Summary

Tiefe und räumlich kontrollierte Volumenablationen mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop in der Zebrafisch-Gastrula

Published: July 15, 2021
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Summary

Die Embryonalentwicklung erfordert eine groß angelegte Koordination der Zellbewegung. Die durch Zwei-Photonen-Anregung vermittelte Laserablation ermöglicht die räumlich kontrollierte 3-dimensionale Ablation großer Gruppen tiefer Zellen. Darüber hinaus kann diese Technik die Reaktion kollektiv wandernder Zellen in vivo auf Störungen in ihrer mechanischen Umgebung untersuchen.

Abstract

Die Morphogenese beinhaltet viele Zellbewegungen, um Zellen in Geweben und Organen zu organisieren. Für eine ordnungsgemäße Entwicklung müssen all diese Bewegungen eng koordiniert werden, und sich häufende Beweise deuten darauf hin, dass dies zumindest teilweise durch mechanische Wechselwirkungen erreicht wird. Dies im Embryo zu testen, erfordert direkte körperliche Störungen. Laserablationen sind eine zunehmend eingesetzte Option, die es ermöglicht, mechanische Einschränkungen zu lindern oder zwei Zellpopulationen physisch voneinander zu isolieren. Viele Ablationen werden jedoch mit einem ultravioletten (UV) Laser durchgeführt, der eine begrenzte axiale Auflösung und Gewebepenetration bietet. Hier wird eine Methode beschrieben, um tiefe, signifikante und räumlich wohldefinierte Volumina mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop abzutragen. Ablationen werden in einer transgenen Zebrafischlinie demonstriert, die das grün fluoreszierende Protein im axialen Mesendoderm exprimiert und verwendet wird, um das axiale Mesendoderm zu durchtrennen, ohne das darüber liegende Ektoderm oder die darunter liegende Dotterzelle zu beeinflussen. Das Zellverhalten wird durch Live-Bildgebung vor und nach der Ablation überwacht. Das Ablationsprotokoll kann in verschiedenen Entwicklungsstadien, auf jedem Zelltyp oder Gewebe, in Skalen von wenigen Mikrometern bis zu mehr als hundert Mikrometern verwendet werden.

Introduction

Zell-Zell-Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung. Zellen liefern Signale, die ihre direkten Nachbarn oder weiter entfernte Zellen wahrnehmen können, wodurch ihr Schicksal und/oder Verhalten beeinflusst wird. Viele dieser Signale sind chemischer Natur. Zum Beispiel produziert eine Zellgruppe in den gut charakterisierten Induktionsereignissen diffusible Moleküle, die das Schicksal einer anderen Zellpopulation beeinflussen1. Andere Signale sind jedoch mechanisch; Zellen üben Kräfte und Einschränkungen auf ihre Nachbarn aus, die die Nachbarn wahrnehmen und auf die sie reagieren2.

Eine Möglichkeit, die Bedeutung dieser Zell-Zell-Interaktionen in vivo zu untersuchen, besteht darin, einige Zellen zu eliminieren und die nachfolgende Entwicklung zu beobachten. Leider sind die verfügbaren Techniken zum Entfernen oder Zerstören von Zellen begrenzt. Zellen können chirurgisch3,4 mit Nadeln oder kleinen Drähten entfernt werden, aber solche Behandlungen sind invasiv, nicht sehr präzise und werden normalerweise unter einem Stereomikroskop durchgeführt, wodurch eine sofortige Bildgebung unter einem Mikroskop verhindert wird. Darüber hinaus bedeutet das Targeting tiefer Zellen, ein Loch in darüber liegendes Gewebe zu stechen, wodurch unerwünschte Störungen entstehen. Genetisch kodierte Photosensibilisatoren wie KillerRed wurden verwendet, um den Zelltod durch Lichtbeleuchtung zu induzieren5. Photosensibilisatoren sind Chromophore, die bei Lichteinstrahlung reaktive Sauerstoffspezies erzeugen. Ihre Haupteinschränkung besteht darin, dass sie lange Lichtbeleuchtungen (etwa 15 Minuten) erfordern, die schwierig zu erreichen sind, wenn sich Zellen bewegen, und dass sie den Zelltod durch Apoptose induzieren, was nicht sofort der Fall ist.

