Summary

Laser Doppler Perfusion Imaging in der Maus Hindlimb

Published: April 18, 2021
doi:

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Technik und die notwendigen Kontrollen für die Laser Doppler-Perfusionsbildgebung demonstriert, um den Blutfluss im Maushinterglied zu messen.

Abstract

Die Blutflussrückgewinnung ist eine kritische Ergebnismaßnahme nach experimenteller Hindlimb Ischämie oder Ischämie-Reperfusion. Laser Doppler Perfusionsbildgebung (LDPI) ist eine häufige, nichtinvasive, wiederholbare Methode zur Beurteilung der Blutflussrückgewinnung. Die Technik berechnet den gesamten Blutfluss im entnommenen Gewebe aus der Doppler-Frequenzverschiebung, die verursacht wird, wenn ein Laser auf bewegte rote Blutkörperchen trifft. Die Messungen werden in beliebigen Perfusionseinheiten ausgedrückt, so dass die kontralateralen nicht eingegriffenen am Bein in der Regel zur Kontrolle von Messungen verwendet werden. Die Messtiefe liegt im Bereich von 0,3-1 mm; für Hinterlimbischämie bedeutet dies, dass die dermale Perfusion bewertet wird. Die Dermale Perfusion ist von mehreren Faktoren abhängig – vor allem von der Hauttemperatur und dem Anästhetikum, die sorgfältig kontrolliert werden müssen, um zu zuverlässigen Messwerten zu führen. Darüber hinaus kann die Haar- und Hautpigmentierung die Fähigkeit des Lasers verändern, die Dermis entweder zu erreichen oder zu durchdringen. Dieser Artikel zeigt die Technik von LDPI im Maus-Hinterglied.

Introduction

Hautgeschwüre mit unzureichender Wundheilung ist eine der Hauptursachen für Amputationen bei menschlichen Patienten1. Eine adäquate Wundheilung erfordert ein höheres Maß an arterieller Perfusion, als erforderlich ist, um intakte Haut zu erhalten, die bei Patienten mit peripherer arterieller Erkrankung2,3,4beeinträchtigt wird. Mehrere andere rheumatologische Erkrankungen und Diabetes können auch zu einer gestörten und unzureichenden Mikrozirkulation der Haut führen, um Wunden zu heilen5,6. Viele Diabetiker haben eine begleite periphere arterielle Erkrankung, wodurch sie einem besonders hohen Risiko für eine Amputation ausgesetzt sind. Laser Doppler Perfusionsbildgebung (LDPI) wird in klinischen Situationen verwendet, um die Mikrozirkulation der Haut zu bewerten, sowie in Forschungssituationen, um den Blutfluss und die Blutflussrückgewinnung nach experimenteller Hindlimb Ischämie, Ischämie-Reperfusion und mikrochirurgischen Klappen7zu bewerten.

Das LDPI-System projiziert einen Low-Power-Laserstrahl, der von einem Scanspiegel abgelenkt wird, um sich über einen Bereich von Interesse zu bewegen. Dies unterscheidet sich von der Laser-Doppler-Flowmetrie, die eine Perfusionsmessung für den kleinen Gewebebereich in direktem Kontakt mit der Fließsonde8ermöglicht. Wenn der Laserstrahl mit bewegtem Blut in der Mikrovaskulatur interagiert, durchläuft er eine Doppler-Frequenzverschiebung, die vom Scanner fotografiert und in beliebige Perfusionseinheiten umgewandelt wird. Da LDPI eine lichtbasierte Technik ist, ist sie in Bezug auf die Penetrationstiefe auf 0,3-1 mm begrenzt, was bedeutet, dass die dermale Perfusion zum größten Teil7bewertet wird. Dermaler Durchfluss kann durch die Hauttemperatur und das sympathische Nervensystem verändert werden, das durch verschiedene Anästhetika beeinflusst werden kann9. Messungen des optischen Lasers werden auch durch Umgebungslichtbedingungen, Hautpigmentierung beeinflusst und können durch überlagerndes Fell oder Haar blockiert werden7.

