Eine neue statische Plattform wird verwendet, um Proteinstruktur- und Interaktionsstellen in der nativen Zellumgebung zu charakterisieren, indem eine Protein-Footprinting-Technik verwendet wird, die als schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (IC-FPOP) in der Zelle bezeichnet wird.
Die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP) in Verbindung mit der Massenspektrometrie (MS) ist zu einem unschätzbaren Werkzeug in der strukturellen Proteomik geworden, um Proteinwechselwirkungen, Struktur und Proteinkonformationsdynamik in Abhängigkeit von der Zugänglichkeit von Lösungsmitteln zu überprüfen. In den letzten Jahren wurde der Anwendungsbereich von FPOP, einer Hydroxylradikal-Protein-Fußdruck-Technik (HRPF), auf die Proteinkennzeichnung in lebenden Zellkulturen ausgeweitet und bietet die Möglichkeit, Proteinwechselwirkungen in der verworrenen zellulären Umgebung zu untersuchen. In-Zell-Protein-Modifikationen können Einblicke in Liganden induzierte strukturelle Veränderungen oder Konformationsveränderungen geben, die mit der Proteinkomplexbildung einhergehen, und das alles im zellulären Kontext. Die Protein-Fußabdruckung wurde mit einem üblichen strömungsbasierten System und einem 248 nm KrF-Excimerlaser durchgeführt, um Hydroxylradikale über photolysewasserstoffperoxid zu ergeben, was eine 20-minütige Analyse für eine Zellprobe erfordert. Um zeitaufgelöste FPOP-Experimente zu ermöglichen, wurde der Einsatz einer neuen 6-Well-Platten-basierten IC-FPOP-Plattform als Pionierin entwickelt. Im aktuellen System bestrahlt ein einzelner Laserpuls einen ganzen Brunnen, was den experimentellen FPOP-Zeitrahmen abkürst, was zu einer 60-fachen Abnahme von 20 Sekunden Analysezeit führt. Diese stark verkürzte Analysezeit ermöglicht es, zelluläre Mechanismen wie biochemische Signalkaskaden, Proteinfaltung und Differentialexperimente (d.h. drogenfrei vs. drogengebunden) zeitabhängig zu erforschen. Diese neue Instrumentierung mit dem Titel Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) ermöglicht es dem Anwender, Zellkultur und IC-FPOP direkt auf der optischen Bank mit einem Plattform-Inkubator mit Temperatur-,CO2- und Feuchtigkeitsregelung durchzuführen. Die Plattform umfasst auch eine Positionierungsstufe, peristaltische Pumpen und Spiegeloptik für die Laserstrahlführung. IC-FPOP-Bedingungen wie Optikkonfiguration, Durchflussraten, transiente Transfektionen und H2O2-Konzentration in PIXY wurden optimiert und peer-reviewed. Die Automatisierung aller Komponenten des Systems wird die menschliche Manipulation reduzieren und den Durchsatz erhöhen.
Protein-Fußabdruck-Techniken können tiefgreifende Informationen über die Organisation von Proteinen offenbaren. Diese wesentlichen strukturbiologischen MS-basierten Techniken sind Bestandteil der Toolbox der Massenspektrometrie. Diese Methoden untersuchen Protein-Strukturen höherer Ordnung (HOS) und Synergien über kovalente Kennzeichnung1,2,3,4. Die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP) verwendet Hydroxylradikale, um lösungsmittelfreie Seitenketten von Aminosäuren5,6 ( Tabelle1) oxidativ zu modifizieren. Das Verfahren verwendet einen Excimer-Laser bei 248 nm zur Photolyse von Wasserstoffperoxid (H2O2), um Hydroxylradikale zu erzeugen. Theoretisch können 19 der 20 Aminosäuren oxidativ modifiziert werden, wobei Gly die einsame Ausnahme ist. Aufgrund der unterschiedlichen Reaktivitätsraten von Aminosäuren mit Hydroxylradikalen wurde jedoch eine Veränderung nur einer Teilmenge dieser Experimente experimentell beobachtet. Dennoch hat die Methode das Potenzial für die Analyse über die Länge einer Proteinsequenz5. FPOP modifiziert Proteine auf der Mikrosekunden-Zeitskala, was es nützlich macht, schwache Wechselwirkungen mit schnellen Abschaltraten zu untersuchen. Die Lösemittel-Zugänglichkeit ändert sich bei Ligandenbindung oder einer Änderung der Proteinkonformation, so dass die Kraft des Verfahrens im Vergleich des Etikettiermusters eines Proteins in mehreren Zuständen liegt (d. h. ligaandfrei im Vergleich zu Ligandengebunden). Als Ergebnis ist es FPOP gelungen, Protein-Protein- und Protein-Ligand-Wechselwirkungsstellen und Regionen der