Kultur und Bildgebung von humanen nasalen Epithelorganoiden

Einführung in die Technik
Ex-vivo-kulturbasierte Assays sind ein zunehmend eingesetztes Werkzeug für die Präzisionsmedizin und das Studium der Krankheitspathophysiologie. Primäre humane Nasenepithel-Zellkultur (HNE) wurde in zahlreichen Studien zur Mukoviszidose^verwendet 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , eine autosomal-rezessive Erkrankung, die die Funktion von Epithelzellen in mehreren Organen beeinträchtigt. Die HNE-Kultur bietet eine erneuerbare Quelle für Atemwegsepithele, die prospektiv erhalten werden kann und elektrophysiologische und biochemische Eigenschaften rekapituliert, um die Aktivität des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) zu testen. HNE-Zellen können mit minimalen Nebenwirkungen¹⁴ beprobt werden, ähnlich wie bei herkömmlichen viralen Atemwegsabstrichen. Forschungsarbeiten, die ein Modell für Mukoviszidose-Studien beschreiben, die von HNE-Bürstenbiopsien abgeleitet wurden, wurden kürzlich^{veröffentlicht 11,13}. Während ähnlich wie bei anderen Modellen^{, die primäres} HNE^2,3 und Darmgewebe^{15,16,17,18,19} verwenden^, werden hier detaillierte Charakterisierungen der Differenzierung und Bildgebung dieses Modells für den Einsatz in der CF-Forschung und zur Unterstützung bei der Untersuchung anderer Atemwegserkrankungen beschrieben ¹³ . Das Organoidmodell ist nicht unbegrenzt wie immortalisierte Zelllinien, sondern kann durch bedingte Reprogrammierung (unter Verwendung von bestrahlten und inaktivierten Feeder-Fibroblasten und Rho-Kinase-Inhibitoren) auf einen stammzellähnlicheren Zustand^20,21,22,23 erweitert werden. Die Verarbeitung von HNE-Bürstenbiopsien mit dieser Methode ergibt eine große Anzahl von Epithelzellen, die in mehreren Anwendungen bei höherem Durchsatz eingesetzt werden können, während gleichzeitig die Fähigkeit zur vollständigen Differenzierung erhalten bleibt. Während dieses Protokoll unter Verwendung von Feederzellen entwickelt wurde, können andere Methoden von Forschern verwendet werden, die die Feederzelltechnologie vermeiden möchten^14,24.

Bedeutung der Technik für die Lungenbiologie
Eine bedeutende Studie wurde dem Verständnis gewidmet, wie das Fehlen von regelmäßiger, funktionierender CFTR in der Zellmembran von Epithelzellen zu Funktionsstörungen in der Lunge, der Bauchspeicheldrüse, der Leber, dem Darm oder anderen Geweben führt. Ein dysfunktionaler epithelialer Ionentransport, insbesondere der von Chlorid und Bicarbonat, führt zu einem verringerten Volumen der epithelialen Auskleidungsflüssigkeiten und zu Veränderungen der Schleimsekrete, was zu Schleimbildung und Obstruktion führt. Bei anderen Atemwegserkrankungen, wie der primären ziliären Dyskinesie, beeinträchtigt eine veränderte Ziliarbewegung die mukoziliäre Clearance und führt zu Schleimhautstauung und Obstruktion²⁵. Daher wurde das aktuelle HNE-Organoidmodell für verschiedene Anwendungen entwickelt, abhängig vom experimentellen Design und den Ressourcen des Prüfers. Dazu gehört die Lebendzellbildgebung unter Verwendung von Lebendzellflecken; Fixierung und Schnitt zur Charakterisierung der Morphologie; Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern und konfokale Bildgebung ganz, um eine Störung intraluminaler Strukturen zu vermeiden; und Hellfeldbildgebung und mikrooptische Kohärenztomographie zur quantitativen Messung der Ziliarschlagfrequenz und des mukoziliären Transports¹³. Um die Expansion zu anderen Forschern zu erleichtern, wurden kommerziell erhältliche Reagenzien und Vorräte für die Kultivierung verwendet. Es wurde ein funktioneller Assay entwickelt, der gängige Mikroskoptechniken und speziellere Geräte verwendete. Während das vorliegende Modell entwickelt wurde, um die CFTR-Aktivität zu Studienbeginn oder als Reaktion auf Therapeutika zu bewerten, können die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken auf andere Krankheiten angewendet werden, die die Funktion von Epithelzellen, insbesondere den Flüssigkeitstransport von Epithelzellen, betreffen.

Vergleich mit anderen Methoden
Vor kurzem wurde der Nutzen dieses Organoidmodells entwickelt, indem die In-vitro-CFTR-Modulatorreaktionen der Organoide der Patienten mit ihrer klinischen Reaktion^{korreliert wurden 11}. Insbesondere wird auch gezeigt, dass das vorliegende Modell parallel zu Kurzschlussstromreaktionen, dem aktuellen Goldstandard für die Beurteilung der CFTR-Funktion, bei denselben Patienten war. Der Kurzschlussstrom unterscheidet sich vom Quellassay, da ersterer die CFTR-Funktion über den Ionentransport misst²⁶. Im Gegensatz dazu misst dieser Assay einen eher nachgeschalteten Effekt mit dem Flüssigkeitstransport und liefert zusätzliche Informationen über die Gesamtfunktion von CFTR 27,28,29,30,31,32. Kurzschlussstrommessungen sind nach wie vor eine gängige und zuverlässige Methode zur Bestimmung der CFTR-Chloridkanalaktivität ^1,33. Diese elektrophysiologischen Assays erfordern spezielle, teure Ausrüstung, erfordern ein Vielfaches mehr Zellen für jedes experimentelle Replikat als der Organoid-Assay, können nicht einfach automatisiert werden und sind nicht für eine Skalierung für Anwendungen mit höherem Durchsatz geeignet. Ein weiteres Organoidmodell, das von der Darmepithel abgeleitet wurde, hat zusätzliche Vorteile^15,16,17,18, wie z.B. eine bessere Replikationsfähigkeit^, ist aber weder aus einem Atemwegsgewebe abgeleitet noch universell verfügbar. HNE-Bürsten werden mit kostengünstigen Zytologiebürsten ohne Sedierung und mit minimalem Risiko erhalten. Das Bürsten erfordert keinen Kliniker und kann von ausgebildeten Forschungskoordinatoren und anderen Forschungsmitarbeitern^{durchgeführt werden 14}. Das HNE-Organoidmodell kann von jedem Labor mit primären Zellkulturfähigkeiten kultiviert werden, und einige der Anwendungen können mit Standard-Mikroskopietechniken durchgeführt werden. Insgesamt bieten diese Vorteile einen zusätzlichen Zugang zu Technologien zur Beurteilung der Epithelfunktion der Atemwege, die sonst einigen Labors möglicherweise nicht zur Verfügung stünden. Darüber hinaus können HNE-Organoide verwendet werden, um andere Krankheitszustände zu untersuchen, die die Atemwege betreffen, wie primäre ziliäre Dyskinesie²⁵ oder Virusinfektion, die Darmorganoide nicht können.

HNE-Proben wurden im Children's of Alabama Hospital gesammelt. Alle hier beschriebenen Verfahren und Methoden wurden von der IRB University of Alabama in Birmingham (UAB IRB #151030001) zugelassen. Um die Expansion zu erleichtern und die Funktion menschlicher Nasenepithelzellen (HNEs) zu verbessern, werden die derzeitigen Kultivierungsmethoden von der bekannten Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle (ALI) Kulturmethode^28,34 übernommen. HNEs wurden zunächst durch Bürstenbiopsie gesammelt, wie zuvor beschrieben^12,14, mit dem einzigen Unterschied^, der die Verwendung einer zytologischen Bürste war. Alle Probenverarbeitungsschritte und die Zellkultur wurden in der Biosicherheitskabine durchgeführt.

