Methodenartikel

Entwicklung eines Zell-Co-Kultur-Modells zur Nachahmung von kardialer Ischämie/Reperfusion in vitro

DOI:

10.3791/62913

⸱

13. Oktober 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Anesthesiology, TVHS VA Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die räumliche Entfernung ist ein Schlüsselparameter bei der Beurteilung von Hypoxie- / Reoxygenierungsverletzungen in einem Kokulturmodell separater Endothel- und Kardiomyozytenzellschichten, was zum ersten Mal darauf hindeutet, dass die Optimierung der räumlichen Umgebung der Kokultur notwendig ist, um ein günstiges In-vitro-Modell für die Prüfung der Rolle von Endothelzellen beim Schutz von Kardiomyozyten bereitzustellen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit die häufigste Ursache für Tod und Behinderung. Reperfusion verursacht zusätzliche Verletzungen über die Ischämie hinaus. Endothelzellen (ECs) können Kardiomyozyten (CMs) durch Zell-Zell-Interaktionen vor Reperfusionsverletzungen schützen. Kokulturen können helfen, die Rolle von Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen. Eine gemischte Kokultur ist der einfachste Ansatz, aber begrenzt, da isolierte Behandlungen und nachgelagerte Analysen einzelner Zelltypen nicht möglich sind. Um zu untersuchen, ob ECs dosisabhängig CM-Zellschäden abschwächen können und ob dieser Schutz durch Variation des Kontaktabstands zwischen den beiden Zelllinien weiter optimiert werden kann, haben wir Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells und Adult Mouse Cardiomyocytes verwendet, um drei Arten von Zellkultureinsätzen zu testen, die in ihrem Abstand zwischen den Zellschichten bei 0,5 variierten. 1,0 bzw. 2,0 mm. Nur bei CMs nahm die Zellschädigung, wie sie durch die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) beurteilt wurde, während der Hypoxie und weiter bei der Reoxygenierung signifikant zu, wenn der Abstand 2,0 mm im Vergleich zu 0,5 und 1,0 mm betrug. Wenn ECs und CMs in nahezu direktem Kontakt standen (0,5 mm), gab es nur eine leichte Abschwächung der Reoxygenierungsverletzung von CMs nach Hypoxie. Diese Dämpfung war signifikant erhöht, wenn der räumliche Abstand 1,0 mm betrug. Mit einem Abstand von 2,0 mm schwächten ECs die CM-Verletzung sowohl während der Hypoxie als auch der Hypoxie/Reoxygenierung ab, was darauf hindeutet, dass eine ausreichende Kulturdistanzierung notwendig ist, damit ECs mit CMs übersprechen können, so dass sezernierte Signalmoleküle zirkulieren und Schutzwege vollständig stimulieren können. Unsere Ergebnisse deuten zum ersten Mal darauf hin, dass die Optimierung der räumlichen Umgebung der EC/CM-Kokultur notwendig ist, um ein günstiges In-vitro-Modell für die Prüfung der Rolle von ECs beim CM-Schutz gegen simulierte Ischämie/Reperfusionsverletzung bereitzustellen. Ziel dieses Berichts ist es, den Ermittlern einen schrittweisen Ansatz zu bieten, um dieses wichtige Modell zu ihrem Vorteil zu nutzen.

Einleitung

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Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit die häufigste Ursache für Tod und Behinderung 1,2. Der Behandlungsprozess der Reperfusion kann jedoch selbst zum Tod des Kardiomyozyten führen, der als Myokardischämie / Reperfusionsverletzung (IR) bekannt ist und für die es immer noch kein wirksames Mittel gibt3. Es wurde vorgeschlagen, dass Endothelzellen (ECs) Kardiomyozyten (CMs) durch die Sekretion parakriner Signale sowie Zell-zu-Zell-Interaktionenschützen 4.

Zell-Co-Kultur-Modelle wurden ausgiebig verwendet, um die Rolle autokriner und / oder parakriner Zell-Zell-Interaktionen auf die Zellfunktion und -differenzierung zu untersuchen. Unter den Kokulturmodellen ist die gemischte Kokultur die einfachste, bei der zwei verschiedene Zelltypen in direktem Kontakt innerhalb eines einzigen Kulturkompartiments mit einem gewünschten Zellverhältnisstehen 5. Getrennte Behandlungen zwischen Zelltypen und nachgelagerte Analysen eines einzelnen Zelltyps sind jedoch angesichts der gemischten Population nicht ohne weiteres durchführbar.

