Dieses Protokoll zielt darauf ab, zu beschreiben, wie das Ausmaß der Internalisierung von Staphylococcus aureus und seine Überlebensfähigkeit in der menschlichen Wirtszelle sowie die intrazelluläre Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen untersucht werden können.
Staphylococcus aureus exprimiert Virulenzfaktoren, um seine Internalisierung in Eukaryotenzellen auszulösen und in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu überleben. Dieser Artikel beschreibt einen Enzymschutztest, um das Ausmaß der S. aureus-Internalisierung und sein intrazelluläres Überleben in adhärenten nicht-professionellen phagozytären Zellen (NPPCs) sowie die intrazelluläre Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen zu untersuchen. NPPCs werden in einer Multi-Well-Platte gezüchtet, bis sie 100% Konfluenz erreichen. S. aureus-Kulturen werden über Nacht im Zellkulturmedium gezüchtet. Die Bakteriensuspension wird entsprechend der Anzahl der Zellen pro Vertiefung verdünnt, um die Zellen bei einer kontrollierten Vielzahl von Infektionen zu impfen. Inokulierte Zellen werden für 2 h inkubiert, damit die Bakterien von den NPPCs internalisiert werden können, wonach Lysostaphin dem Kulturmedium hinzugefügt wird, um extrazelluläre Bakterien selektiv abzutöten. Lysostaphin ist im Kulturmedium für den Rest des Experiments vorhanden.
Zu diesem Zeitpunkt könnten die infizierten Zellen mit antimikrobiellen Verbindungen inkubiert werden, um ihre intrazellulären Aktivitäten gegen S. aureus zu bewerten. Als nächstes werden die Zellen dreimal gewaschen, um die Medikamente zu entfernen, und die intrazelluläre S. aureus-Last wird dann durch Kultivierung auf Agarplatten quantifiziert. Alternativ könnte Lysostaphin zur Untersuchung von Staphylokokken-Virulenzfaktoren, die am intrazellulären Überleben und der Zelltoxizität beteiligt sind, mit Proteinase K inaktiviert werden, um die Notwendigkeit von Waschschritten zu eliminieren. Dieser Tipp verbessert die Zuverlässigkeit der intrazellulären bakteriellen Belastungsquantifizierung, insbesondere wenn Zellen dazu neigen, sich von der Kulturplatte zu lösen, wenn sie sich aufgrund der Vermehrung des intrazellulären S. aureus stark infizieren. Diese Protokolle können mit praktisch allen Arten von adhärenten NPPCs und mit 3D-Zellkulturmodellen wie Organoiden verwendet werden.
Staphylococcus aureus ist sowohl ein lebensbedrohlicher Erreger als auch ein kommensales Bakterium der Haut und der Schleimhaut, das zwei Milliarden Menschen auf der ganzen Welt besiedelt1. Beim Menschen haben nasale Träger von S. aureus ein erhöhtes Infektionsrisiko mit ihrem eigenen Transportstamm; die multifaktoriellen Determinanten des S. aureus-Schleimhauttransports sind jedoch noch unklar1,2. Neben akuten Infektionen können Patienten auch chronische S. aureus-Infektionen entwickeln, die oft schwer zu heilen sind3. Ein besseres Verständnis der Wirt-Pathogen-Interaktionen während der Kolonisation und Infektion ist entscheidend für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien und die Verbesserung des Patientenmanagements.
In vitro kann S. aureus seine Internalisierung in Wirtszellen auslösen, die das α5β1-Integrin4 exprimieren. Die dreigliedrige Interaktion zwischen den staphylokokkalen Fibronektin-bindenden Proteinen, die an der Zellwand von S. aureus, dem Fibronektin, verankert sind, und dem β1-Integrin, das an der Wirtszelloberfläche exprimiert wird, ist als Hauptweg der S. aureus-Internalisierung in NPPCs wie Keratinozyten, Osteoblasten, Fibroblasten und Epithel- und Endothelzellen bekannt4. Neuere Studien zeigen, dass S. aureus während der Nasenbesiedlung5,6 und der Infektion in menschlichen Zellen gefunden werden kann7. Die Rolle des intrazellulären Reservoirs bei der Pathogenese der S. aureus-Infektion bleibt jedoch unklar. Die Wirtszellen könnten als Schutz für S. aureus dienen, das sowohl vor dem Immunsystem8 als auch vor den meisten antimikrobiellen Verbindungen geschützt ist6,9.
