Summary

Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz

Published: November 05, 2021
doi:

Summary

Hier beschreiben wir eine nichtinvasive Überwachungsmethode, die Luciferase und grün fluoreszierende Proteinexpression in verschiedenen Brustkrebszelllinien beinhaltet. Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Überwachung der Tumorbildung und der metastasierenden Besiedlung in Echtzeit bei Mäusen.

Abstract

Brustkrebs ist eine häufige heterogene Malignität und die zweithäufigste Todesursache bei Frauen, hauptsächlich aufgrund von entfernten Organmetastasen. Es wurden mehrere Tiermodelle erstellt, darunter die weit verbreiteten orthotopen Mausmodelle, bei denen Krebszellen in das Brustfettpolster injiziert werden. Diese Modelle können jedoch nicht dazu beitragen, die Kinetik des Tumorwachstums und die metastasierende Besiedlung zu überwachen. Modernste Werkzeuge zur Echtzeitüberwachung von Krebszellen in Mäusen werden das Verständnis der Tumorbiologie erheblich verbessern.

Hier wurden Brustkrebszelllinien etabliert, die Luziferase und grün fluoreszierendes Protein (GFP) stabil exprimieren. Insbesondere enthält diese Technik zwei aufeinanderfolgende Schritte, die durch die Messung der Luciferase-Aktivität in vitro eingeleitet werden, gefolgt von der Implantation der Krebszellen in Brustfettpolster von nicht fettleibigen diabetisch-schweren kombinierten Immunschwächemäusen (NOD-SCID). Nach der Injektion werden sowohl das Tumorwachstum als auch die metastasierende Besiedlung in Echtzeit durch das nichtinvasive Biolumineszenz-Bildgebungssystem überwacht. Dann wird die Quantifizierung von GFP-exprimierenden Metastasen in der Lunge mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht, um die beobachteten Biolumineszenzergebnisse zu validieren. Dieses ausgeklügelte System, das Luciferase und fluoreszenzbasierte Erkennungswerkzeuge kombiniert, bewertet Krebsmetastasen in vivo, was ein großes Potenzial für den Einsatz in Brustkrebstherapeutika und Krankheitsmanagement hat.

Introduction

Brustkrebs ist weltweit eine häufige Krebsart, mit etwa 250.000 neuen Fällen, die jedes Jahr in den Vereinigten Staaten diagnostiziertwerden 1. Trotz seiner hohen Inzidenz hat eine neue Reihe von Krebsmedikamenten die Ergebnisse von Brustkrebspatientinnen signifikant verbessert2. Diese Behandlungen sind jedoch immer noch unzureichend, da viele Patienten einen Krankheitsrückfall und eine metastatische Ausbreitung auf lebenswichtige Organe2 erfahren, was die Hauptursache für die Morbidität und Mortalität der Patienten ist. Daher besteht eine der größten Herausforderungen in der Brustkrebsforschung darin, die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Bildung von distalen Metastasen regulieren, um neue Mittel zur Hemmung ihrer Entwicklung zu entwickeln.

Krebsmetastasen sind ein dynamischer Prozess, bei dem sich Zellen vom Primärtumor lösen und durch den Blutkreislauf in benachbarte Gewebe eindringen. So können Tiermodelle, in denen die Zellen eine ähnliche metastatische Kaskade durchlaufen, die Identifizierung der Mechanismen erleichtern, die diesen Prozess steuern 3,4. Darüber hinaus sind diese In-vivo-Modelle für die Entwicklung von Brustkrebstherapeutikaunerlässlich 5,6. Diese orthotopen Modelle können jedoch nicht auf die tatsächliche Kinetik des Tumorwachstums hinweisen, da der Effekt erst bei Beendigung bestimmt wird. Daher haben wir ein Luciferase-basiertes Tool entwickelt, um Tumorentwicklung und metastasierende Besiedlung in Echtzeit zu erkennen. Zusätzlich exprimieren diese Zellen GFP, um die metastatischen Kolonien zu erkennen. Dieser Ansatz ist relativ einfach und beinhaltet keine invasiven Verfahren3. Daher ist die Kombination von Luciferase- und Fluoreszenzdetektion eine hilfreiche Strategie, um die präklinischen Studien von Brustkrebstherapeutika und Krankheitsmanagement voranzutreiben.

