Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.
Die rollende Adhäsion, die durch selektinvermittelte Wechselwirkungen erleichtert wird, ist eine hochdynamische, passive Motilität bei der Rekrutierung von Leukozyten an der Entzündungsstelle. Dieses Phänomen tritt in postkapillaren Venolen auf, wo der Blutfluss Leukozyten in einer rollenden Bewegung auf die Endothelzellen drückt. Stabiles Walzen erfordert ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der Bildung von Adhäsionsbindungen und deren mechanisch angetriebener Dissoziation, so dass die Zelle während des Walzens in Strömungsrichtung an der Oberfläche befestigt bleibt. Im Gegensatz zu anderen Adhäsionsprozessen, die in relativ statischen Umgebungen ablaufen, ist die Rolladhäsion hochdynamisch, da sich die Rollelzellen mit mehreren zehn Mikrometern pro Sekunde über Tausende von Mikrometern bewegen. Konventionelle mechanoologische Methoden wie die Zugkraftmikroskopie sind daher aufgrund der kurzen Zeitskala und der erforderlichen hohen Sensitivität ungeeignet, um die einzelnen Adhäsionsereignisse und die damit verbundenen molekularen Kräfte zu messen. Hier beschreiben wir unsere neueste Implementierung des Adhäsions-Footprint-Assays zur Abbildung des P-Selektins: PSGL-1-Wechselwirkungen in der rollenden Adhäsion auf molekularer Ebene. Diese Methode verwendet irreversible DNA-basierte Spannungsmessstreifenbinder, um eine permanente Historie molekularer Adhäsionsereignisse in Form von Fluoreszenzspuren zu erzeugen. Diese Spuren können auf zwei Arten abgebildet werden: (1) Zusammenfügen von Tausenden von beugungsbegrenzten Bildern, um ein großes Sichtfeld zu erzeugen, das die Extraktion des Adhäsionsfußabdrucks jeder rollenden Zelle über Tausende von Mikrometern Länge ermöglicht, (2) Durchführen von DNA-PAINT, um hochauflösende Bilder der Fluoreszenzspuren in einem kleinen Sichtfeld zu rekonstruieren. In dieser Studie wurde der Adhäsions-Footprint-Assay verwendet, um HL-60-Zellen zu untersuchen, die bei verschiedenen Scherspannungen rollen. Dabei konnten wir die räumliche Verteilung der P-Selektin:PSGL-1-Wechselwirkung abbilden und durch fluoreszenzintensität Einblick in ihre molekularen Kräfte gewinnen. Damit liefert diese Methode die Grundlage für die quantitative Untersuchung der verschiedenen Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen, die an der Rolladhäsion auf molekularer Ebene beteiligt sind.
Die rollende Adhäsionskaskade beschreibt, wie zirkulierende Zellen an die Blutgefäßwand binden und entlang dieser rollen1. Passives Walzen wird hauptsächlich durch Selectine vermittelt, eine Hauptklasse zellulärer Adhäsionsmoleküle (CAMs)1. Unter dem Scherfluss des Blutes bilden Leukozyten, die P-Selektin-Glykoprotein-Ligand-1 (PSGL-1) exprimieren, hochtransiente Bindungen mit P-Selektin, die auf der Oberfläche entzündeter Endothelzellen exprimiert werden können. Dieser Prozess ist entscheidend dafür, dass Leukozyten an einen Ort der Entzündung wandern2. Darüber hinaus ist PSGL-1 auch ein mechanosensitiver Rezeptor, der in der Lage ist, die nachfolgende feste Adhäsionsstufe der rollenden Adhäsionskaskade auszulösen, wenn er mit P-Selektin3 interagiert.
Genetische Mutationen, die die CAM-Funktion beeinflussen, können das Immunsystem stark beeinträchtigen, wie z.B. bei der seltenen Erkrankung des Leukozytenadhäsionsmangels (LAD), bei der eine Fehlfunktion der Adhäsionsmoleküle, die das Rollen vermitteln, zu stark immungeschwächten Personen führt4,5,6. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen nach einem ähnlichen Rollprozess wandern, was zu Metastasen führt7,8. Da das Zellrollen jedoch schnell und dynamisch ist, sind herkömmliche experimentelle mechanotische Methoden ungeeignet, um molekulare Wechselwirkungen während des Zellrollens zu untersuchen. Während Einzelzell- und Einzelmolekül-Manipulationsmethoden wie Rasterkraftmikroskopie und optische Pinzette molekulare Wechselwirkungen wie die kraftabhängige Wechselwirkung von P-Selectin mit PSGL-1 auf Einzelmolekülebene untersuchen konnten9, sind sie für die Untersuchung von Live-Adhäsionsereignissen während des Zellrollens ungeeignet. Darüber hinaus kann die in vitro charakterisierte Interaktion die Frage nach der molekularen Adhäsion in vivo nicht direkt beantworten. Welcher molekulare Spannungsbereich ist beispielsweise biologisch relevant, wenn Zellen in ihrer natürlichen Umgebung funktionieren? Berechnungsmethoden wie die Klebstoffdynamiksimulation10 oder das einfache stationäre Modell11 haben bestimmte molekulare Details und deren Einfluss auf das Walzverhalten erfasst, sind aber stark von der Genauigkeit der Modellierungsparameter und -annahmen abhängig. Andere Techniken wie die Zugkraftmikroskopie können Kräfte während der Zellmigration erkennen, liefern jedoch keine ausreichende räumliche Auflösung oder quantitative Informationen über die molekulare Spannung. Keine dieser Techniken kann direkte experimentelle Beobachtungen der zeitlichen Dynamik, der räumlichen Verteilung und der Magnitudenheterogenität molekularer Kräfte liefern, die sich direkt auf die Zellfunktion und das Zellverhalten in ihrer nativen Umgebung beziehen.
Daher ist die Implementierung eines molekularen Kraftsensors, der in der Lage ist, selektive Wechselwirkungen genau zu messen, von entscheidender Bedeutung, um unser Verständnis der Walzadhäsion zu verbessern. Hier beschreiben wir das Protokoll für den Adhäsions-Footprint-Assay12, bei dem PSGL-1-beschichtete Kügelchen auf einer Oberfläche gerollt werden, die p-selektin-funktionalisierte Spannungsmessstreifen-Tethers (TGTs)13 präsentiert. Diese TGTs sind irreversible DNA-basierte Kraftsensoren, die zu einer permanenten Historie von Bruchereignissen in Form von Fluoreszenzanzeigen führen. Dies wird durch das Aufbrechen des TGT (dsDNA) und anschließende Markierung des rupturierten TGT (ssDNA) mit einem fluoreszierend markierten Komplementärstrang erreicht. Ein großer Vorteil dieses Systems ist seine Kompatibilität sowohl mit beugungsbegrenzter als auch mit hochauflösender Bildgebung. Der fluoreszenzmarkierte Komplementärstrang kann entweder dauerhaft gebunden (>12 bp) für die beugungsbegrenzte Bildgebung oder vorübergehend gebunden (7-9 bp) für die hochauflösende Bildgebung durch DNA PAINT. Dies ist ein ideales System, um die Walzhaftung zu untersuchen, da die TGTs während des aktiven Walzens gerissen sind, aber die Fluoreszenzanzeige wird nach dem Walzen analysiert. Die beiden bildgebenden Verfahren geben dem Anwender zudem mehr Freiheit, die Rollhaftung zu untersuchen. Typischerweise ist die beugungsbegrenzte Bildgebung nützlich, um die molekulare Bruchkraft durch Fluoreszenzintensität zu extrahieren13, während die hochauflösende Bildgebung eine quantitative Analyse der Rezeptordichte ermöglicht. Mit der Fähigkeit, diese Eigenschaften der Walzadhäsion zu untersuchen, bietet dieser Ansatz eine vielversprechende Plattform für das Verständnis des Kraftregulationsmechanismus auf die molekulare Adhäsion von rollenden Zellen unter Scherfluss.
Der Adhäsions-Footprint-Assay ermöglicht die Visualisierung der molekularen Adhäsionsereignisse zwischen PSGL-1 und P-Selektin während der Zellrollenadhäsion. Dieser Prozess wird durch P-Selektin-vermittelte Erfassung eingeleitet, gefolgt von einem Walzen unter fluidischer Scherspannung. Mögliche Probleme während des Experiments beinhalten in der Regel ein schlechtes Zellrollen oder fehlende fluoreszierende Spuren, selbst wenn die Zellen gut rollen. Diese Probleme resultieren häufig aus Qualitätskontrollen an de…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), dem New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), der Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) und dem University of British Columbia Eminence Fund unterstützt.
4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
GelGreen | Biotium | 41005 | |
Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |