Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines temperaturgesteuerten Wärmesystems zur Förderung der Lipid-Monolayer-Montage und der Tröpfchen-Schnittstellen-Bilayerbildung für Lipide mit erhöhten Schmelztemperaturen und Kapazitätsmessungen zur Charakterisierung temperaturgetriebener Veränderungen in der Membran.
Die Droplet Interface Bilayer (DIB)-Methode zur Montage von Lipid-Doppelschichten (d.h. DIBs) zwischen lipidbeschichteten wässrigen Tröpfchen in Öl bietet im Vergleich zu anderen Methoden wichtige Vorteile: DIBs sind stabil und oft langlebig, bilayerBereich kann reversibel abgestimmt werden, Prospektasymmetrie wird leicht über Tröpfchenzusammensetzungen gesteuert und gewebeähnliche Netzwerke von Doppeltöten können durch angrenzende. Die Bildung von DIBs erfordert eine spontane Montage von Lipiden in hochdichte Lipidmonolayer an den Oberflächen der Tröpfchen. Während dies bei gemeinsamen synthetischen Lipiden leicht bei Raumtemperatur vorkommt, bildet sich bei Lipiden mit Schmelzpunkten oberhalb der Raumtemperatur, einschließlich einiger zellulärer Lipidextrakte, keine ausreichende Monoschicht oder stabile Doppelschicht. Dieses Verhalten hat wahrscheinlich die Zusammensetzungen – und vielleicht die biologische Relevanz – von DIBs in Modellmembranstudien eingeschränkt. Um dieses Problem anzugehen, wird ein experimentelles Protokoll vorgelegt, um das Ölreservoir, das DIB-Tröpfchen beherbergt, sorgfältig zu erwärmen und die Auswirkungen der Temperatur auf die Lipidmembran zu charakterisieren. Insbesondere zeigt dieses Protokoll, wie eine thermisch leitfähige Aluminiumhalterung und resistive Heizelemente, die durch eine Rückkopplungsschleife gesteuert werden, verwendet werden, um erhöhte Temperaturen vorzuschreiben, was die Monolayer-Montage und Diebesbildung für einen breiteren Satz von Lipidtypen verbessert. Die strukturellen Eigenschaften der Membran sowie die thermotropen Phasenübergänge der Lipide, die die Bilayer umfassen, werden durch Messung der Veränderungen der elektrischen Kapazität des DIB quantifiziert. Zusammen kann dieses Verfahren bei der Bewertung biophysikalischer Phänomene in Modellmembranen über verschiedene Temperaturen helfen, einschließlich der Bestimmung einer effektiven Schmelztemperatur (TM) für Mehrkomponenten-Lipidmischungen. Diese Fähigkeit wird somit eine engere Replikation natürlicher Phasenübergänge in Modellmembranen ermöglichen und die Bildung und Verwendung von Modellmembranen aus einem größeren Spektrum von Membranbestandteilen fördern, einschließlich derjenigen, die die Heterogenität ihrer zellulären Gegenstücke besser erfassen.
Zellmembranen sind selektiv durchlässige Barrieren, die aus Tausenden von Lipidtypen1,Proteinen, Kohlenhydraten und Sterolen bestehen, die alle lebenden Zellen verkapseln und unterteilen. Zu verstehen, wie ihre Zusammensetzungen ihre Funktionen beeinflussen, und zu zeigen, wie natürliche und synthetische Moleküle mit Zellmembranen interagieren, anhaften, stören und translozieren, sind daher wichtige Forschungsbereiche mit weitreichenden Implikationen in Biologie, Medizin, Chemie, Physik und Materialtechnik.
Diese Entdeckungsziele profitieren direkt von bewährten Techniken zur Montage, Manipulation und Untersuchung von Modellmembranen – einschließlich Lipid-Doppelschichten, die aus synthetischen oder natürlich vorkommenden Lipiden zusammengesetzt sind –, die die Zusammensetzung, Struktur und Transporteigenschaften ihrer zellulären Gegenstücke imitieren. In den letzten Jahren hat die Droplet-Schnittstelle Bilayer (DIB) Methode2,3,4 für den Bau einer planaren Lipid-Bilayer zwischen lipidbeschichteten Wassertröpfchen in Öl hat erhebliche Aufmerksamkeit erhalten5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, und hat praktische Vorteile gegenüber anderen Ansätzen für die Modellmembranbildung gezeigt: die DIB-Methode ist einfach durchzuführen, erfordert keine ausgeklügelte Herstellung oder Zubereitung (z. B. “Lackierung”) eines Substrats zur Unterstützung der Membran, liefert durchgängig Membranen mit überlegenen Langlebigkeit, ermöglicht Standard-Elektrophysiologie-Messungen und vereinfacht die Bildung von Modellmembranen mit asymmetrischen Packungsbeilage-Zusammensetzungen3. Da sich die Bilayer spontan zwischen Tröpfchen und jedem Tröpfchen in Position und Make-up maßgeschneidert werden können, Die DIB-Technik hat auch großes Interesse an der Entwicklung von zellinspirierten Materialsystemen geweckt, die auf der Verwendung von Reizen-responsiven Membranen18,24,25,26,27,28,29, ausgewogene Abschottung und Transport14,30,31, und gewebeähnliche Materialien17,23,32,33,34,35,36.
Die meisten veröffentlichten Experimente an Modellmembranen, einschließlich der er mit DIBs, wurden bei Raumtemperatur (RT, 20-25 °C) und mit einer Handvoll synthetischer Lipide (z. B. DOPC, DPhPC usw.) durchgeführt. Diese Praxis begrenzt den Umfang biophysikalischer Fragen, die in Modellmembranen untersucht werden können, und kann, basierend auf Beobachtung, auch die Arten von Lipiden einschränken, die zur Montage von DIBs verwendet werden können. Beispielsweise montiert ein synthetisches Lipid wie DPPC, das eine Schmelztemperatur von 42 °C hat, keine eng gepackten Monolayer oder bildet DIBs bei RT37. Die DIB-Bildung bei Raumtemperatur hat sich auch für natürliche Extrakte als schwierig erwiesen, z. B. von Säugetieren (z. B. Gehirn-Gesamtfettextrakt, BTLE)38 oder Bakterien (z.B. Escherichia coli Total LipidExtrakt, ETLE)37, die viele verschiedene Arten von Lipiden enthalten und von Zellen stammen, die bei erhöhten Temperaturen (37 °C) leben. Die Ermöglichung des Studiums unterschiedlicher Zusammensetzungen bietet somit die Möglichkeit, membranvermittelte Prozesse unter biologisch relevanten Bedingungen zu verstehen.
Die Erhöhung der Temperatur des Öls kann zwei Zwecken dienen: Es erhöht die Kinetik der Monolayer-Montage und es kann dazu führen, dass Lipide einen Schmelzübergang durchlaufen, um eine flüssige ungeordnete Phase zu erreichen. Beide Folgen helfen in der Monolayer-Baugruppe39, eine Voraussetzung für ein DIB. Neben der Erwärmung für die Bilayer-Bildung kann die Kühlung der Membran nach der Bildung verwendet werden, um thermotrope Übergänge in einzelnen Lipid-Doppelschichten38zu identifizieren, einschließlich derjenigen in natürlichen Lipidmischungen (z. B. BTLE), die mit Kalorimetrie schwer zu erkennen sind. Neben der Beurteilung thermotroper Lipidübergänge kann die Temperatur des DIB genau variieren, um temperaturinduzierte Veränderungen der Membranstruktur38 zu untersuchen und zu untersuchen, wie Lipidzusammensetzung und Fließfähigkeit die Kinetik membranaktiver Arten (z. B. porenbildende Peptide und Transmembranproteine37) beeinflussen, einschließlich Säugetier- und Bakterienmodellmembranen bei einer physiologisch relevanten Temperatur (37 °C).
Hierin wird eine Beschreibung der Montage eines modifizierten DIB-Ölbehälters und des Betriebs eines Rückkopplungs-Temperaturreglers erläutert, um die Monolayer-Montage und Bilayer-Bildung bei Temperaturen über RT zu ermöglichen. Von einem früheren Protokoll40unterscheidet, sind explizite Details über die Integration von Instrumenten enthalten, die für die Messung und Regelung der Temperatur parallel zur Montage und Charakterisierung des DIB im Ölreservoir erforderlich sind. Das Verfahren wird es dem Anwender somit ermöglichen, diese Methode zur Bildung und Untersuchung von DIBs über einen Temperaturbereich in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Kontexten anzuwenden. Darüber hinaus liefern die repräsentativen Ergebnisse spezifische Beispiele für die Arten messbarer Veränderungen sowohl in der Membranstruktur als auch im Ionentransport, die bei unterschiedlicher Temperatur auftreten können. Diese Techniken sind wichtige Ergänzungen zu den vielen biophysikalischen Studien, die effektiv in DIBs entworfen und durchgeführt werden können, einschließlich der Untersuchung der Kinetik membranaktiver Arten in verschiedenen Membranzusammensetzungen.
Das hier beschriebene Protokoll enthält Anweisungen für die Montage und den Betrieb eines experimentellen Systems zur Steuerung der Temperatur des Öls und der Tröpfchen, die zur Bildung von DIBs verwendet werden. Es ist besonders vorteilhaft für die Aktivierung der DIB-Bildung mit Lipiden, die Schmelztemperaturen über RT haben. Darüber hinaus kann durch präzise Variation der Temperatur des Ölreservoirs die Doppelschichttemperatur manipuliert werden, um die Auswirkungen erhöhter Temperaturen auf verschiedene Mem…
The authors have nothing to disclose.
Finanzielle Unterstützung wurde durch den National Science Foundation Grant CBET-1752197 und das Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213 gewährt.
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) | Any | Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope | |
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) | Any | Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements. | |
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid | Sigma Aldrich | M3183 | Buffering agent for lipid solution |
Acrylic substrate | Fabricated in house | HTD_STG_2 | ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation |
Aluminum fixture | Fabricated in house | HTD_STG_1 | Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements |
Brain Total Lipid Extract | Avanti | 131101C-100mg | 25 mg/mL porcine lipid extract |
Compact DAQ Chassis (cDAQ) | National Instruments | cDAQ-9174 | Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules |
Data Acquisition System (DAQ) | Molecular Devices | Digidata 1440A | High resolution analog to digital converter |
Fixed gain amplifier/power supply | Hewlitt Packard | HP 6826A | Amplifies DC voltage output from the voltage output module |
Glass Cover Slip | Corning | CLS284525 | Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer |
Heating element (x2) | Omega | KHLV-101/5 | 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. |
M3 Stainless Steel Screw | McMaster Carr | 90116A150 | Secures thermocouple to aluminum fixture |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices | AxoPatch 200B | Measures current and outputs voltage to the headstage |
Personal computer | Any | Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | Electrolyte solution of dissociated ions |
Temperature input module | National Instruments | NI 9211 | Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis |
Thermocouple | Omega | JMTSS-020U-6 | U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length |
UV Curable Adhesive | Loctite | 19739 | Secures glass coverslip to aluminum base fixture |
Voltage output module | National Instruments | NI 9263 | Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis |
Waveform generator | Agilent | 33210A | Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform |