Summary

Retrograde Ohrspeicheldrüseninfusion durch Stensen-Kanal in einem nicht-menschlichen Primaten für vektorierte Genabgabe

Published: August 12, 2021
doi:

Summary

Speicheldrüsen wurden als Gewebezielstelle für die Gentherapie vorgeschlagen, insbesondere im Bereich der Impfung durch Gentransfer. Wir demonstrieren die Genabgabe in einem nicht-menschlichen Primatenmodell mit retrograder Ohrspeicheldrüseninfusion.

Abstract

Speicheldrüsen sind ein attraktives Gewebeziel für die Gentherapie mit vielversprechenden Ergebnissen, die bereits zu Studien am Menschen führen. Sie sind von Natur aus in der Lage, Proteine in den Blutkreislauf zu sezernieren und sind leicht zugänglich, was sie potenziell überlegene Gewebestellen für die Ersatzhormonproduktion oder Impfung durch Gentransfer macht. Vorgeschlagene Methoden für die Genabgabe umfassen die transkutane Injektion und die retrograde Infusion durch Speichelgänge. Wir zeigen, wie retrograde Speicheldrüseninfusion (RSGI) bei nicht-menschlichen Primaten durchgeführt wird. Wir beschreiben die wichtigen anatomischen Orientierungspunkte, einschließlich der Identifizierung der Ohrspeicheldrüsenpapille, einer atraumatischen Methode zum Kanülieren und Versiegeln des Stensen-Kanals unter Verwendung grundlegender zahnärztlicher Werkzeuge, Polyethylenschläuche und Cyanacrylat sowie der entsprechenden Infusionsrate. Während dies die am wenigsten traumatische Methode der Entbindung ist, ist die Methode immer noch durch das Volumen begrenzt, das abgegeben werden kann (<0,5 ml) und das Potenzial für ein Trauma des Kanals und der Drüse. Wir zeigen mit Hilfe der Fluoroskopie, dass ein Infusat vollständig in die Drüse abgegeben werden kann, und zeigen durch Immunhistochemie die Transduktion eines typischen Vektors und die Expression des gelieferten Gens.

Introduction

Während Speicheldrüsen für ihre exokrine Speichelproduktion bekannt sind, haben Forscher seit langem ihre Fähigkeit erkannt, Proteine direkt in den Blutkreislauf 1 abzusondern, was sie zueinempotenziellen Ziel für die Gentherapie zur systemischen Verabreichung macht, wie Ersatzhormone oder Antikörperproduktion. Tatsächlich bieten Speicheldrüsen mehrere Vorteile gegenüber anderen Gewebezielen, wie die inhärente Fähigkeit, Proteine für die Sekretion zu produzieren (eine Eigenschaft, die Muskeln fehlt), eine starke Verkapselung, die die Vektordiffusion begrenzen kann, und gut differenziertes Gewebe, das Stabilität für nicht integrierende Vektoren bietet. Darüber hinaus sind Speicheldrüsen im Falle eines schwerwiegenden unerwünschten Ereignisses nicht lebenskritisch und können operativ entfernt werden. Obwohl nicht sofort intuitiv, sind Ohrspeicheldrüsen auch leicht vom Mund durch ihren Hauptausscheidungsgang, Stensens Duct2,zugänglich.

Angesichts der Vorteile von Speichelgewebe für die Gentherapie steigt das Interesse an der Erforschung dieses Gewebeziels. Zahlreiche Studien wurden bereits in Nagetier-, Hunde- und nicht-menschlichen Primatenmodellen durchgeführt, und mindestens eine klinische Studie am Menschen ist im Gange3,4,5. Um den Nutzen dieses Gewebeziels für Gentherapiezwecke weiter zu erforschen und zu entwickeln, müssen weitere nicht-menschliche Primatenstudien durchgeführt werden. Dieser Artikel beschreibt eine Methode für den Zugang zu den Ohrspeicheldrüsen durch Stensens Kanal, um ein vektoriertes Gen für die Transduktion im nicht-menschlichen Primatenmodell zu liefern. Um die Abgabe des Infusats und die Anatomie des Kanals beim Eintritt in die Drüse sichtbar zu demonstrieren, wurde eine Durchleuchtung mit Radiokontrast durchgeführt. Um eine erfolgreiche Transduktion eines Vektors nachzuweisen, wurde ein Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) vektorisiertes egfp-Gen verwendet. Ad5 ist ein gut beschriebener Vektor, der in der Lage ist, Speichelgewebe zu transduzieren. Obwohl es für den endgültigen klinischen Einsatz zu immunogen ist, wurde für diese Demonstrationsstudie ein Ad5-Vektor ausgewählt, um eine effiziente Transduktion zu gewährleisten. Die Evaluierung der Produktion von Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) ist eine gut beschriebene Methode zum Nachweis der erfolgreichen Transkription und Translation eines vektorisierten Gens nach der Transduktion und wurde hier durchgeführt.

Protocol

Alle Verfahren wurden an der Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus für Tierversuche durchgeführt. Das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) wurde aus ethischen Gründen konsultiert und Details der Verfahren wurden zur Überprüfung vorgelegt. Wake Forest IACUC genehmigte unser Studienprotokoll und alle Verfahren wurden unter dem von der IACUC genehmigten Protokoll #A17-147 durchgeführt. 1. Vorbereitung der Infusionsvorrichtung Größe 10 Polyethylenrohr (PET…

Representative Results

Erfolgreiches Verfahren, Transduktion und TranskriptionAbbildung 1 zeigt die Ohrspeicheldrüsenpapille neben dem2. Backenzahn auf der hinteren oberen Wange. Das Bild zeigt auch die korrekte Platzierung der Mundorthese, ein Gummiende am harten Gaumen und das andere Gummiende am ipsilateralen Hund. Abbildung 2 zeigt ein Bild, das nach erfolgreicher Kanulation der Ohrspeicheldrüsenpapille an der 2-cm-Markierung auf dem PET10 aufgeno…

Discussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll der retrograden Infusion in die Ohrspeicheldrüse durch Stensens Gang. Die beschriebene Methodik bietet eine Anleitung, die möglicherweise von Forschern verwendet werden kann, die den Nutzen von Speichelgewebe als Ort für Gentherapie und andere Anwendungen untersuchen.

Es gibt mehrere kritische Schritte, um den Erfolg des Verfahrens sicherzustellen. In erster Linie sollten alle Verfahrensschritte schonend abgeschlossen werden. Eine kräftige Versteifung des…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Herrn Cagney Gentry für seine audiovisuelle Unterstützung bei den Dreharbeiten. Wir möchten auch das Hefner VA Medical Center für die akademische Unterstützung bei der Verfolgung dieses Projekts anerkennen.

Materials

500 µL U100 syringes with 30-gauge needles Becton Dickinson 328466 fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) Various Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution Patterson Veterinary 07 869-6061 Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G Walmart N/A Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue) Ethicon DNX12 Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light Amazon (DDP) B012M3IV80 Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator Surgipro SPOI-137
Ketamine injectable solution Patterson Veterinary 07-803-6637 Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator Surgipro SPOI-132 Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution Patterson Veterinary 07 890-6698 Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors Amazon (DDP) N/A Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10) Scientific Comodities, Inc BB31695-PE/1 Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips Walmart N/A Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) Scientific Commodities BB31695-PE/1 low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener Amazon (DDP) B01F3LVJXC Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers Amazon (DDP) N/A Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 7646-86-7 Included in plasmid DNA infusates

Referenzen

  1. Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
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  10. Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).

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Diesen Artikel zitieren
El Helou, G., Goodman, J. F., Blevins, M., Caudell, D. L., Ponzio, T. A., Sanders, J. W. Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen’s Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery. J. Vis. Exp. (174), e62645, doi:10.3791/62645 (2021).

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