Schließlich wurden Laserablationen entwickelt und in den letzten 15 Jahren weit verbreitet6,7,8,9,10,11,12. Ein Laserstrahl wird auf die Zielzelle/das Zielgewebe fokussiert. Es induziert seine Ablation durch Erhitzen, Photoablation oder plasmainduzierte Ablation; der involvierte Prozess hängt von der Leistungsdichte und der Belichtungszeit ab13. Die meisten Ablationsprotokolle verwenden UV-Laser für ihre hohe Energie. UV-Licht wird jedoch von biologischem Gewebe sowohl absorbiert als auch gestreut. Daher erfordert das Targeting tiefer Zellen eine hohe Laserleistung, die dann Schäden in oberflächlicheren Geweben außerhalb der Ebene induziert. Dies beschränkt den Einsatz von UV-Lasern auf oberflächliche Strukturen und erklärt ihre relativ geringe axiale Auflösung. Die nichtlineare Optik (sogenannte Zwei-Photonen-Mikroskopie) nutzt nichtlineare Eigenschaften des Lichts, um ein Fluorophor mit zwei Photonen von etwa halber Energie im Infrarotbereich anzuregen. Bei der Anwendung auf Ablationen hat dies drei Hauptvorteile. Erstens wird das Infrarotlicht weniger gestreut und weniger als UV-Licht von biologischen Geweben14 absorbiert, so dass tiefere Strukturen erreicht werden können, ohne die erforderliche Laserleistung zu erhöhen. Zweitens sorgt die Verwendung eines gepulsten Femtosekundenlasers für sehr hohe Leistungsdichten, wodurch eine Ablation durch Plasmainduktion entsteht, die im Gegensatz zur Erwärmung räumlich nicht diffundiert15. Drittens wird die Leistungsdichte, die die Plasmabildung induziert, nur am Brennpunkt erreicht. Dank dieser Eigenschaften können Zwei-Photonen-Laserablationen verwendet werden, um tiefe Zellen präzise anzugreifen, ohne die umgebende Gewebeumgebung zu beeinträchtigen.

Kollektive Migrationen sind ein hervorragendes Beispiel für Entwicklungsprozesse, bei denen Zell-Zell-Interaktionen grundlegend sind. Kollektive Migrationen sind definiert als Zellmigrationen, bei denen benachbarte Zellen das Verhalten einer Zelle beeinflussen16. Die Art dieser Wechselwirkungen (chemisch oder mechanisch) und wie sie die Zellmigration beeinflussen, kann stark variieren und ist oft nicht vollständig verstanden. Die Fähigkeit, Zellen zu entfernen und zu beobachten, wie sich dies auf die anderen auswirkt, ist entscheidend für die weitere Entschlüsselung dieser kollektiven Prozesse. Vor einigen Jahren haben wir – mit chirurgischen Ansätzen – festgestellt, dass die Migration der Polster während der Zebrafischgastrulation eine kollektive Migration ist17. Die Polster ist eine Gruppe von Zellen, die die ersten internalisierenden Zellen auf der dorsalen Seite des Embryos bildet18. Diese Zellen, die in der transgenen Linie Tg(gsc:GFP) grün markiert sind, befinden sich tief im Embryo, unter mehreren Schichten von Epiblastenzellen. Während der Gastrulation führt diese Gruppe die Ausdehnung des axialen Mesoderms an und wandert vom embryonalen Organizer zum Tierischen Pol19,20,21,22,23 (Abbildung 1A). Wir haben festgestellt, dass Zellen Kontakt zu ihren Nachbarn benötigen, um ihre Migration in Richtung des Tierpols auszurichten. Um die zellulären und molekularen Grundlagen dieser kollektiven Migration besser zu verstehen, müssen jedoch einige Zellen entfernt werden, um zu sehen, wie sich dies auf die verbleibenden auswirkt. Wir haben daher Ablationen von großen und tiefen Volumina mit einem Zwei-Photonen-Mikroskopie-Setup entwickelt. Hier demonstrieren wir die Verwendung dieses Protokolls, um die Polster in ihrer Mitte zu durchtrennen und die Folgen für die Zellmigration zu beobachten, indem wir mit Histone2B-mCherry markierte Kerne verfolgen.