Konformationsveränderung7,8,9,10zu identifizieren. Die FPOP-Methode wurde von der Untersuchung von gereinigten Proteinsystemen bis zur In-Zell-Analyse erweitert. In-Cell FPOP (IC-FPOP) kann oxidativ über tausend Proteine in Zellen modifizieren, um strukturelle Informationen über das Proteom11,12zu liefern. Die herkömmliche IC-FPOP-Plattform nutzt ein Durchflusssystem, um Zellen einzelne Dateien an dem Laserstrahl vorbei zu fließen. Die Entwicklung dieses Systems ermöglichte es einzelnen Zellen, die gleiche Exposition gegenüber Laserbestrahlung zu haben. Dies führte zu einem 13-fachen Anstieg der Anzahl oxidativ markierter Proteine12. Eine Einschränkung des Strömungssystems ist jedoch die Länge eines einzelnen Probenexperiments, bestehend aus einem 10-minütigen Bestrahlungsintervall, in dem die Modifikation stattfindet, und einem zusätzlichen 10-minütigen Waschzyklus. Die zeitlichen Zwänge von IC-FPOP machen es ungeeignet für die Untersuchung kurzlebiger Proteinfaltzwischenprodukte oder Veränderungen, die zwischen Interaktionsnetzwerken in biochemischen Signalkaskaden vorhanden sind. Diese zeitliche Begrenzung inspirierte das Design einer neuen IC-FPOP-Plattform mit höherem Durchsatz.
Um die Proteinstruktur in der nativen Zellumgebung genau zu messen, ermöglicht das neue Design die Zellkultur direkt an der Laserplattform, wodurch IC-FPOP einen hohen Durchsatz erreicht. Dieses Setup ermöglicht auch minimierte Störungen der zellulären Umgebung, im Gegensatz zu IC-FPOP mit Strömung, bei dem haftende Zellen aus dem Substrat entfernt werden müssen. Die neue Plattform ermöglicht IC-FPOP in einem sterilen Inkubationssystem mit einerCO2- und temperaturgesteuerten Bühnenoberkammer unter Verwendung konfigurierter Spiegeloptiken für die Laserstrahlführung, einem Positionierungssystem für XY-Bewegungen und peristaltischen Pumpen für den chemischen Austausch. Die neue Plattform zur Durchführung von IC-FPOP trägt den Titel Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (Abbildung 1). In PIXY wird IC-FPOP an menschlichen Zellen durchgeführt, die in Sechs-Well-Platten innerhalb der Plattform-Inkubatorkammer angebaut werden. Bei dieser Konfiguration wird der Laserstrahl mit strahlkompatiblen Spiegeln nach unten auf die Platte reflektiert, da eine Positionierstufe, die den Inkubator hält, in der XY-Ebene bewegt wird, so dass der Laserstrahl strategisch ausgerichtet ist, um nur einen Brunnen nach dem anderen zu bestrahlen. Validierungsstudien zeigen, dass IC-FPOP in PIXY schneller durchgeführt werden kann als im Strömungssystem und zu erhöhten Aminosäuremodifikationen pro Protein führt. Die Entwicklung dieser neuen IC-FPOP-Plattform wird das Wissen erklären, das aus zellulären Experimenten gewonnen werden kann13.
Proteine leisten einen Großteil der Arbeit in lebenden Zellen. Angesichts dieser Bedeutung sind detaillierte Daten über die Proteinfunktion und die Struktur höherer Ordnung (HOS) in der zellulären Umgebung erforderlich, um das Verständnis der Feinheiten in größeren Komplexen und enzymatischen Reaktionen in Zellen im Gegensatz zu gereinigten Systemen zu vertiefen. Dazu wurde eine Hydroxylradikal-Protein-Fußdruck-Methode (HRFP) mit dem Titel In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP) eingeführt. Die meisten FPOP-Studien wurden in vitro in relativ reinen Proteinsystemen durchgeführt, was deutlich im Gegensatz zur überfüllten molekularen Umgebung steht, die Bindungswechselwirkungen und Proteinkonformationsdynamik beeinflusst. Infolgedessen gibt es eine Kluft zwischen den Ergebnissen aus In-vitro-Experimenten 18 und denen, die in einer tatsächlichen zellulären Umgebung erhalten würden. Um die Lücke zwischen den idealisierten Bedingungen eines In-vitro-FPOP-Experiments und der Komplexen Natur der Zelle zu überbrücken, wurde eine neue automatisierte Sechs-Well-Platten-basierte in Zell-FPOP-Plattform entwickelt. Diese neuartige FPOP-Technologie ist in der Lage, diese molekularen Arten zu identifizieren und zu charakterisieren und ihre dynamischen molekularen Wechselwirkungen sowohl in gesunden als auch in kranken Zuständen nachzuverfolgen. Diese neue Plattform heißt Platform Incubator mit Movable XY Stage (PIXY).