Der Lysostaphin-Schutzassay, der Anfang der 1980er Jahre von Proctor10 beschrieben wurde, ermöglicht die Untersuchung von Bakterien- und Wirtsfaktoren, die an der Internalisierung von S. aureus-Isolaten beteiligt sind. Lysostaphin ist ein von Staphylococcus simulans produziertes Bakteriozin, das eine starke Aktivität gegen fast alle S. aureus-Isolate , einschließlich antibiotikaresistenter Stämme, aufweist11. Lysostaphin wurde verwendet, um nur extrazelluläre S. aureus zu zerstören, um die Zählung nur lebensfähiger intrazellulärer Bakterien zu ermöglichen12. Diese Technik ist weit verbreitet und hat zur Entdeckung mehrerer Virulenzfaktoren von S. aureus beigetragen. Gentamycin, allein und in Kombination mit Lysostaphin, wird auch häufig verwendet, um intrazelluläre Bakterien zu untersuchen.
Eine aktuelle Studie zeigte jedoch, dass Gentamycin in eukaryotische Zellen eindringt und verinnerlichte Bakterien zeit- und konzentrationsabhängig erreicht13. Diese Studie zeigte auch, dass Lysostaphin nicht in eukaryotische Zellen gelangt, was bestätigt, dass ein Lysostaphin-basierter Enzymschutztest (EPA) der genaueste Assay zur Quantifizierung der intrazellulären S. aureus-Belastung durch Kultur ist13. Unabhängig davon, welche Verbindung zur Zerstörung extrazellulärer Bakterien (z. B. Lysostaphin oder Gentamycin) verwendet wird, sollte sie durch Waschen der Zellen entfernt werden, bevor intrazelluläre S. aureus auf Agarplatten plattiert wird. Sukzessive Waschungen können zur Ablösung von Zellen, insbesondere von schlecht haftenden Zellen (z. B. stark infizierten Zellen), führen, was zu einer Unterschätzung der intrazellulären S. aureus-Last führen würde. Dieser Artikel beschreibt detailliert, wie EPA verwendet werden kann, um die intrazelluläre S. aureus-Belastung zu quantifizieren und die intrazelluläre Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen mit einem In-vitro-Modell zu messen. Bemerkenswert ist, dass eine einfache Methode vorgeschlagen wurde, um die Zuverlässigkeit der intrazellulären Wägequantifizierung zu verbessern, indem intensive Wäschen vermieden werden.
Die hier beschriebenen Assays sind wertvoll für die Untersuchung des Ausmaßes der Internalisierung und des intrazellulären Überlebens von S. aureus in NPPCs sowie der intrazellulären Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen6,15,16. Einige Schritte in beiden Assay-Protokollen können kritisch sein. Der Gesundheitszustand und die Dichte der Zellen müssen zwischen unabhängigen Experimenten perfekt kontrolliert und konsistent sein. Das bakterielle Inokulum muss sorgfältig standardisiert werden, um einen echten MOI zu erhalten, der dem angestrebten theoretischen MOI nahe kommt. Im Allgemeinen muss darauf geachtet werden, dass beim Pipettieren keine der Zellen abgenommen wird. Die Waschungen zur Entfernung von Lysostaphin und Antibiotika sind kritische Schritte in der EPA. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von Proteinase K diesen Schritt verbessert, wenn kein Antibiotikum verwendet wird (siehe unten). Zu guter Letzt sollten die Zellen in jedem Bohrloch vollständig abgelöst und nach der Inkubation mit dem Lysepuffer gründlich homogenisiert werden, um die intrazelluläre S. aureus-Last zuverlässig zu quantifizieren.
In einigen Fällen können Probleme auftreten, und mehrere Punkte müssen zuerst überprüft werden. Bei mangelnder Reproduzierbarkeit ist zu beachten, dass S. aureus Klumpen bilden kann, was die Quantifizierung durch Absorption ungenau macht. Die Verklumpung von Bakterien kann durch Zentrifugations- und Waschschritte erhöht werden, wenn das Kulturmedium ersetzt werden soll (z.B. zur Eliminierung eines sezernierten Proteins). Die Bakteriensuspension sollte schnell verwendet werden, da Bakterien bei Raumtemperatur weiter wachsen. Die Wirksamkeit von Lysostaphin könnte aufgrund falscher Lagerbedingungen, eines suboptimalen pH-Werts für die Enzymaktivität in den Kulturmedien, der Variabilität der enzymatischen Aktivität zwischen Chargen und Anbietern und der fehlenden Lysostaphinsensitivität einiger Stämme unter spezifischen Wachstumsbedingungen abnehmen. Phenolrot könnte eine leichte bakteriostatische Wirkung haben, insbesondere wenn das Kulturmedium im Vergleich zu den typischen Brühen, die für den Bakterienanbau verwendet werden, relativ nährstoffarm ist. Daher ist es ratsam, ein Zellkulturmedium ohne Phenolrot zu verwenden, das auch fluoreszenzmikroskopische Beobachtungen verbessert, indem es das Hintergrundrauschen reduziert.