Frühere Studien zeigten, dass hypoxische und ischämische Beleidigungen die Integrität der Zellmembran signifikant schädigen, gemessen an der Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH). Diese Verletzung wird bei der Reoxygenierung verschlimmert und ahmt die Reperfusionsverletzung 6,7,8 nach. Ziel des aktuellen Protokolls war es, die Hypothesen zu testen, dass das Vorhandensein von ECs dosisabhängig das durch Hypoxie und Reoxygenierung (HR) verursachte Zellmembranleckage von CMs abschwächen kann und dass die Schutzwirkung von ECs durch Variation des Kontaktabstands zwischen den beiden Zelllinien optimiert werden kann. Daher verwendeten wir drei Arten von Zellkultureinsätzen und Maus-Primär-Koronararterien-Endothelzellen und adulte Maus-Kardiomyozyten. Die von Corning, Merck Millipore und Greiner Bio-One gebrandeten Einsätze ermöglichten es uns, drei verschiedene Zellkultur-Übersprechbedingungen mit Abständen zwischen den Zelllinien von 0,5, 1,0 bzw. 2,0 mm zu erzeugen. Pro Einsatz wurden jeweils 100.000 ECs plattiert.

Um festzustellen, ob die Dichte von ECs in der Kokultur in diesem Modell zur Dämpfung von HR-Verletzungen beiträgt, untersuchten wir außerdem die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen der EC-Konzentration und der LDH-Freisetzung durch CMs. ECs wurden mit 25.000, 50.000 bzw. 100.000 pro Einsatz im 2,0-mm-Einsatz plattiert.

Dieser Bericht bietet einen schrittweisen Ansatz für Ermittler, um dieses wichtige Modell zu ihrem Vorteil zu nutzen.

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Protokoll

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1. Versuchsvorbereitung/-beschichtung

  1. Pflegen Sie CMs und ECs gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    1. Tauen Sie beide Zelllinien auf, wenn sie von Lieferanten ankommen. Platte in T25-Kolben nach dem Waschen mit frischen Medien. Es wird empfohlen, jedes Zellkulturmedium von den gleichen Anbietern zu kaufen, von denen die Zellen gekauft wurden. Erfrischen Sie am nächsten Tag die Zellen mit Medien und verwenden Sie sie, wenn sie zusammenfließen.
    2. Halten Sie den Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 21% O2, 5% CO2, 74%N2 und halten Sie ihn befeuchtet.
      HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten primären Koronararterien-Endothelzellen der Maus werden aus Koronararterien von C57BL/6-Mäusen isoliert, und adulte Maus-Kardiomyozyten werden aus adulten C57BL/6J-Mausherzen isoliert und kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle).
  2. Platte CMs unter sterilen Bedingungen auf den Boden von 24-Well-Platten (untere Schicht). 24 h später Platte ECs in den Einsatz (oder übergeordneten Teil) des Co-Kultur-Brunnens. 24 h nach der EC-Beschichtung EC-Einsätze auf CM-Plattenböden legen, beginnend mit der Kokulturperiode. Lassen Sie die Zellen vor Gebrauch mindestens 12-24 Stunden lang kokulturieren. Diese Schritte werden im Folgenden ausführlich beschrieben.
    1. Schätzen Sie die Zusammenfluss von CM-Zelllinien unter einem Lichtmikroskop. Wenn Zellen in Kulturflaschen zu 90% -100% konfluent zu sein scheinen, fahren Sie mit der experimentellen Beschichtung fort.
    2. Entfernen Sie das Medium aus den Kolben, die konfluierende Zellkulturen enthalten, und trypsinisieren Sie mit 3-5 ml Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für T25-Kolben. Den Kolben vorsichtig rühren, bei 37 °C für 2-5 min inkubieren und dann den enzymatischen Fortschritt unter einem Lichtmikroskop beurteilen. Sobald sich die Zellen aufrunden, verwenden Sie einen Zellenabstreifer, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen.
    3. Nach dem Ablösen die Trypsinlösung inaktivieren, indem die Trypsin-/Zelllösung in ein 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Medien für T25-Kolben gegeben wird. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 120 x g für 2 Minuten, um ein weiches Zellpellet zu erhalten. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 5 ml Medien.
    4. Um die Zellzählung durchzuführen und die Zelllebensfähigkeit zu bestätigen, mischen Sie ein Aliquot von 10 μL resuspendierter Zellen und 10 μL Trypanblaufarbstoff. Zählen Sie die lebenden Zellen mithilfe eines Zellzählers. Verdünnen Sie die Zellen mit frischen regulären Medien, um die gewünschten Aussaatdichten zu erreichen. Die Volumina werden in Abhängigkeit von der gewünschten Samendichte und Zellkonzentration von Stammlösungen berechnet. Alle Beschichtungen sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
    5. Platten-CMs mit einer Aussaatdichte von 300.000 pro Bohrloch auf dem Boden einer 24-Well-Platte, die mit extrazellulärer Matrix vorbeschichtet ist. Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C mit 21%O2 und 5% CO2 gehalten.
    6. Nach 24 h Platten-ECs in Einsätze mit einer optimalen Beschichtungsdichte von 100.000 pro Einsatz (Kulturfläche beträgt 33,6 mm2) (Abbildung 1). Nach 24 Stunden EC-Beschichtung EC-Einsätze in die CM-Vertiefungen legen, um die Kokultur einzuleiten. Lassen Sie die Zellen 12-24 Stunden lang kokultivieren, bevor Sie die Experimente durchführen.
    7. Stellen Sie sicher, dass zum Zeitpunkt der Durchführung der Experimente sowohl CMs als auch ECs einen Zusammenfluss von 80 % bis 90 % erreicht haben.

