Entwicklung eines Zell-Co-Kultur-Modells zur Nachahmung von kardialer Ischämie/Reperfusion in vitro

Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit die häufigste Ursache für Tod und Behinderung ^1,2. Der Behandlungsprozess der Reperfusion kann jedoch selbst zum Tod des Kardiomyozyten führen, der als Myokardischämie / Reperfusionsverletzung (IR) bekannt ist und für die es immer noch kein wirksames Mittel gibt³. Es wurde vorgeschlagen, dass Endothelzellen (ECs) Kardiomyozyten (CMs) durch die Sekretion parakriner Signale sowie Zell-zu-Zell-Interaktionen^{schützen 4}.

Zell-Co-Kultur-Modelle wurden ausgiebig verwendet, um die Rolle autokriner und / oder parakriner Zell-Zell-Interaktionen auf die Zellfunktion und -differenzierung zu untersuchen. Unter den Kokulturmodellen ist die gemischte Kokultur die einfachste, bei der zwei verschiedene Zelltypen in direktem Kontakt innerhalb eines einzigen Kulturkompartiments mit einem gewünschten Zellverhältnis^{stehen 5}. Getrennte Behandlungen zwischen Zelltypen und nachgelagerte Analysen eines einzelnen Zelltyps sind jedoch angesichts der gemischten Population nicht ohne weiteres durchführbar.

Frühere Studien zeigten, dass hypoxische und ischämische Beleidigungen die Integrität der Zellmembran signifikant schädigen, gemessen an der Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH). Diese Verletzung wird bei der Reoxygenierung verschlimmert und ahmt die Reperfusionsverletzung ^6,7,8 nach. Ziel des aktuellen Protokolls war es, die Hypothesen zu testen, dass das Vorhandensein von ECs dosisabhängig das durch Hypoxie und Reoxygenierung (HR) verursachte Zellmembranleckage von CMs abschwächen kann und dass die Schutzwirkung von ECs durch Variation des Kontaktabstands zwischen den beiden Zelllinien optimiert werden kann. Daher verwendeten wir drei Arten von Zellkultureinsätzen und Maus-Primär-Koronararterien-Endothelzellen und adulte Maus-Kardiomyozyten. Die von Corning, Merck Millipore und Greiner Bio-One gebrandeten Einsätze ermöglichten es uns, drei verschiedene Zellkultur-Übersprechbedingungen mit Abständen zwischen den Zelllinien von 0,5, 1,0 bzw. 2,0 mm zu erzeugen. Pro Einsatz wurden jeweils 100.000 ECs plattiert.

Um festzustellen, ob die Dichte von ECs in der Kokultur in diesem Modell zur Dämpfung von HR-Verletzungen beiträgt, untersuchten wir außerdem die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen der EC-Konzentration und der LDH-Freisetzung durch CMs. ECs wurden mit 25.000, 50.000 bzw. 100.000 pro Einsatz im 2,0-mm-Einsatz plattiert.

Dieser Bericht bietet einen schrittweisen Ansatz für Ermittler, um dieses wichtige Modell zu ihrem Vorteil zu nutzen.

