Schuhe). Darüber hinaus sollten Sie bei der Synthese und dem Umgang mit toxis…

Representative Results

Die spirozyklischen Oxime 6 und 7 wurden unter Verwendung eines modifizierten Protokolls synthetisiert (Abbildung 1). Michaels Zusatz von Furfurylamin zu einem REM-Linker 1b ergab polymergebundenes Harz 2. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels Infrarotspektroskopie (IR) überwacht, indem das Verschwinden des α,β-ungesättigten Esters bei 1722 cm-1 nachgewiesen wurde (Abbildung 3). Spirozyklisch gebundenes Harz 4 wurde aus 2 über ein transientes Zw…

Discussion

Die Synthese der spirocyclischen Verbindungen basierte auf früheren Forschungen dieses Labors, jedoch mit einigen Modifikationen (Abbildung 1)11,12. Der Fortschritt jedes Reaktionsschrittes wurde mittels IR-Spektroskopie überwacht. Michael Zusatz des REM-Linkers 1 mit Furfurylamin ergab polymergebundenes 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Aus dem …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Faculty Research Council an K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA) finanziert. A.N.G. und J.F.M. sind Empfänger des Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. und B.M.R. sind Empfänger der STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Wir danken Dr. Matthew Berezuk und Dr. Philip Cox für die Beratung zu den Bioassays.

Materials

CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651) ATCC CRL-1651 African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-Bromooctane Sigma-Aldrich 152951 Alkyl-halide
Allylbromide Sigma-Aldrich 337528 Alkyl-halide
Benzylbromide Sigma-Aldrich B17905 Alkyl-halide
Cisplatin Cayman Chemical 13119 Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997 Solvent
Dimethylformamide (DMF) Sigma-Aldrich 227056 Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855 Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamine Genesee Scientific 25-500 Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum) Sigma-Aldrich F4135 Cell culture media
Furfurylamine Acros Organics 119800050 reagent 
Iodomethane Sigma-Aldrich 289566 Alkyl-halide
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) EMD Millipore Calbiochem 475989-1GM Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS) Genesee Scientific 25-507 Cell culture media
REM Resin Nova Biochem 8551010005 Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyrene Sigma-Aldrich N26806 Nitro-olefin reagent
Toluene Sigma-Aldrich 244511 Solvent
Triethylamine (TEA) Sigma-Aldrich T0886 Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl) Sigma-Aldrich 386529 Reagent; CAUTION – highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vessel Chemglass CG-1861-02 Glassware with filter
96 Well plate reader Promega (Turner Biosystems) 9310-011 Instrument
AVANCE III NMR Spectrometer Bruker N/A Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5 Thermo Scientific IQLAADGAAGFAHDMAZA Instrument
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific 757950819 Instrument

Referenzen

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  14. . MTT assay protocol Available from: https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol (2020)

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Diesen Artikel zitieren
Gray, A. N., Ramirez, B. M., Mawugbe, S. K., Mar, J. F., Wong, Y. C., Huang, K. S. Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay. J. Vis. Exp. (168), e61950, doi:10.3791/61950 (2021).

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