Protocol

Alle Tierarbeiten wurden von der Ethikkommission N 59 und dem Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche unter dem Aktenzeichen APAFIS#15859-2018051710341011v3 genehmigt. Einige der unten beschriebenen Schritte sind spezifisch für unsere Ausrüstung und Software, können aber leicht an verschiedene Geräte angepasst werden. 1. Injektionsvorbereitung Bereiten Sie 75 ml 1% ige Agaroselösung in Embryo Medium (EM) vor. Legen Sie die I…

Representative Results

Um das Polster in seiner Mitte zu durchtrennen, wurde ein Tg(gsc:GFP) -Embryo, injiziert mit Histone2B-mCherry mRNAs, im 70%igen Epiboly-Stadium montiert, wie in Schritt 4 beschrieben. Das Polster wurde durch GFP-Expression identifiziert, und der Embryo wurde so montiert, dass die Ebene des Polsters senkrecht zur optischen Achse steht (Abbildung 1B). Das Kippen des Embryos aus dieser Position erschwert das Verfahren. Das Licht muss durch mehr Gewebe gehen, um die Ablationsebenen zu …

Discussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das nichtlineare Optik verwendet, um tiefe und räumlich gut definierte Volumenablationen durchzuführen. Der kritischste Schritt des Protokolls besteht darin, Behandlungsbedingungen zu finden, die genügend Energie liefern, um Ablationen zu ermöglichen, aber nicht zu viel Energie, um übermäßige Ablagerungen oder Kavitation zu vermeiden. Die Menge der am Zielort abgegebenen Energie hängt hauptsächlich von Folgendem ab: (1) der Laseraustrittsleistung, (2) der Qualität der Laserau…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Emilie Menant für die Fischpflege, der Polytechnique Bioimaging Facility, insbesondere Pierre Mahou, für die Unterstützung bei der Live-Bildgebung auf ihren Geräten, die teilweise von der Région Ile-de-France (interDIM) und der Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 France BioImaging) unterstützt werden. Diese Arbeit wurde durch die ANR-Zuschüsse 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016 und das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 840201, das Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche und das Centre National de la Recherche Scientifique unterstützt.

Materials

25x water immersion objective Olympus XLPLN25XWMP2
Agarose PanReac AppliChem A8963,0500
Data analysis software : Matlab Math Works
Electro-optic modulator (EOM) ConOptics 350-80LA
Embryo Medium (EM) solution Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000).
Environmental chamber chamber Okolab H201-T-UNIT-BL
EOM driver ConOptics 302RM
Fluorescence source Lumencor SOLA
Glass bottom dishes MatTek P35G-0-10-C
Glass capillaries Harvard Apparatus 300085 Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm
Glass pipettes Volac D810 Tip should be fire polished
Green/ablation laser Spectra Physics Mai Tai HP DeepSee
Histone2B-mCherry mRNA Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012)
Image analysis software: IMARIS Bitplane
ImSpector software Abberior Instruments Development Team
Injection mold Adapative Science Tools I-34
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micromanipulator Narishige MN-151
Micropipette puller Sutter P-1000
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
Penicillin-Streptomycin Thermofisher 15140-122 10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml
Photomultiplier tube (PMT) Hammamatsu H7422-40
PicoPump (Air injector) World Precision Instrument PV820
Red laser Spectra Physics OPO/Insight DeepSee
RNAse free water for injection Sigma W3500
Spreadsheet software: Excel Microsoft
Stereomicroscope Nikon SMZ18
Tg(gsc:GFP) zebrafish line Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).
TriM Scope II microscope La Vision Biotech

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Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula. J. Vis. Exp. (173), e62815, doi:10.3791/62815 (2021).

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