LDPI ist die am häufigsten verwendete Forschungstechnik zur Überwachung der Perfusionsrückgewinnung nach Ischämie, da sie nicht invasiv ist, keine Kontrastverabreichung erfordert und schnelle Scanzeiten hat, die die Datenerfassung bei mehreren Tieren ermöglichen. Dies macht es ideal zu bestimmen, ob Behandlungen auf therapeutische Arteriogenese oder Angiogenese sind wirksam in kleinen Tiermodellen. Die Durchblutungsrückgewinnung nach Hinterlimbischämie, gemessen mit LDPI, korreliert gut mit der Entwicklung der Kollateralarterie, wenn sie mit anderen Mitteln wie Microfil-Guss oder Mikro-CT10,11bewertet wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Beurteilung der Hinterbeinerperfusion mit LDPI zu demonstrieren.

Protocol

Tierversuche wurden nach einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Washington genehmigt wurde. 1. Scanner-Vorbereitung Passen Sie die Scannerhöhe so an, dass der Abstand zum gescannten Motiv ca. 30 cm beträgt. Schalten Sie den Imager ein und starten Sie die zugehörige Software. Öffnen Sie das Messprogramm. Wenn die Software korrekt mit dem Scanner kommuniziert, wird die Warnung zum Ei…

Representative Results

Erfolgreiche LDPI sollte zu konsistenten Wiederholungsmessungen führen, wobei nicht mehr als 100-150 Perfusionseinheiten variation (entsprechend etwa 10% der üblichen mittleren Perfusion für das Maus-Fußpad) zwischen den drei Scans(Abbildung 2) auftreten. Wie in Abbildung 2dargestellt, helfen Wiederholungsscans festzustellen, dass die Maus angemessen ausgeglichen wurde, so dass das ischämische/kontrollische Verhältnis den zugrunde liegenden Blutfluss am be…

Discussion

Konsistente Technik ist entscheidend für die Erzielung zuverlässiger Ergebnisse mit LDPI. Die gleiche Anästhesie, Temperatureinstellungen, Mausposition und Interessenbereich sollten während des gesamten Zeitverlaufs verwendet werden. Verschiedene Anästhetika führen zu höheren oder niedrigeren Perfusionswerten9. Isoflurane Anästhesie ist bequem wegen seiner schnellen Beginn und Entstehung sowie allgemeine Sicherheit. Ein konsistenter Prozentsatz von Isofluran sollte als Tiefe der Anästhesi…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeiten wurden mit dem Einsatz von Einrichtungen und Ressourcen im VA Puget Sound Health Care Center durchgeführt. Das Werk ist das des Autors und spiegelt nicht unbedingt die Position oder Politik des Department of Veterans Affairs oder der Regierung der Vereinigten Staaten wider. Dr. Tang wird derzeit über die VA (Merit 5 I01 BX004975-02) finanziert.

Materials

Black nonreflective material Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister A.M. Bickford Inc 80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe Harvard Apparatus Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine Drager Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber VetEquip 941444 2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager Moor Instruments MoorLDI2-IR Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone Multiple manufacturers
Nair Nair
Oxygen tank Multiple manufacturers
Surgilube Multiple distributors

Referenzen

  1. Varma, P., Stineman, M. G., Dillingham, T. R. Epidemiology of limb loss. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 25 (1), 1-8 (2014).
  2. Farber, A. Chronic Limb-Threatening Ischemia. New England Journal of Medicine. 379 (2), 171-180 (2018).
  3. Abularrage, C. J., et al. Evaluation of the microcirculation in vascular disease. Journal of Vascular Surgery. 42 (3), 574-581 (2005).
  4. Houben, A., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  5. Mahe, G., Humeau-Heurtier, A., Durand, S., Leftheriotis, G., Abraham, P. Assessment of skin microvascular function and dysfunction with laser speckle contrast imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 5 (1), 155-163 (2012).
  6. Murray, A. K., Herrick, A. L., King, T. A. Laser Doppler imaging: a developing technique for application in the rheumatic diseases. Rheumatology (Oxford). 43 (10), 1210-1218 (2004).
  7. Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser Doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors (Basel). 13 (1), 500-515 (2012).
  8. Sonmez, T. T., et al. A novel laser-Doppler flowmetry assisted murine model of acute hindlimb ischemia-reperfusion for free flap research. PLoS One. 8 (6), 66498 (2013).
  9. Gargiulo, S., et al. Effects of some anesthetic agents on skin microcirculation evaluated by laser Doppler perfusion imaging in mice. BMC Veterinary Research. 9, 255 (2013).
  10. Ankri-Eliahoo, G., Weitz, K., Cox, T. C., Tang, G. L. p27(kip1) Knockout enhances collateralization in response to hindlimb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (5), 1351-1359 (2016).
  11. McEnaney, R. M., Shukla, A., Madigan, M. C., Sachdev, U., Tzeng, E. P2Y2 nucleotide receptor mediates arteriogenesis in a murine model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (1), 216-225 (2016).
  12. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
  13. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
  14. Chalothorn, D., Faber, J. E. Strain-dependent variation in collateral circulatory function in mouse hindlimb. Physiological Genomics. 42 (3), 469-479 (2010).
  15. Helisch, A., et al. Impact of mouse strain differences in innate hindlimb collateral vasculature. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (3), 520-526 (2006).
  16. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (8), 1748-1756 (2011).
  17. Forrester, K. R., Stewart, C., Tulip, J., Leonard, C., Bray, R. C. Comparison of laser speckle and laser Doppler perfusion imaging: measurement in human skin and rabbit articular tissue. Medical & Biological Engineering & Computing. 40 (6), 687-697 (2002).
  18. Briers, J. D. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging. Physiological Measurement. 22 (4), 35-66 (2001).
  19. Heeman, W., Steenbergen, W., van Dam, G., Boerma, E. C. Clinical applications of laser speckle contrast imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 24 (8), 1-11 (2019).
  20. Nguyen, T., Davidson, B. P. Contrast Enhanced Ultrasound Perfusion Imaging in Skeletal Muscle. Journal of Cardiovascular Imaging. 27 (3), 163-177 (2019).
  21. Zaccagnini, G., et al. Magnetic Resonance Imaging Allows the Evaluation of Tissue Damage and Regeneration in a Mouse Model of Critical Limb Ischemia. PLoS One. 10 (11), 0142111 (2015).
  22. Penuelas, I., et al. PET as a measurement of hindlimb perfusion in a mouse model of peripheral artery occlusive disease. Journal of Nuclear Medicine. 48 (13), 1216-1223 (2007).
  23. Jia, Y., Qin, J., Zhi, Z., Wang, R. K. Ultrahigh sensitive optical microangiography reveals depth-resolved microcirculation and its longitudinal response to prolonged ischemic event within skeletal muscles in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (8), 086004 (2011).
  24. Turaihi, A. H., et al. Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion. Journal of Visualized Experiments. (121), e54912 (2017).
  25. Liu, C., et al. Enhanced autophagy alleviates injury during hindlimb ischemia/reperfusion in mice. Experimental and Therapeutic Medicine. 18 (3), 1669-1676 (2019).
  26. Liu, D. L., Svanberg, K., Wang, I., Andersson-Engels, S., Svanberg, S. Laser Doppler perfusion imaging: new technique for determination of perfusion and reperfusion of splanchnic organs and tumor tissue. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (4), 473-479 (1997).
  27. Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat. Journal of Visualized Experiments. (135), e56243 (2018).
  28. Zhang, D., Li, S., Wang, S., Ma, H. An evaluation of the effect of a gastric ischemia-reperfusion model with laser Doppler blood perfusion imaging. Lasers in Medical Science. 21 (4), 224-228 (2006).
  29. Fitzal, F., et al. Circulatory changes after prolonged ischemia in the epigastric flap. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (7), 535-543 (2001).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Tang, G. L., Kim, K. J. Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb. J. Vis. Exp. (170), e62012, doi:10.3791/62012 (2021).

View Video