2. Hypoxie/Reoxygenierung zur Simulation von Ischämie/Reperfusionsverletzung in vitro

HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen wie beschrieben ausgeführt werden, pausieren Sie nicht dazwischen.

  1. Bereiten Sie das hypoxische Medium vor, indem Sie ~ 25 ml Medien in ein konisches 50-ml-Rohr gießen. Versiegeln Sie die Oberseite mit einer Silikonmembran und verwenden Sie eine sterilisierte Pipette, um ein Loch zu stanzen. Erzeugen Sie ein weiteres Loch, diesmal bleibt die Pipette ungefähr 2/3 in das Medium eingetaucht.
  2. Spülen Sie das Medium mit hypoxischem Gas (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99%N2) für 5 min bei einer Durchflussrate von 30 L/min. Dies minimiertO2, das sich im Medium löst, wenn die Hypoxie beginnt (Schritt 2.5).
  3. Entsorgen Sie die Medien der 24-Well-Platten oder Kultureinsätze, die angeschlossene Zellen enthalten, und waschen Sie sie mit 100 μL/Well von 10% phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) sehr vorsichtig. Danach fügen Sie 500 μL der frisch zubereiteten hypoxischen Medien zu jeder Vertiefung der Platten oder Einsätze hinzu.
    HINWEIS: Die Hypoxie in den Medien wird während dieses Schritts so kurz wie möglich unterbrochen, bevor in Schritt 2.5 eine echte Hypoxie für Zellen und Medien beginnt.
    1. Ersetzen Sie in der normoxischen Kontrollgruppe das Originalmedium durch frische, normale Medien, die Glukose und Serum enthalten.
  4. Befeuchten Sie die Hypoxiekammer, indem Sie eine mit sterilem Wasser gefüllte Petrischale in die Kammer legen. Als nächstes legen Sie die Platten, die die hypoxischen Gruppen umfassen, in die Kammer.
  5. Spülen Sie die Hypoxiekammer mit hypoxischem Gas (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99%N2) für 5 min bei einem Durchfluss von 30 L/min. Stellen Sie die Kammer für 24 h in den 37 °C Inkubator.
  6. Nach Hypoxie CMs und ECs unter normalen Bedingungen kultivieren. Entsorgen Sie dazu das alte Medium der Platten/Einsätze, ersetzen Sie es durch normale Medien (mit Glukose und Serum; 500 μL jeder Vertiefung/Einlage) und lagern Sie es im Inkubator unter normalen Kulturbedingungen (21% O2, 5% CO 2, 74%N2, 37 °C) für2 h, um die Reperfusion nachzuahmen.
  7. Um die Auswirkungen des Medienersatzes zu kontrollieren, wechseln Sie die Medien der normoxischen Zellen gleichzeitig mit dem Wechsel der hypoxischen Medien.
    HINWEIS: Abbildung 2 bietet eine schematische Übersicht über dieses Protokoll.