Obwohl diese Methode ein wertvolles Werkzeug ist, um das intrazelluläre Schicksal verschiedener Stämme zu untersuchen, sollten einige Grenzen der Methode berücksichtigt werden. Die Verwendung eines sehr hohen MOI kann die Internalisierungsfähigkeit von NPPCs überlasten und die Unterschiede zwischen den verschiedenen getesteten Stämmen ausgleichen. Das Ausmaß der Internalisierung der zytotoxischen Stämme kann unterschätzt werden, da Lysostaphin (oder Antibiotika) schnell S. aureus zerstört, das von beschädigten Zellen freigesetzt wird. Daher sind Experimente mit verlängerter Dauer (d.h. zur Untersuchung des intrazellulären Überlebens oder der intrazellulären Aktivität von Antibiotika) leichter mit Stämmen mit geringer Zytotoxizität einzurichten. Daher sollten die Inkubationszeit und der MOI genau an die Stammvirulenz, den Zelltyp und das experimentelle Ziel angepasst werden.
Die hier beschriebene Methode unter Verwendung von Lysostaphin ist zuverlässiger als diejenigen, die auf Gentamicin basieren, da Gentamicin im Gegensatz zu Lysostaphin dazu neigt, von Wirtszellen internalisiert zu werden13. Der andere Vorteil ist die Möglichkeit, das Lysostaphin zu inaktivieren. Eine Hemmung der Lysostaphinaktivität wurde von Kim et al.13 unter Verwendung von EDTA zur Chelatierung von Zinkionen oder 1,10-Phenanthrolin berichtet; Intensive Wäschen sind jedoch immer noch erforderlich, um das Enzym vor der Beschichtung der Bakterien zu entfernen. Hier ermöglicht die Proteinase K eine schnelle Inaktivierung von Lysostaphin. Wir beobachteten, dass Zellen dazu neigen, sich von der Kulturplatte zu lösen, wenn sie sich aufgrund der Vermehrung des intrazellulären S. aureus stark infizieren. Durch das Überspringen des letzten Waschschritts vereinfachte die iEPA-Methode die technische Handhabung erheblich und ermöglichte die Rückgewinnung der verinnerlichten Bakterien in lose anhaftenden oder bereits abgetrennten Zellen.
Die konzentrierteren Reagenzien und Puffer, die in iEPA verwendet werden, trugen auch dazu bei, den Pipettieraufwand zu reduzieren und den Verlust von Zellen zu minimieren. Darüber hinaus kann iEPA mit Zellen in Suspension sowie mit schwer zu waschenden Organoiden verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Enzymschutzassays die Untersuchung des Ausmaßes der Internalisierung und des intrazellulären Schicksals von S. aureus sowie der intrazellulären Aktivität von antimikrobiellen Arzneimitteln mit verschiedenen In-vitro-Modellen ermöglichen. Es sollten Verbesserungen vorgenommen werden, um die Beziehung zwischen Internalisierung und Zytotoxizität besser zu charakterisieren, um die Bedeutung der Entwicklung von Medikamenten, die in der Lage sind, S. aureus in der Zelle zu erreichen, besser zu verstehen.
The authors have nothing to disclose.
Die S. aureus-Stämme SF8300 WT und SF8300 ΔfnbA/B wurden von Prof. Binh Diep (University of California, San Francisco, USA) großzügig geschenkt. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Vereins FINOVI (#AO13 FINOVI) unter der Schirmherrschaft der Stiftung für die Universität Lyon unterstützt.
24-well plate | CORNING-FALCON | 353047 | |
A549 cell line | ATCC | CCL-185 | |
Acetate buffer solution pH 4.6 | Fluka | 31048 | Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate. |
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) | AMBI | LSPN-50 | Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage. |
COS – Colombia agar + 5% sheep blood | Biomerieux | 43049 | Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead. |
Densitometer WPA CO8000 | Biochrom Ltd. | 80-3000-45 | Cell density meter |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red | Sigma-Aldrich | D6429 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red | Sigma-Aldrich | D1145 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Easyspiral dilute | Interscience | 414000 | Automatic diluter and spiral plater |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
HaCaT cell line | Cell lines service (CLS) | 300493 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Fisher scientific | 11534886 | |
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water | Invitrogen | P3566 | |
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL | Eurobio | GEXPRK01-B5 | > 30 U/mg, lot 901727 |
Scan 4000 | Interscience | 438000 | Automatic colony counter |
Sterile water | OTEC | 600500 | |
T-75 culture flask | CORNING-FALCON | 353136 | |
TC20 Automated cell counter | Biorad | 1450102 | Automatic cell counter |
Tris 1 M pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
Wide-field fluorescence microscope | Nikon | Ti2 |