FPOP wurde erfolgreich eingesetzt, um die strukturellen Informationen innerhalb des Proteoms zu charakterisieren. Jede biologische Technik hat jedoch gewisse Einschränkungen, die weiter verbessert werden müssen. Bei der Laserphotolyse sind spezifische Reagenzien erforderlich und unreagierte Hydroxylradikale effizient abzulöschen. Die Trennung von verdauten Peptiden kann viel Zeit erfordern, um strukturelle Informationen zu maximieren. Diese Fülle an Informationen kann auch eine umfassende Quantifizierung während der Post-MS-Datenanalyseerfordern 1. Der Plattform-Inkubator, einschließlich der peripheren Maschinen, die für die Zellkultur und IC-FPOP auf der Laserplattform benötigt werden, hat hohe Kosten, die für einige Labore möglicherweise nicht machbar sind. Da die Fortschritte weiter voranschreiten, sollten robuste Software und Analysetools die Technik weiter voranbringen; davon in dieser Studie vorgestellt. Aktuelle Studien in diesem Plattform-Inkubator wurden an HEK293T-Zellen und in C. elegansdurchgeführt. Die IC-FPOP-Methode ist nachweislich mit einer Vielzahl von Zelllinien kompatibel, einschließlich chinesischer Hamster-Ovarial (CHO), Vero, MCF-7 und MCF10-A-Zellen19. Da die allgemeine IC-FPOP-Methode auf diese statische Plattform übersetzbar ist, sollten diese Zelllinien auch für Studien mit PIXY zugänglich sein.
IC-FPOP nutzt H2O2, um lösungsmittelfreie Seitenketten von Aminosäuren oxidativ zu modifizieren, um dann Proteinwechselwirkungen, Struktur und metabolische Effekte innerhalb lebensfähiger Zellen weiter zu erkennen, was für die Bereitstellung biologischer Kontexte von Bedeutung ist. Vor einem IC-FPOP-Experiment muss bestätigt werden, dass die Zellen nach H2O2-Zugabe lebensfähig sind. Zelllebensfähigkeitsstudien zeigten, dass die Zellen in Gegenwart vonH2O2-Konzentrationen bis zu 200 mM 13lebensfähig waren. Es ist auch wichtig sicherzustellen, dassH2O2 in einer Endkonzentration von 200 mM direkt auf Zellen infundiert wird, nachdem Medien entfernt wurden. Wenn Zellkulturmedien nicht vollständig entfernt werden, werden unterschiedliche Konzentrationen vonH2O2verursacht. Im Vergleich zu Standardbedingungen führte die Erhöhung der Inkubationszeit auf 10 Sekunden zusammen mit der Erhöhung der H2O2-Konzentration zu einer höheren Anzahl von Proteinen, die durch IC-FPOP im Plattform-Inkubator modifiziert wurden. Es ist zwingend erforderlich, peristaltische Pumpen vor dem Einsatz zu grundieren, um sicherzustellen, dass pumpen ordnungsgemäß funktioniert und Flüssigkeit verteilt wird. Andernfalls können Luftblasen in den Schläuchen, ein unzureichendes Volumen von H2O2 zum Eintauchen von Zellen und/oder ein unzureichendes Volumen der Abschrecklösung entstehen.
Ein weiteres Problem, das auftreten kann, sind unerwünschte Verzögerungen im System. Ein Beispiel hierfür ist der Prozess der Überprüfung empfangener Befehle für die Pumpensysteme, was mit der Integrationssoftware zu erheblichen Verzögerungen in der Größenordnung von 1000 oder mehr Millisekunden führt. Dieses Problem kann behoben werden, indem die Kommunikation mit den Pumpen während des Experiments minimiert wird und voreingestellte Befehle so weit wie möglich im Voraus verwendet werden.
Ziel von PIXY ist es, in Zukunft ein vollautomatisiertes und integriertes System zu produzieren. Neben den peristaltischen Pumpen wird auch die Auslösung des Laserpulses automatisiert. Ein neues Positionierungssystem wird auch für die schnelle Bewegung des Plattform-Inkubators verwendet werden, um Geschwindigkeit und Genauigkeit zu erhöhen. Alle Komponenten des Systems werden weiterhin mit der Integrationssoftware programmiert, um den Durchsatz weiter zu erhöhen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des NIH R01 GM128983-01 unterstützt.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |