Summary

Analyse der neutralen Lipidsynthese in Saccharomyces cerevisiae durch metabolische Markierung und Dünnschichtchromatographie

Published: February 02, 2021
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Summary

Hier wird ein Protokoll zur metabolischen Markierung von Hefe mit 14C-Essigsäure vorgestellt, das mit dünnschichtiger Chromatographie zur Abtrennung neutraler Lipide gekoppelt ist.

Abstract

Neutrale Lipide (NLs) sind eine Klasse von hydrophoben, ladungslosen Biomolekülen, die eine Schlüsselrolle bei der Energie- und Lipidhomöostase spielen. NLs werden de novo aus Acetyl-CoA synthetisiert und kommen in Eukaryoten vor allem in Form von Triglyceriden (TGs) und Sterolestern (SEs) vor. Die Enzyme, die für die Synthese von NLs verantwortlich sind, sind von Saccharomyces cerevisiae (Hefe) für den Menschen hoch konserviert, was Hefe zu einem nützlichen Modellorganismus macht, um die Funktion und Regulation von NL-Stoffwechselenzymen zu analysieren. Während viel darüber bekannt ist, wie Acetyl-CoA in eine Vielzahl von NL-Spezies umgewandelt wird, werden Mechanismen zur Regulierung von NL-Stoffwechselenzymen und wie Fehlregulation zu zellulären Pathologien beitragen kann, immer noch entdeckt. Zahlreiche Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von NL-Arten wurden in jahrzehntelanger Forschung entwickelt und eingesetzt; Ein quantitatives und einfaches Protokoll für die umfassende Charakterisierung der wichtigsten NL-Arten wurde jedoch nicht diskutiert. Hier wird eine einfache und anpassungsfähige Methode zur Quantifizierung der De-novo-Synthese wichtiger NL-Arten in Hefe vorgestellt. Wir wenden 14C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierungen in Verbindung mit Dünnschichtchromatographie an, um eine Vielzahl physiologisch wichtiger NLs zu trennen und zu quantifizieren. Darüber hinaus kann diese Methode leicht angewendet werden, um in vivo Reaktionsraten von NL-Enzymen oder den Abbau von NL-Spezies im Laufe der Zeit zu untersuchen.

Introduction

Acetyl-CoA ist der grundlegende Baustein verschiedener Biomoleküle, einschließlich neutraler Lipide (NLs), die als vielseitige biomolekulare Währung für den Aufbau von Membranen, die Erzeugung von ATP und die Regulierung der Zellsignalisierung dienen1,2. Die Verfügbarkeit von NLs, die in einen dieser jeweiligen Pfade geschoben werden können, wird teilweise durch ihre Speicherung reguliert. Lipidtröpfchen (LDs), zytoplasmatische Organellen, die aus hydrophoben Kernen von Triglyceriden (TGs) und Sterolestern (SEs) bestehen, sind die Hauptspeicherkompartimente der meisten zellulären NLs. Als solche sequestrieren und regulieren LDs NLs, die abgebaut und anschließend für biochemische und metabolische Prozesse genutzt werden können3,4. Es ist bekannt, dass die Fehlregulation von NL- und LD-assoziierten Proteinen mit dem Auftreten von Pathologien wie Lipodystrophie und metabolischen Syndromen korreliert5,6. Aus diesem So konzentriert sich die aktuelle LD-Forschung intensiv darauf, wie die NL-Synthese räumlich, zeitlich und über verschiedene Gewebe mehrzelliger Organismen hinweg reguliert wird. Aufgrund der allgegenwärtigen zellulären Rolle für NLs sind viele Enzyme, die für die Synthese und Regulation von NLs verantwortlich sind, in allen Eukaryotenerhalten 7. Tatsächlich speichern sogar einige Prokaryoten NLs in LDs8. Daher waren genetisch traktierbare Modellorganismen wie Saccharomyces cerevisiae (Knospenhefe) für die Untersuchung der NL-Synthese und -Regulation nützlich.

Die Trennung und Quantifizierung von NLs aus Zellextrakten kann auf vielfältige Weise erreicht werden, einschließlich Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (UPLC-MS)9,10,11. Die vielleicht einfachste Methode zur Trennung von NLs ist die Dünnschichtchromatographie (TLC), die eine anschließende densitometrische Quantifizierung aus einer Standardkurve12,13ermöglicht. Obwohl TLC nur eine kurskörnige Trennung von NLs bietet, bleibt es eine leistungsstarke Technik, da es kostengünstig ist und die schnelle Trennung von NLs von mehreren Proben gleichzeitig ermöglicht. Zwei der größten Herausforderungen bei der Untersuchung von NLs mittels TLC sind: 1) das breite Spektrum der zellulären Häufigkeiten von NL-Spezies und ihren Zwischenprodukten und 2) das Spektrum der Hydrophilie / Hydrophobie von Lipidzwischenprodukten innerhalb der NL-Synthesewege. Folglich ist die Quantifizierung von NL-Arten über TLC typischerweise auf die am häufigsten vorkommenden Arten beschränkt; Die Einführung einer 14-C-Essigsäure-Radiomarkierung kann jedoch den Nachweis von Zwischenprodukten mit geringer Abundanz innerhalb von NL-Signalwegen erheblich verbessern. Essigsäure wird durch die Acetyl-CoA-Synthetase ACS214schnell in Acetyl-CoA umgewandelt, wodurch 14C-Essigsäure ein geeignetes Radiomarkierungssubstrat in Hefe15ist. Zusätzlich kann die Trennung sowohl von hydrophoben NLs als auch von hydrophilen Zwischenprodukten von NLs durch TLC durch den Einsatz mehrerer Lösungsmittelsysteme erreicht werden16. Hier wird ein Verfahren zur Trennung von NLs mittels 14C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierung in Hefe vorgestellt. Lipide, die während der Pulszeit markiert werden, werden anschließend durch ein gut etabliertes Totallipidisolationsprotokoll17isoliert, gefolgt von der Trennung der NL-Spezies durch TLC. Die Entwicklung von TLC-Platten sowohl durch Autoradiographie zur Visualisierung markierter Lipide als auch durch ein chemisches Spray zur Visualisierung von Gesamtlipiden ermöglicht mehrere Quantifizierungsmethoden. Einzelne Lipidbänder können auch leicht mit einer Rasierklinge aus der TLC-Platte extrahiert werden, und die Szintillationszählung kann verwendet werden, um die Menge an radioaktiv markiertem Material innerhalb des Bandes zu quantifizieren.

Protocol

1. Wachstum und Markierung von Hefezellen mit 14C-Essigsäure Impfen Sie eine Hefekultur, indem Sie eine Kolonie von einem Teller pflücken und in 20 ml synthetisches komplettes (SC) Medium mit 2% Dextrose dosieren (siehe Ergänzungsdatei für die Rezeptur von SC-Medien). Bei 30 °C über Nacht mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren.HINWEIS: Wachstumszustand, Probenvolumen und Behandlung unterscheiden sich je nach den lipiden von Interesse. Vor der Durchführung vollständiger E…

Representative Results

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass die Markierung, Detektion und Quantifizierung von NL-Spezies durch 14C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierung erreicht werden kann. Wichtige NL-Spezies können in einem Lösungsmittelsystem von 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexan:Petrolether:Diethylether:Essigsäure(Abbildung 1A,B)getrennt werden. Die Phosphorbildgebung ermöglicht die Visualisierung von markierten freien Fettsäuren (FFA), Triacylglycerin (TG), Diacylglycerin (DG),…

Discussion

Hier wird ein vielseitiges Radiolabeling-Protokoll zur quantitativen Überwachung der Synthese von NL-Arten in Hefe vorgestellt. Dieses Protokoll ist sehr modular aufgebaut, so dass das Verfahren innerhalb von 3-6 Tagen abgeschlossen werden kann. Darüber hinaus gibt es eine Fülle von Literatur über die Verwendung von TLC zur Trennung von Lipidspezies und Metaboliten, die es dem Benutzer ermöglichen sollte, mehrere Lipidspezies von Interesse mit einem einfachen Wechsel der TLC-Lösungsmittelsysteme nachzuweisen<sup cl…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken den Mitgliedern des Henne-Labors für die Hilfe und konzeptionelle Beratung bei der Fertigstellung dieser Studie. W.M.H. wird durch Mittel der Welch Foundation (I-1873), des NIH NIGMS (GM119768), des Ara Paresghian Medical Research Fund und des UT Southwestern Endowed Scholars Program unterstützt. S.R wurde durch einen T32-Programmzuschuss (5T32GM008297) unterstützt.

Materials

[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi PerkinElmer NEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol Avanti 800811O
200 proof absolute ethanol Sigma 459836
Acid washed glass beads 425-600um Sigma G8772
Amber bulbs for Pastuer pipettes Fisher 03-448-24
Ammonium Sulfate >99% Sigma A4418
Beckman LS6500 scintillation counter PerkinElmer A481000
Chloroform (HPLC grade) Fisher C607SK
Cholesterol >99% Sigma C8667
Cholesteryl-linoleate >98% Sigma C0289
Concentrated sulfuric acid Sigma 339741
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap Sigma CLS430829
Dextrose, anhydrous grade Sigma D9434
Diethyl ether anhydrous grade Sigma 296082
Drying oven Fisher 11-475-155
EcoLume scintillation liquid VWR IC88247001
Eppendorf 5424R centrifuge Fisher 05-401-205
GE Storage phosphor screen Sigma GE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 imager
Glacial acetic acid, ACS grade Sigma 695092
Glass 6mL scintillation vials Sigma M1901
Glass centrifuge tube caps Fisher 14-595-36A
Glass centrifuge tubes Fisher 14-595-35A
Glass Pasteur pipette Fisher 13-678-20C
Hexane, anhydrous grade Sigma 296090
L-Adenine >99% Sigma A8626
L-Alanine >98% Sigma A7627
L-Arginine >99% Sigma A1270000
L-Asparagine >98% Sigma A0884
L-Aspartate >98% Sigma A9256
L-Cysteine >97% Sigma W326305
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% Sigma 49621
L-Glutamine >99% Sigma G3126
L-Glycine >99% Sigma G8898
L-Histidine >99% Sigma H8000
L-Isoleucine >98% Sigma I2752
L-Leucine >98% Sigma L8000
L-Lysine >98% Sigma L5501
L-Methionine, HPLC grade Sigma M9625
L-Phenylalanine, reagent grade Sigma P2126
L-Proline >99% Sigma P0380
L-Serine >99% Sigma S4500
L-Theronine, reagent grade Sigma T8625
L-Tryptophan >98% Sigma T0254
L-Tyrosine >98% Sigma T3754
L-Uracil >99% Sigma U0750
L-Valine >98% Sigma V0500
Methanol, ACS grade Fisher A412
Oleic acid >99% Sigma O1008
p-anisaldehyde Sigma A88107
Petroleum ether, ACS grade Sigma 184519
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% Sigma P1652
Pipettes Eppendorf 2231000713
Potassium chloride, ACS grade Sigma P3911
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS Fisher S318-100
Squalene >98% Sigma S3626
Succinic Acid crystalline/certified Fisher 110-15-6
TLC saturation pad Sigma Z265225
TLC silica gel 60G glass channeled plate Fisher NC9825743 No fluorescent indicators
Transparency plastic film Apollo 829903
Tricine Sigma T0377
Triolein >99% Sigma T7140
Vortex mixer Fisher 02-215-414
Whatman exposure cassette Sigma WHA29175523
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids Sigma Y1251

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Rogers, S., Henne, W. M. Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (168), e62201, doi:10.3791/62201 (2021).

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