Summary

Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Published: January 05, 2022
doi:

Summary

Hier wird ein Ansatz für die intravitale Langzeitbildgebung mit optisch klaren Silikonfenstern vorgestellt, die direkt auf das interessierende Gewebe/Organ und die Haut geklebt werden können. Diese Fenster sind billiger und vielseitiger als andere, die derzeit im Feld verwendet werden, und das chirurgische Einführen verursacht begrenzte Entzündungen und Leiden bei den Tieren.

Abstract

Die intravitale Mikroskopie (IVM) ermöglicht die Visualisierung von Zellbewegung, -teilung und -tod bei Einzelzellauflösung. IVM durch chirurgisch eingesetzte Bildgebungsfenster ist besonders leistungsfähig, da es die Längsmessung desselben Gewebes über Tage bis Wochen ermöglicht. Typische Bildfenster bestehen aus einem Glasdeckglas in einem biokompatiblen Metallrahmen, der an der Haut der Maus vernäht ist. Diese Fenster können die freie Bewegung der Mäuse beeinträchtigen, eine starke Entzündungsreaktion hervorrufen und aufgrund von Glasscherben oder zerrissenen Nähten versagen, von denen jede Euthanasie erfordern kann. Um diese Probleme anzugehen, wurden Fenster für die langfristige Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen aus einem dünnen Film aus Polydimethylsiloxan (PDMS) entwickelt, einem optisch klaren Silikonpolymer, das zuvor für kraniale Bildgebungsfenster verwendet wurde. Diese Fenster können direkt auf das Gewebe geklebt werden, wodurch die Zeit für das Einführen reduziert wird. PDMS ist flexibel und trägt im Laufe der Zeit zu seiner Haltbarkeit bei Mäusen bei – es wurden bis zu 35 Tage getestet. Längsschnittbildgebung ist die Bildgebung derselben Geweberegion während separater Sitzungen. Ein Edelstahlgitter wurde in die Fenster eingebettet, um die gleiche Region zu lokalisieren, was die Visualisierung dynamischer Prozesse (wie die Involution der Brustdrüse) an den gleichen Stellen im Abstand von Tagen ermöglicht. Dieses Silikonfenster ermöglichte auch die Überwachung einzelner disseminierter Krebszellen, die sich im Laufe der Zeit zu Mikrometastasen entwickelten. Die in dieser Studie verwendeten Silikonfenster sind einfacher einzusetzen als metallgerahmte Glasfenster und verursachen eine begrenzte Entzündung des abgebildeten Gewebes. Darüber hinaus ermöglichen eingebettete Gitter eine einfache Verfolgung derselben Geweberegion in wiederholten Bildgebungssitzungen.

Introduction

Die intravitale Mikroskopie (IVM), die Bildgebung von Geweben bei betäubten Tieren, bietet Einblicke in die Dynamik physiologischer und pathologischer Ereignisse bei zellulärer Auflösung in intaktem Gewebe. Die Anwendungen dieser Technik sind sehr unterschiedlich, aber IVM war im Bereich der Krebsbiologie von entscheidender Bedeutung, um aufzuklären, wie Krebszellen in Gewebe eindringen und metastasieren, mit der umgebenden Mikroumgebung interagieren und auf Medikamente reagieren 1,2,3. Darüber hinaus war IVM der Schlüssel zum besseren Verständnis der komplexen Mechanismen, die Immunantworten steuern, indem es Erkenntnisse lieferte, die Ex-vivo-Profiling-Ansätze (z. B. Durchflusszytometrie) ergänzten. Zum Beispiel haben intravitale Bildgebungsexperimente Details über Immunfunktionen in Bezug auf Zellmigration und Zell-Zell-Kontakt enthüllt und eine Plattform zur Quantifizierung der raumzeitlichen Dynamik als Reaktion auf Verletzungen oder Infektionengeboten 4,5,6,7. Viele dieser Prozesse können auch durch histologische Färbung untersucht werden, aber nur IVM ermöglicht die Verfolgung dynamischer Veränderungen. Während ein histologischer Abschnitt eine Momentaufnahme des Gewebes zu einem bestimmten Zeitpunkt bietet, kann die intravitale Bildgebung interzelluläre und subzelluläre Ereignisse innerhalb desselben Gewebes im Laufe der Zeit verfolgen. Insbesondere Fortschritte bei der Fluoreszenzmarkierung und die Entwicklung molekularer Reporter haben es ermöglicht, molekulare Ereignisse mit zellulärem Verhalten wie Proliferation, Tod, Motilität und Interaktion mit anderen Zellen oder der extrazellulären Matrix zu korrelieren. Die meisten IVM-Techniken basieren auf der Fluoreszenzmikroskopie, die aufgrund der Lichtstreuung die Abbildung tieferer Gewebe schwierig macht. Das interessierende Gewebe muss daher oft mit einem oft invasiven und terminalen Verfahren operativ exponiert werden. So kann das Gewebe je nach Organstelle kontinuierlich für einen Zeitraum von wenigen bis 40 h8 abgebildet werden. Alternativ ermöglicht das chirurgische Einsetzen eines permanenten Bildgebungsfensters die sequentielle Abbildung desselben Gewebes über einen Zeitraum von Tagen bis Wochen 7,9.

Die Entwicklung neuer Bildgebungsfenster wurde als technologischer Bedarf zur weiteren Verbesserung intravitaler Bildgebungsansätzehervorgehoben 10. Das prototypische intravitale Bildgebungsfenster ist ein Metallring, der einen Glasdeckel enthält, der mit Nähten11 auf der Haut befestigt ist. Störungen der Bewegungsfreiheit, die Ansammlung von Exsudat und Schäden am Glasdeckglas sind häufige Probleme bei der Verwendung solcher Fenster. Darüber hinaus erfordert das prototypische Fenster eine spezielle Produktion, und der chirurgische Eingriff kann eine umfangreiche Schulung erfordern. Um diese Probleme anzugehen, wurde Polydimethylsiloxan (PDMS), ein Silikonpolymer, das zuvor in Schädelfenstern für die Langzeitbildgebung im Gehirn verwendet wurde12, für den Einsatz in der Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen angepasst. Hier wird eine detaillierte Methode zur Erzeugung von PDMS-basierten Silikonfenstern vorgestellt, einschließlich der Frage, wie das Fenster um ein Edelstahlgitter gegossen wird, um Landmarken für die wiederholte Abbildung derselben Geweberegionen bereitzustellen. Weiterhin wird ein einfacher, stichfreier Operationsablauf zum Einführen des Fensters über Bauchorgane oder die Brustdrüse beschrieben. Dieser neue Ansatz überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern und erhöht die Zugänglichkeit der intravitalen Längsbildgebung.

Protocol

Alle beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den chirurgischen Richtlinien des Cold Spring Harbor Laboratory durchgeführt und waren vom Institutional Animal Care and Use Committee des Cold Spring Harbor Laboratory genehmigt worden. 1. Gießen des Silikonfensters Bereiten Sie das Silikonpolymer (PDMS) vor, indem Sie das Basiselastomer und den Härter im Verhältnis 10:1 (v/v) mischen. Gießen Sie ein Fenster, indem Sie eine kleine Menge PDMS…

Representative Results

Die intravitale Bildgebung durch Bildgebungsfenster kann verwendet werden, um eine breite Palette von zellulären und molekularen Ereignissen mit Einzelzellauflösung über einen Zeitraum von Stunden bis Wochen zu beobachten, zu verfolgen und zu quantifizieren. Zu den idealen Merkmalen für ein Bildgebungsfenster gehören: a) begrenzte Auswirkungen auf das Wohlbefinden der Maus und die Physiologie des Gewebes; b) Haltbarkeit; c) Einfachheit des Einfügens; und d) Freie Landmarken für wiederholte Bildgebung derselben Reg…

Discussion

Intravitale Bildgebungsfenster sind wichtige Werkzeuge, um physiologische und pathologische Prozesse in zellulärer Auflösung direkt sichtbar zu machen, während sie sich im Laufe der Zeit entfalten. Das neuartige Verfahren zum Gießen und Einsetzen flexibler Silikonbildgebungsfenster in Mäuse überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern (Exsudat, Bruch und Störung der normalen Mobilität), bietet zusätzliche Sicherheit für die Maus und erhöht die Zugänglichkeit dieser Te…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Rob Eifert für seine Unterstützung bei der Konstruktion und Optimierung der lasergeschnittenen Edelstahlgitter. Diese Arbeit wurde vom CSHL Cancer Center (P30-CA045508) und Mitteln für M.E. von den National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 und 5P01CA013106-49) unterstützt; CSHL und Northwell Health; die Thompson Family Foundation; Schwimmen Sie durch Amerika; und ein Stipendium der Simons Foundation an CSHL. M.S. wurde vom National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) und dem National Cancer Institute des NIH unter der Preisnummer 1F30CA253993-01 unterstützt. L.M. wird durch ein James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship unterstützt. J.M.A. erhielt ein Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. wird von der Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research und der Thompson Family Foundation unterstützt. Cartoons wurden mit Biorender.com erstellt.

Materials

3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape 3M 70200770819
Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 Ethicon  N267H
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) Vector Laboratories  SK-4200
Alcohol swabs BD  326895
Anesthesia system Molecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software and sensors  BIOPAC ACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray  LORIS 109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) mice Jackson Laboratory 18549
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) Invitrogen 14-0451-82
CD68 Antibody Abcam ab125212
Curity gauze sponges  Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)  Abcam ab6885
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab97064
Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP)  Abcam ab102182
Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear Electron Microscopy Sciences 24236-10 Two-part, 10:1 mixing ratio
Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness  Electron Microscopy Sciences 72296-08
Ender-3 Pro 3D printer Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Far Infrared Heated blanket Kent Scientific RT-0520
Fc Receptor Blocker Innovex Biosciences NB309
Fiji imaging processing package https://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) Invitrogen F8795
Gating system: BIOPAC Systems Inc. The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems.
Acqknowledge software  ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Module, C Series  DA100C
Dual Gating Sys small animal DTU200 
MP160 for Windows – Analysis system MP160WSW 
MouseOx Plus 120V  MOX-120V;015000 
Pressure Pad  TSD110 
Gelfoam Pfizer 9031508 Absorbable gelatin sponge
Hardened fine scissors Fine Science Tools 14090-11 Two pairs; stainless steel, sharp-sharp
tips, straight tip, 26 mm
cutting edge, 11 cm length
Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody R&D Systems AF3667
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn on approximately 30 min
before use; sterilize tools at >200
°C for 30 s
Imaris  Bitplane www.bitplane.com
Immersion medium Immersol W 2010 Zeiss 444969-0000-000 
Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc BD 324912
Isoflurane (Fluriso) VetOne 502017
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 Vector Laboratories  DL-1177-1
LysM-eGFP mice www.mmrrc.org 012039-MU
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135 Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length
Micro dissecting forceps Roboz RS-5153 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip
width, 4" length
MTS MiniBionix II 808 MTS Systems Servohydraulic material testing machine
Neutrophil Elastase 680 FAST probe PerkinElmer NEV11169
Nitrogen General Welding Supply Corp.
Oxygen General Welding Supply Corp.
Polylactic acid filament Hatchbox 1.75 mm diameter
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen P36970
Puralube ophthalmic ointment Dechra  NDC17033-211-38
Reflex 7 wound clips Roboz Surgical RS-9255
Stainless steel grid Fotofab One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square.  
Surface Treated SterileTissue Culture Plates Fisher Scientific FB012929 Lid used as curing surface for imaging windows
TriM Scope Multiphoton Microscope  LaVision BioTec Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond 3M 70200742529
VWR micro cover glass VWR 48404-453

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Maiorino, L., Shevik, M., Adrover, J. M., Han, X., Georgas, E., Wilkinson, J. E., Seidner, H., Foerschner, L., Tuveson, D. A., Qin, Y., Egeblad, M. Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows. J. Vis. Exp. (179), e62757, doi:10.3791/62757 (2022).

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