1. Versuchsvorbereitung/-beschichtung

1. Pflegen Sie CMs und ECs gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   1. Tauen Sie beide Zelllinien auf, wenn sie von Lieferanten ankommen. Platte in T25-Kolben nach dem Waschen mit frischen Medien. Es wird empfohlen, jedes Zellkulturmedium von den gleichen Anbietern zu kaufen, von denen die Zellen gekauft wurden. Erfrischen Sie am nächsten Tag die Zellen mit Medien und verwenden Sie sie, wenn sie zusammenfließen.
   2. Halten Sie den Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 21% O2, 5% CO₂, 74%_N2 und halten Sie ihn befeuchtet.
      HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten primären Koronararterien-Endothelzellen der Maus werden aus Koronararterien von C57BL/6-Mäusen isoliert, und adulte Maus-Kardiomyozyten werden aus adulten C57BL/6J-Mausherzen isoliert und kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle).
2. Platte CMs unter sterilen Bedingungen auf den Boden von 24-Well-Platten (untere Schicht). 24 h später Platte ECs in den Einsatz (oder übergeordneten Teil) des Co-Kultur-Brunnens. 24 h nach der EC-Beschichtung EC-Einsätze auf CM-Plattenböden legen, beginnend mit der Kokulturperiode. Lassen Sie die Zellen vor Gebrauch mindestens 12-24 Stunden lang kokulturieren. Diese Schritte werden im Folgenden ausführlich beschrieben.
   1. Schätzen Sie die Zusammenfluss von CM-Zelllinien unter einem Lichtmikroskop. Wenn Zellen in Kulturflaschen zu 90% -100% konfluent zu sein scheinen, fahren Sie mit der experimentellen Beschichtung fort.
   2. Entfernen Sie das Medium aus den Kolben, die konfluierende Zellkulturen enthalten, und trypsinisieren Sie mit 3-5 ml Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für T25-Kolben. Den Kolben vorsichtig rühren, bei 37 °C für 2-5 min inkubieren und dann den enzymatischen Fortschritt unter einem Lichtmikroskop beurteilen. Sobald sich die Zellen aufrunden, verwenden Sie einen Zellenabstreifer, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen.
   3. Nach dem Ablösen die Trypsinlösung inaktivieren, indem die Trypsin-/Zelllösung in ein 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Medien für T25-Kolben gegeben wird. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 120 x g für 2 Minuten, um ein weiches Zellpellet zu erhalten. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 5 ml Medien.
   4. Um die Zellzählung durchzuführen und die Zelllebensfähigkeit zu bestätigen, mischen Sie ein Aliquot von 10 μL resuspendierter Zellen und 10 μL Trypanblaufarbstoff. Zählen Sie die lebenden Zellen mithilfe eines Zellzählers. Verdünnen Sie die Zellen mit frischen regulären Medien, um die gewünschten Aussaatdichten zu erreichen. Die Volumina werden in Abhängigkeit von der gewünschten Samendichte und Zellkonzentration von Stammlösungen berechnet. Alle Beschichtungen sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
   5. Platten-CMs mit einer Aussaatdichte von 300.000 pro Bohrloch auf dem Boden einer 24-Well-Platte, die mit extrazellulärer Matrix vorbeschichtet ist. Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C mit 21%_{O2 und} 5% CO₂ gehalten.
   6. Nach 24 h Platten-ECs in Einsätze mit einer optimalen Beschichtungsdichte von 100.000 pro Einsatz (Kulturfläche beträgt 33,6 mm²) (Abbildung 1). Nach 24 Stunden EC-Beschichtung EC-Einsätze in die CM-Vertiefungen legen, um die Kokultur einzuleiten. Lassen Sie die Zellen 12-24 Stunden lang kokultivieren, bevor Sie die Experimente durchführen.
   7. Stellen Sie sicher, dass zum Zeitpunkt der Durchführung der Experimente sowohl CMs als auch ECs einen Zusammenfluss von 80 % bis 90 % erreicht haben.

2. Hypoxie/Reoxygenierung zur Simulation von Ischämie/Reperfusionsverletzung in vitro

HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen wie beschrieben ausgeführt werden, pausieren Sie nicht dazwischen.

1. Bereiten Sie das hypoxische Medium vor, indem Sie ~ 25 ml Medien in ein konisches 50-ml-Rohr gießen. Versiegeln Sie die Oberseite mit einer Silikonmembran und verwenden Sie eine sterilisierte Pipette, um ein Loch zu stanzen. Erzeugen Sie ein weiteres Loch, diesmal bleibt die Pipette ungefähr 2/3 in das Medium eingetaucht.
2. Spülen Sie das Medium mit hypoxischem Gas (0,0125% O2, 5% CO₂, 94,99%_N2) für 5 min bei einer Durchflussrate von 30 L/min. Dies minimiert_O2, das sich im Medium löst, wenn die Hypoxie beginnt (Schritt 2.5).
3. Entsorgen Sie die Medien der 24-Well-Platten oder Kultureinsätze, die angeschlossene Zellen enthalten, und waschen Sie sie mit 100 μL/Well von 10% phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) sehr vorsichtig. Danach fügen Sie 500 μL der frisch zubereiteten hypoxischen Medien zu jeder Vertiefung der Platten oder Einsätze hinzu.
   HINWEIS: Die Hypoxie in den Medien wird während dieses Schritts so kurz wie möglich unterbrochen, bevor in Schritt 2.5 eine echte Hypoxie für Zellen und Medien beginnt.
   1. Ersetzen Sie in der normoxischen Kontrollgruppe das Originalmedium durch frische, normale Medien, die Glukose und Serum enthalten.
4. Befeuchten Sie die Hypoxiekammer, indem Sie eine mit sterilem Wasser gefüllte Petrischale in die Kammer legen. Als nächstes legen Sie die Platten, die die hypoxischen Gruppen umfassen, in die Kammer.
5. Spülen Sie die Hypoxiekammer mit hypoxischem Gas (0,0125% O2, 5% CO₂, 94,99%_N2) für 5 min bei einem Durchfluss von 30 L/min. Stellen Sie die Kammer für 24 h in den 37 °C Inkubator.
6. Nach Hypoxie CMs und ECs unter normalen Bedingungen kultivieren. Entsorgen Sie dazu das alte Medium der Platten/Einsätze, ersetzen Sie es durch normale Medien (mit Glukose und Serum; 500 μL jeder Vertiefung/Einlage) und lagern Sie es im Inkubator unter normalen Kulturbedingungen (21% O2, 5% CO 2, 74%_N2, 37 °C) für₂ h, um die Reperfusion nachzuahmen.
7. Um die Auswirkungen des Medienersatzes zu kontrollieren, wechseln Sie die Medien der normoxischen Zellen gleichzeitig mit dem Wechsel der hypoxischen Medien.
   HINWEIS: Abbildung 2 bietet eine schematische Übersicht über dieses Protokoll.

3. Endpunktbewertung

1. Übertragen Sie die Zellkulturmedien von der 24-Well-Platte in eine 96-Well-Platte. Verwenden Sie 200 μL Medien aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und verteilen Sie sie entsprechend gleichmäßig auf vier Vertiefungen der 96-Well-Platte. Verwenden Sie jeweils eine Platte für Normoxie versus Hypoxie versus HR.
2. Bestimmen Sie den Grad der Zellschädigung, z. B. durch Messung der Absorption für LDH mit einem Zytotoxizitäts-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie den Assay in einer 96-Well-Platte gemäß den Anweisungen im Assay-Protokoll durch.

4. Statistiken

1. Zeigen Sie die parametrischen Daten als Mittelwert/Standardabweichung und nicht-parametrische Daten als Boxplots mit Median-/Interquartilsbereich an. Es sollten angemessene parametrische und nicht-parametrische Mehrfachvergleiche mit akzeptablen Post-hoc-Tests durchgeführt werden, um die Wahrscheinlichkeit eines Typ-1-Fehlers zu verringern. Die Signifikanz wird typischerweise auf ein Alpha von 0,05 (zweiseitig) festgelegt.
2. Führen Sie für alle Experimente, die in der aktuellen Studie durchgeführt wurden, mindestens drei Well-Replikationen innerhalb eines Experiments durch. Es gab drei bis sechs Wiederholungen jedes Experiments, die für die statistische Analyse verwendet wurden.

Alle drei Arten von Einsätzen (A, B, C), die in diesem Experiment verwendet wurden, haben die gleiche Porengröße von 0,4 μm. Der einzige Unterschied zwischen ihnen ist die Insert-to-Base-Höhe, die es ermöglicht, dass die Abstände zwischen den beiden kokultivierten Zellschichten 0,5, 1,0 bzw. 2,0 mm betragen (Abbildung 3) und dass sie von verschiedenen Anbietern stammen (Details siehe Materialtabelle).

