Summary

Temperaturgesteuerte Montage und Charakterisierung eines Droplet Interface Bilayers

Published: April 19, 2021
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines temperaturgesteuerten Wärmesystems zur Förderung der Lipid-Monolayer-Montage und der Tröpfchen-Schnittstellen-Bilayerbildung für Lipide mit erhöhten Schmelztemperaturen und Kapazitätsmessungen zur Charakterisierung temperaturgetriebener Veränderungen in der Membran.

Abstract

Die Droplet Interface Bilayer (DIB)-Methode zur Montage von Lipid-Doppelschichten (d.h. DIBs) zwischen lipidbeschichteten wässrigen Tröpfchen in Öl bietet im Vergleich zu anderen Methoden wichtige Vorteile: DIBs sind stabil und oft langlebig, bilayerBereich kann reversibel abgestimmt werden, Prospektasymmetrie wird leicht über Tröpfchenzusammensetzungen gesteuert und gewebeähnliche Netzwerke von Doppeltöten können durch angrenzende. Die Bildung von DIBs erfordert eine spontane Montage von Lipiden in hochdichte Lipidmonolayer an den Oberflächen der Tröpfchen. Während dies bei gemeinsamen synthetischen Lipiden leicht bei Raumtemperatur vorkommt, bildet sich bei Lipiden mit Schmelzpunkten oberhalb der Raumtemperatur, einschließlich einiger zellulärer Lipidextrakte, keine ausreichende Monoschicht oder stabile Doppelschicht. Dieses Verhalten hat wahrscheinlich die Zusammensetzungen – und vielleicht die biologische Relevanz – von DIBs in Modellmembranstudien eingeschränkt. Um dieses Problem anzugehen, wird ein experimentelles Protokoll vorgelegt, um das Ölreservoir, das DIB-Tröpfchen beherbergt, sorgfältig zu erwärmen und die Auswirkungen der Temperatur auf die Lipidmembran zu charakterisieren. Insbesondere zeigt dieses Protokoll, wie eine thermisch leitfähige Aluminiumhalterung und resistive Heizelemente, die durch eine Rückkopplungsschleife gesteuert werden, verwendet werden, um erhöhte Temperaturen vorzuschreiben, was die Monolayer-Montage und Diebesbildung für einen breiteren Satz von Lipidtypen verbessert. Die strukturellen Eigenschaften der Membran sowie die thermotropen Phasenübergänge der Lipide, die die Bilayer umfassen, werden durch Messung der Veränderungen der elektrischen Kapazität des DIB quantifiziert. Zusammen kann dieses Verfahren bei der Bewertung biophysikalischer Phänomene in Modellmembranen über verschiedene Temperaturen helfen, einschließlich der Bestimmung einer effektiven Schmelztemperatur (TM) für Mehrkomponenten-Lipidmischungen. Diese Fähigkeit wird somit eine engere Replikation natürlicher Phasenübergänge in Modellmembranen ermöglichen und die Bildung und Verwendung von Modellmembranen aus einem größeren Spektrum von Membranbestandteilen fördern, einschließlich derjenigen, die die Heterogenität ihrer zellulären Gegenstücke besser erfassen.

Introduction

Zellmembranen sind selektiv durchlässige Barrieren, die aus Tausenden von Lipidtypen1,Proteinen, Kohlenhydraten und Sterolen bestehen, die alle lebenden Zellen verkapseln und unterteilen. Zu verstehen, wie ihre Zusammensetzungen ihre Funktionen beeinflussen, und zu zeigen, wie natürliche und synthetische Moleküle mit Zellmembranen interagieren, anhaften, stören und translozieren, sind daher wichtige Forschungsbereiche mit weitreichenden Implikationen in Biologie, Medizin, Chemie, Physik und Materialtechnik.

Diese Entdeckungsziele profitieren direkt von bewährten Techniken zur Montage, Manipulation und Untersuchung von Modellmembranen – einschließlich Lipid-Doppelschichten, die aus synthetischen oder natürlich vorkommenden Lipiden zusammengesetzt sind –, die die Zusammensetzung, Struktur und Transporteigenschaften ihrer zellulären Gegenstücke imitieren. In den letzten Jahren hat die Droplet-Schnittstelle Bilayer (DIB) Methode2,3,4 für den Bau einer planaren Lipid-Bilayer zwischen lipidbeschichteten Wassertröpfchen in Öl hat erhebliche Aufmerksamkeit erhalten5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, und hat praktische Vorteile gegenüber anderen Ansätzen für die Modellmembranbildung gezeigt: die DIB-Methode ist einfach durchzuführen, erfordert keine ausgeklügelte Herstellung oder Zubereitung (z. B. “Lackierung”) eines Substrats zur Unterstützung der Membran, liefert durchgängig Membranen mit überlegenen Langlebigkeit, ermöglicht Standard-Elektrophysiologie-Messungen und vereinfacht die Bildung von Modellmembranen mit asymmetrischen Packungsbeilage-Zusammensetzungen3. Da sich die Bilayer spontan zwischen Tröpfchen und jedem Tröpfchen in Position und Make-up maßgeschneidert werden können, Die DIB-Technik hat auch großes Interesse an der Entwicklung von zellinspirierten Materialsystemen geweckt, die auf der Verwendung von Reizen-responsiven Membranen18,24,25,26,27,28,29, ausgewogene Abschottung und Transport14,30,31, und gewebeähnliche Materialien17,23,32,33,34,35,36.