3. Endpunktbewertung

  1. Übertragen Sie die Zellkulturmedien von der 24-Well-Platte in eine 96-Well-Platte. Verwenden Sie 200 μL Medien aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und verteilen Sie sie entsprechend gleichmäßig auf vier Vertiefungen der 96-Well-Platte. Verwenden Sie jeweils eine Platte für Normoxie versus Hypoxie versus HR.
  2. Bestimmen Sie den Grad der Zellschädigung, z. B. durch Messung der Absorption für LDH mit einem Zytotoxizitäts-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie den Assay in einer 96-Well-Platte gemäß den Anweisungen im Assay-Protokoll durch.

4. Statistiken

  1. Zeigen Sie die parametrischen Daten als Mittelwert/Standardabweichung und nicht-parametrische Daten als Boxplots mit Median-/Interquartilsbereich an. Es sollten angemessene parametrische und nicht-parametrische Mehrfachvergleiche mit akzeptablen Post-hoc-Tests durchgeführt werden, um die Wahrscheinlichkeit eines Typ-1-Fehlers zu verringern. Die Signifikanz wird typischerweise auf ein Alpha von 0,05 (zweiseitig) festgelegt.
  2. Führen Sie für alle Experimente, die in der aktuellen Studie durchgeführt wurden, mindestens drei Well-Replikationen innerhalb eines Experiments durch. Es gab drei bis sechs Wiederholungen jedes Experiments, die für die statistische Analyse verwendet wurden.

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Ergebnisse

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Alle drei Arten von Einsätzen (A, B, C), die in diesem Experiment verwendet wurden, haben die gleiche Porengröße von 0,4 μm. Der einzige Unterschied zwischen ihnen ist die Insert-to-Base-Höhe, die es ermöglicht, dass die Abstände zwischen den beiden kokultivierten Zellschichten 0,5, 1,0 bzw. 2,0 mm betragen (Abbildung 3) und dass sie von verschiedenen Anbietern stammen (Details siehe Materialtabelle).

Um ein In-vitro-Co-Kulturmodell mit separaten ...

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Diskussion

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Kritische Schritte im Protokoll
Zellkokulturmodelle wurden verwendet, um zelluläre Mechanismen der Kardioprotektion zu untersuchen. Wie man zwei getrennte Schichten mit einem sinnvollen Abstand zwischen ihnen schafft, ist daher entscheidend für die Entwicklung eines geeigneten Co-Kultur-Modells. Eine Herausforderung bei der Untersuchung simulierter IR-, d.h. HR-Verletzungen besteht darin, dass nicht nur Ischämie (Hypoxie) selbst, sondern auch Reperfusion (Reoxygenierung) die zelluläre Dysfunktion vers...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde zum Teil vom US Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) und von institutionellen Mitteln an M.L.R.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kardiomyozyten (CMs) aus adultenMäusenCelprogen Inc11041-14Isoliert aus adultem C57BL/6J-Mausherzgewebe
Automatisierter Zellzähler Countess IIInvitrogenA27977Zellzählung zur Berechnung der Zellzahl
Bio-SicherheitswerkbankNuaireNU425400sterile Haube
Zellkultur EinfriermediumZellbiologika Inc6916Wird zum Einfrieren von Zellen für die langfristige Lagerung von Zelllinien verwendet
Zellkultur-InkubatorNuaireNu-5500Zur Gewährleistung normaler Lebensbedingungen der Zellen (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°; C, befeuchtet)
Zellkultur-Inkubator GastankA-L Komprimierte GaseUN1013Für den Zellkultur-Inkubator benötigtes Gas 
Zellkultureinsätze A (0,5 mm)Corning Inc353095Wird für EC-CM Co-Kultur
Zellkultureinsätze B (1,0 mm)Millicell MilliporePIHP01250Wird für EC-CM Co-Kultur
Zellkultureinsätze C (2,0 mm)Greiner Bio-One662640Wird für EC-CM Co-Kultur
Zentrifugeverwendet Anstel Enterprises Inc4235Für die Beschichtung und Passage von Zellkulturen
CMs Zellkulturflaschen T25Celprogen IncE11041-14Wird für CMs normale Kultur verwendet, vom Hersteller
beschichtet CMs Zellkulturmedium CompleteCelprogen IncM11041-14SCMs Kulturmedium komplett
CMs Zellkulturmedium komplett PhenolfreiCelprogen IncM11041-14PNCMs Kulturmedium ohne Phenolrot wird bei der LDH-Messung verwendet
CMs Zellkulturplatten 96 wellCelprogen IncE11041-14-96wellWird für Experimente zur LDH-Messung verwendet, beschichtet durch
Hersteller CMs Hypoxia ZellkulturmediumCelprogen IncM11041-14GFPNCMs Zellkultur unter hypoxischen Bedingungen (glukose- und serumfrei)
Countess ZellzählkammerObjektträger InvitrogenC10283Zählobjektträger für den Zellzähler
Cyquant LDH ZytotoxizitätskitThermo Scientific C20301LDH-Messkit
ECs Zellkulturflaschen T25Fisher Scientific FB012935Wird für ECs reguläre
Kultur-ECs Zellkulturmedium CompleteCell Biologics IncM1168ECs Kultur-Komplettmedium
ECs Cell Culture Medium Complete PhenolFree Cell Biologics IncM1168PFECs Kulturmedium ohne Phenolrot verwendet, das bei der LDH-Messung verwendet
wird ECs Zellkulturplatten 96 WellFisher Scientific (Costar)3370Wird für LDH-Experimente verwendet Messung
ECs Culture Beschichtungslösung auf GelatinebasisCell Biologics Inc6950Wird zur Beschichtung von Kolben und Platten für
ECs ECs Hypoxia ZellkulturmediumCell Biologics IncGPF1168ECs Zellkultur unter hypoxischen Bedingungen (glukose- und serumfrei)
Fötales Rinderserum (FBS)Fisher ScientificMT35011CVFBS-HI USDA zugelassen für Zellkultur und Wartung
Hypoxie-KammerStemCell Technologies27310Zur Schaffung eines hypoxischen Zustands mit 0,01 %O2 Umgebung
Hypoxie-Kammer-DurchflussmesserStemCell Technologies27311Zum Anschluss an einen hypoxischen Gastank für eine konstante Gasdurchflussgeschwindigkeit
Hypoxischer Gastank (0,01 %O2 Zylinder)A-L Komprimierte GaseUN1956Wird zum Spülen von hypoxischem Medium und Kammer (0,01%O2/5%CO2/94,99N2)
Mikroskop NikonTMSZur Beobachtung des Zellzustands
Maus Primäre Koronararterien Endothelzellen (ECs)Cell Biologics IncC57-6093Isoliert aus der Koronararterien von C57BL/6 Mäusen
NUNC 15ML CONICONL RöhrchenFisher Scientific12565269Für Zellkulturprozesse, Experimente, Lösungsvorbereitung usw.
NUNC 50ML CONICL RöhrchenFisher Scientific12565271Für Zellkulturprozesse, Experimente, Lösungsvorbereitung etc.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-AldrichD8662Wird zum Waschen von Zellen während der Kultur oder bei Experimenten verwendet
Plate ReaderBioTek Instrument11120533Kolorimetrische oder fluorometrische Plattenablesung
Reaktion 96 Well Palte (klar, kein Deckel)Fisher Scientific12565226Wird für LDH-Messungen verwendet
Plattenlesung Trypsin/EDTA für CMsCelprogen IncT1509-0141 x steril gefiltert und gewebekulturgetestet
Trypsin/EDTA für ECsCell Biologics Inc6914/06190,25%, zellschnittgeprüft
verwendet verwendet

Referenzen

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Schlagwörter

ReperfusionsschadenEndothelzellenKardiomyozytenHypoxie ReoxygenierungLDH FreisetzungZell Zell InteraktionenIn vitro ModellCulture Inserts

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