Protocol

Alle Mausexperimente wurden unter dem vom Hebrew University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokoll MD-21-16429-5 durchgeführt. Darüber hinaus ist die Hebrew University von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) zertifiziert. 1. Pflege der Zelllinie HINWEIS: Die menschlichen Brustkrebs-Zelllinien (MCF-7, MDA-MB-468 und MDA-MB-231) wurden in diesem Protokoll verwendet. Kultivieren Sie …

Representative Results

Wir erzeugten Brustkrebs-Zelllinien (MDA-MB-231, MCF-7 und MDA-MB-468), die GFP- und Luciferase-Vektoren exprimieren. Konkret wurde dies durch eine sequentielle Infektion erreicht. Zuerst wurden die Brustkrebszelllinien mit einem Lentivirus-Vektor infiziert, der fluoreszierendes GFP exprimierte. Die GFP-positiven Zellen (GFP+) wurden 2 Tage nach der Infektion sortiert (Abbildung 1A,B) und mit dem pLX304 Luciferase-V5-Vektor infiziert. Dann wurde Blasticidin verwen…

Discussion

Tierversuche sind für die Krebsforschungobligatorisch 7,8,9, und in der Tat wurden viele Protokolle entwickelt 3,6,10,11,12,13,14. Die meisten dieser Studien bestimmten die biologische Wirkung jedo…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Mitgliedern des Y.D.S.-Labors. Wir danken dem Wohl Institute for Translational Medicine am Hadassah Medical Center, Jerusalem, für die Bereitstellung der Kleintierbildgebungsanlage. Diese Studie wurde durch den Research Career Development Award des Israel Cancer Research Fund unterstützt.

Materials

1.7 mL eppendorf tubes Lifegene LMCT1.7B-500
10 µL tips Lifegene LRT10
1000 µL tips Lifegene LRT1000
15 mL tubes Lifegene LTB15-500
200 µL tips Lifegene LRT200
6 well cell culture plate COSTAR 3516
96 well Plates BLACK flat bottom Bar Naor BN30496
Automated Cell Counters Thermofisher A50298
BD FACSAria III sorter BD
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') BD 302200
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 BD 303172
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish CORNING 430167
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish CORNING 430599
Countess cell counting chamber slides Thermofisher C10228
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine Biological Industries 01-055-1A
Eclipse 80i microscope Nikon
eppendorf Centrifuge 5810 R Sigma Aldrich EP5820740000
Fetal Bovine Serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
FUW GFP Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
HEK293T Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)
Isoflurane, USP Terrell Piramal NDC 66794-01-25
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
L-Glutamine Solution Biological industries 03-020-1A
Living Image Software PerkinElmer bioluminescence measurement
MCF-7 ATCC ATCC HTB-22
MDA-MB-231 ATCC ATCC HTB-26
MDA-MB-468 ATCC ATCC HTB-132
Pasteur pipettes NORMAX 2430-475
PBS Hylabs BP655/500D
pCMV-dR8.2-dvpr Addgene #8455 Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
pCMV-VSV-G Addgene #8454 Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA)
Penicillin-Streptomycin Solution Biological Industries 03-031-1B
Petri dish 90 mm (90×15) MINI PLAST 820-090-01-017
Pipettes 10ml Lifegene LG-GSP010010S
Pipettes 25ml Lifegene LG-GSP010050S
Pipettes 5ml Lifegene LG-GSP010005S
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid Addgene #98580
Polybrene Sigma Aldrich #107689
Prism 9 GraphPad
Reagent Reservoirs Bar Naor BN20621STR200TC
SMZ18 Stereo microscopes Nikon
Sodium Chloride Bio-Lab 190359400
Syringe filters Lifegene LG-FPV403030S
Trypan Blue 0.5% solution Biological industries 03-102-1B
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1a
Vacuum driven Filters SOFRA LIFE SCIENCE SPE-22-500
Virusolve disinfectant
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade Promega P1043
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Sigma Aldrich #6366236001

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Solaimuthu, B., Hayashi, A., Khatib, A., Shaul, Y. D. Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence. J. Vis. Exp. (177), e63060, doi:10.3791/63060 (2021).

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