Um ein In-vitro-Co-Kulturmodell mit separaten Schichten von zwei Zelllinien zu etablieren, die einer HR unterzogen werden, um IR-Verletzungen zu simulieren, untersuchten wir die Zellmembranintegrität von CMs, die mit oder ohne ECs kokultiviert wurden. Die Verwendung eines separaten Einsatzes für ECs, der in verschiedenen Abständen über der CM-Schicht platziert werden kann, ermöglichte es uns auch, die unterschiedlichen Auswirkungen des Zellschichtabstands auf die Schwere der Membranschädigung in den CMs zu bewerten. In einem separaten Satz von Experimenten variierten wir die Dichte von ECs und damit das Verhältnis von ECs zu CMs. Um simulierte Ischämie von simulierter IR-Verletzung zu unterscheiden, wurden Experimente unter den Bedingungen 1) Normoxie, 2) nur Hypoxie und 3) HR durchgeführt. Für dieses Modell verwendeten wir 24 h Hypoxie, gefolgt von 2 h Sauerstoffversorgung.

Variable Abstände
0,5 mm Abstand zwischen den Zellschichten (Insert A)
Wenn CMs allein kultiviert wurden, führte die Hypoxie im Vergleich zur Normoxie zu einer signifikant erhöhten LDH-Freisetzung, was mit unseren früheren Studien übereinstimmt (Abbildung 4A)6. LDH war jedoch bei 2h-Reoxygenierung im Vergleich zur reinen Hypoxie-Gruppe nur geringfügig weiter erhöht. Wenn ECs und CMs in einem Abstand von 0,5 mm zusammen kultiviert wurden, wurde der Anstieg der LDH-Freisetzung nur durch Hypoxie nicht abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass die ECs keine schützende Wirkung zeigten (im Vergleich zu CMs allein unter den reinen Hypoxie-Bedingungen). ECs übten jedoch während der Personalabteilung einen milden, aber signifikanten Schutz auf CMs aus.

1,0 mm Abstand zwischen den Zellschichten (Insert B)
Das gleiche Experiment wurde wie oben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass der Abstand zwischen den beiden Zellschichten auf 1,0 mm erhöht wurde (Abbildung 4B). Wir fanden heraus, dass die LDH-Freisetzung auch bei CMs nur durch Hypoxie signifikant erhöht war. Anders als beim 0,5-mm-Einsatz wurde der LDH-Anstieg bei CMs, die nur bei CMs lagen, jedoch durch HR gegenüber reiner Hypoxie potenziert. Darüber hinaus wurde diese Potenzierung durch das Vorhandensein der ECs während der Reoxygenierung im Vergleich zur reinen CMs-Gruppe stärker gehemmt und fast abgeschafft.

2,0 mm Abstand zwischen den Zellschichten (Insert C)
Wenn Co-Kultur-Inserts verwendet wurden, die einen Abstand von 2,0 mm zwischen den beiden Zelllinien erzeugen (Abbildung 4C), fanden wir auch einen signifikanten Anstieg der LDH-Freisetzung durch CMs - nur während der Hypoxie, im gleichen Maße wie in den 0,5 mm- und den 1,0 mm-Experimenten. Interessanterweise war die zusätzliche Erhöhung der LDH-Freisetzung durch Reoxygenierung jedoch noch ausgeprägter als in den 1,0-mm-Experimenten. Beide Anstiege wurden durch das Vorhandensein von EC gemildert, aber nicht abgeschafft, was darauf hindeutet, dass ECs im Gegensatz zur Verwendung von 0,5- oder 1,0-mm-Einsätzen CMs sowohl unter reinen Hypoxie- als auch unter HR-Bedingungen signifikant vor Verletzungen schützten.

Variable EG-Intensitäten
In einer anderen Reihe von Experimenten wurde die Konzentration von ECs, die in 2,0-mm-Einsätzen plattiert waren, auf 25.000, 50.000 bzw. 100.000 Zellen pro Einsatz titriert. Die LDH-Freisetzung wurde nach 24 h Hypoxie gemessen, gefolgt von einer 2 h Reoxygenierung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine zunehmende EC-Intensität in der Kokultur zu einer dosisabhängigen Dämpfung der LDH-Freisetzung durch HR führte (Abbildung 5); Unter normoxischen Bedingungen wurde kein solcher Effekt beobachtet.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Einsatzes in der Vertiefung. Die Einsätze mit den ECs (bis zu 100.000 Zellen pro Einsatz) werden mit den CMs (300.000 pro Bohrloch) auf der Unterseite auf die 24-Well-Platten übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Versuchsplanung. Die Zellen werden unter normalen Sauerstoffbedingungen (21% O2) kultiviert und dann in zwei Gruppen aufgeteilt: Eine normoxische Kontrollgruppe wird unter normalen Bedingungen für weitere 24 h kultiviert, während die Hypoxiegruppe 24 h lang in einer Hypoxiekammer mit nur 0,01% O2 und ohne Glukose kultiviert wird. Nach diesen 24-stündigen Interventionen werden beide Zellgruppen mit Medien aufgefrischt und kontinuierlich in einer 21%O2-Umgebung für weitere 2 h, die Reoxygenierungsphase, kultiviert, bevor schließlich die Endpunktanalyse(n), z. B. LDH-Analyse, durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Bilder und Schaltpläne der drei verschiedenen Einfügungen. Der Abstand zwischen den Endothelzellen im Insert und den Kardiomyozyten am Boden des Brunnens kann durch die Verwendung verschiedener Einsätze variiert werden. Alle drei hier verwendeten Einlegearten haben die gleiche Porengröße von 0,4 μm. Der einzige Unterschied zwischen ihnen ist die Insert-to-Base-Höhe, die es ermöglicht, dass die Abstände zwischen den beiden kokultivierten Zellschichten 0,5 (A), 1,0 (B) bzw. 2,0 mm (C) betragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Vergleich von drei Arten von Kultureinsätzen bei der Beurteilung der Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH; in Absorptionseinheiten [au]) unter normoxischen (links), Hypoxie-only- (Mitte) und Hypoxie/Reoxygenierungsbedingungen (rechts) für Kardiomyozyten allein (CM; weiß), Endothelzellen allein (EC; schwarz) und Co-Kulturen von CM mit EC (Kontrollmuster). (A) 0,5 mm Abstand, (B) 1,0 mm Abstand, (C) 2,0 mm Abstand zwischen den beiden verschiedenen Zellschichten. ECs wurden mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Einsatz plattiert, CMs mit einer Dichte von 300.000 Zellen pro Well. Die Daten sind Mittelwert ± Standardabweichung, n = 4 pro Gruppe. Statistik: ANOVA gefolgt von Student-Newman-Keuls Post-hoc-Test. P < 0,05 (zweiseitig), angezeigt durch horizontale Balken zwischen jedem verglichenen Paar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Konzentration von co-kultivierten Endothelzellen (EC; 25: 25.000 Zellen pro Insert; 50: 50.000 Zellen pro Insert; 100: 100.000 Zellen pro Insert) dosisabhängig beeinflusster Schutz von Kardiomyozyten (CM) vor Hypoxie/Reoxygenierungsverletzung (rechts) im Vergleich zu normoxischen Zuständen (links), nachgewiesen durch Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH; in Absorptionseinheiten [au]). ECs hatten keinen Einfluss auf die LDH-Freisetzung unter normoxischen Bedingungen. Die Daten sind Mittelwert ± Standardabweichung, n = 4 pro Gruppe. Statistik: ANOVA gefolgt von Student-Newman-Keuls Post-hoc-Test. P < 0,05 (zweiseitig), angezeigt durch horizontale Balken zwischen jedem verglichenen Paar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.