Die meisten veröffentlichten Experimente an Modellmembranen, einschließlich der er mit DIBs, wurden bei Raumtemperatur (RT, 20-25 °C) und mit einer Handvoll synthetischer Lipide (z. B. DOPC, DPhPC usw.) durchgeführt. Diese Praxis begrenzt den Umfang biophysikalischer Fragen, die in Modellmembranen untersucht werden können, und kann, basierend auf Beobachtung, auch die Arten von Lipiden einschränken, die zur Montage von DIBs verwendet werden können. Beispielsweise montiert ein synthetisches Lipid wie DPPC, das eine Schmelztemperatur von 42 °C hat, keine eng gepackten Monolayer oder bildet DIBs bei RT37. Die DIB-Bildung bei Raumtemperatur hat sich auch für natürliche Extrakte als schwierig erwiesen, z. B. von Säugetieren (z. B. Gehirn-Gesamtfettextrakt, BTLE)38 oder Bakterien (z.B. Escherichia coli Total LipidExtrakt, ETLE)37, die viele verschiedene Arten von Lipiden enthalten und von Zellen stammen, die bei erhöhten Temperaturen (37 °C) leben. Die Ermöglichung des Studiums unterschiedlicher Zusammensetzungen bietet somit die Möglichkeit, membranvermittelte Prozesse unter biologisch relevanten Bedingungen zu verstehen.

Die Erhöhung der Temperatur des Öls kann zwei Zwecken dienen: Es erhöht die Kinetik der Monolayer-Montage und es kann dazu führen, dass Lipide einen Schmelzübergang durchlaufen, um eine flüssige ungeordnete Phase zu erreichen. Beide Folgen helfen in der Monolayer-Baugruppe39, eine Voraussetzung für ein DIB. Neben der Erwärmung für die Bilayer-Bildung kann die Kühlung der Membran nach der Bildung verwendet werden, um thermotrope Übergänge in einzelnen Lipid-Doppelschichten38zu identifizieren, einschließlich derjenigen in natürlichen Lipidmischungen (z. B. BTLE), die mit Kalorimetrie schwer zu erkennen sind. Neben der Beurteilung thermotroper Lipidübergänge kann die Temperatur des DIB genau variieren, um temperaturinduzierte Veränderungen der Membranstruktur38 zu untersuchen und zu untersuchen, wie Lipidzusammensetzung und Fließfähigkeit die Kinetik membranaktiver Arten (z. B. porenbildende Peptide und Transmembranproteine37) beeinflussen, einschließlich Säugetier- und Bakterienmodellmembranen bei einer physiologisch relevanten Temperatur (37 °C).

Hierin wird eine Beschreibung der Montage eines modifizierten DIB-Ölbehälters und des Betriebs eines Rückkopplungs-Temperaturreglers erläutert, um die Monolayer-Montage und Bilayer-Bildung bei Temperaturen über RT zu ermöglichen. Von einem früheren Protokoll40unterscheidet, sind explizite Details über die Integration von Instrumenten enthalten, die für die Messung und Regelung der Temperatur parallel zur Montage und Charakterisierung des DIB im Ölreservoir erforderlich sind. Das Verfahren wird es dem Anwender somit ermöglichen, diese Methode zur Bildung und Untersuchung von DIBs über einen Temperaturbereich in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Kontexten anzuwenden. Darüber hinaus liefern die repräsentativen Ergebnisse spezifische Beispiele für die Arten messbarer Veränderungen sowohl in der Membranstruktur als auch im Ionentransport, die bei unterschiedlicher Temperatur auftreten können. Diese Techniken sind wichtige Ergänzungen zu den vielen biophysikalischen Studien, die effektiv in DIBs entworfen und durchgeführt werden können, einschließlich der Untersuchung der Kinetik membranaktiver Arten in verschiedenen Membranzusammensetzungen.

Protocol

1. Beheizte Vorrichtungsvorbereitung Sammeln Sie 2 Stück von 1 mm dicken isolierenden Gummi auf 25 mm x 40 mm in der Breite und Länge getrimmt, 2 Stück eines 6 mm dicken Gummis, die auch 25 mm x 40 mm sind, eine vorbereitete Aluminium-Basisbefestigung und ein Acrylölreservoir, das in das Sichtfenster der Aluminium-Basishalterung passt (siehe Abbildungen S1, S2 und S3 für Details zur Fertigung und eine explosionsartige Ansicht der Montage). Bereiten Sie die Aluminiumhalterung zuerst vor, in…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt, wie die Aluminiumhalterung und das Acrylölreservoir auf der Mikroskopbühne auf die DIB-Bildung vorbereitet werden. Die Montageschritte 1.2-1.4 dienen dazu, die Leuchte von der Bühne für eine effizientere Erwärmung wärmezudämmen. Die Schritte 1.5-1.7 zeigen, wie das Thermoelement richtig an der Halterung befestigt und das Ölreservoir positioniert wird, und die Schritte 1.8 -1.9 zeigen empfohlene Orte für die Ölabgabe in diese Teile an. …

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll enthält Anweisungen für die Montage und den Betrieb eines experimentellen Systems zur Steuerung der Temperatur des Öls und der Tröpfchen, die zur Bildung von DIBs verwendet werden. Es ist besonders vorteilhaft für die Aktivierung der DIB-Bildung mit Lipiden, die Schmelztemperaturen über RT haben. Darüber hinaus kann durch präzise Variation der Temperatur des Ölreservoirs die Doppelschichttemperatur manipuliert werden, um die Auswirkungen erhöhter Temperaturen auf verschiedene Mem…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finanzielle Unterstützung wurde durch den National Science Foundation Grant CBET-1752197 und das Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213 gewährt.

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform

Referenzen

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).

View Video