1. Zellkultur und Expansion von Nasenepithelzellen

1. Lagern Sie die Nasenbiopsieprobe nach dem Bürsten in 8 ml RPMI-Medien in einem konischen 15-ml-Röhrchen auf Eis und bringen Sie sie innerhalb von 4 h (nicht mehr als 24 h) ins Labor.
2. Dissoziieren Sie die Nasenbürstenbiopsie in 8 ml RPMI-Medien in einem konischen 15-ml-Röhrchen, indem Sie die Zytologiebürste mehrmals durch eine 1 ml große Pipettenspitze (schneiden Sie die Spitze ab) durch, bis die Bürste frei von Gewebe ist.
3. Zentrifen Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie dann das Zellpellet erneut in 3 ml Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 16 Minuten zum Aufschluss.
4. Verwenden Sie 5 ml Expansionsmedien (Tabelle 1), um die Zellen zweimal zu waschen. Fügen Sie dann Zellen in einen T75-Kolben hinzu, der mit bestrahlten und inaktivierten 3T3-Fibroblasten²² (50% -60% Konfluenz) vorsät ist, um die Zellen zu kokultivieren und sich für 7-14 Tage in den Expansionsmedien auszudehnen (siehe Abbildung 1 für die entsprechende Kolonie). Testen Sie vor der Anwendung die bestrahlten 3T3-Fibroblasten, um sicherzustellen, dass sie sich nicht vermehren können, was die Expansion der Epithelzellen negativ beeinflusst.
   HINWEIS: Verwerfen Sie die Zellen, wenn der Zusammenfluss der Nasenepithelzellen nicht innerhalb von 14 Tagen 70% erreicht.
5. Für die von CF-Patienten gewonnenen Zellen vier Antibiotika (100 μg/ml Tobramycin, 2,5 μg/ml Amphotericin B, 100 μg/ml Ceftazidim, 100 μg/ml Vancomycin, siehe Materialtabelle) in die Expansionsmedien zur Desinfektion der Zellen für die ersten 3 Tage der Kultur einführen und dann die Medien durch antibiotikafreie Expansionsmedien ersetzen, die alle 2 Tage das Medium wechseln.
   HINWEIS: Dieser begrenzte Einsatz von Antibiotika soll den Kulturverlust aufgrund der bakteriellen Besiedlung reduzieren und gleichzeitig die Vermehrung fördern, nachdem die zusätzlichen Antibiotika entfernt wurden. Diese Antibiotika können auf die spezifischen mikrobiologischen Ergebnisse des Patienten zugeschnitten werden, bei Bedarf mit Empfindlichkeiten.
6. Ernten Sie HNEs aus der Kokultur mit der Doppeltrypsinisierungsmethode^22, sobald die Zellen einen Zusammenfluss von etwa 80% erreicht haben. Diese Methode stellt sicher, dass die bestrahlten und inaktivierten 3T3-Fibroblasten aus dem Kolben entfernt werden und die nachfolgende organoide Aussaat nicht kontaminieren.
   1. Waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS und fügen Sie dann 1,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA für 4 Minuten bei 37 ° C in den T75-Kolben hinzu, um den bestrahlten und inaktivierten 3T3-Fibroblasten aus der Kultur zu entfernen.
   2. Spülen Sie den T75-Kolben zweimal mit 1x DPBS ab, um die verbleibenden 3T3-Fibroblasten gründlich abzuwaschen. 1,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA für 10 min bei 37 °C in den T75-Kolben geben, um HNEs zu lösen.
   3. Neutralisieren Sie das Trypsin mit Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:1. zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min und entfernen Sie dann den Überstand. Nachdem die Zellen einmal mit 5 ml Expansionsmedien gewaschen wurden, sind die Zellen bereit für die Aussaat, um Organoide zu züchten.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, HNEs mit einer Durchgangszahl von drei für weitere Experimente zu verwenden.

2. Wachstum und Differenzierung von Organoiden in Objektträgern und Kultureinsätzen

1. Tauen Sie die extrazelluläre Matrix (ECM) der Organoidkultur über Nacht bei 4 °C auf. Pipettenspitzen auf 4 °C und 15-Well-Angiogenese-Objektträger (siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 °C abkühlen.
   HINWEIS: ECM sollte in der Nacht, bevor die Zellernte durchgeführt werden muss, auf 4 ° C gestellt werden.
2. Beschichten Sie die Objektträger mit 5 μL kaltem 100% ECM auf Eis (Pipette 5 μL kaltes 100% ECM mit einer kalten Pipettenspitze in jedes Vertiefungsfeld des 15-Well-Objektträgers) und legen Sie sie dann für mindestens 30 Minuten zur Konsolidierung in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C.
3. Zählen Sie die aus der Kokultur gewonnenen HNE mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie die Zellen auf insgesamt 500 Zellen/μL, wobei 20% ECM durch Differenzierungsmedien verdünnt werden (Tabelle 2) auf Eis. Dann werden 5 μL der kalten Zelle / ECM-Mischung in jede Vertiefung der mit ECM beschichteten Objektträger eingelegt.
4. Sofort die Objektträger für 1 h in einen Kulturinkubator bei 37 °C überführen, um das Zell/ECM-Gemisch zu konsolidieren.
5. Füttern Sie die Zellen in jeder Vertiefung der 15-Well-Angiogenese-Objektträger mit 50 μL Differenzierungsmedien. Wechseln Sie die Medien alle zwei Tage, bis die Organoide für weitere Experimente bereit sind.
   HINWEIS: Organoide können in der Regel nach 1-2 Tagen visualisiert werden. Es gibt 20-90 Organoide, die üblicherweise in jeder Vertiefung der Objektträger gebildet werden. Die Organoide können typischerweise 40-60 Tage in ECM überleben, wobei sie jeden zweiten Tag gefüttert werden, wenn sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C gehalten werden.
6. Kultur der Organoide in den Kultureinlagen (siehe Materialtabelle) für eine größere Menge für spezifische Anwendungen (z. B. Schnitt für die Histologie oder Immunfluoreszenz) gemäß den unten genannten Schritten.
   1. Um Organoide in den Kultureinsätzen zu züchten, bereiten Sie die EZM, die Pipettenspitzen und die Einsätze der Organoidkultur vor, wie in den Schritten 2.1-2.2 erwähnt. Beschichten Sie die Einsätze mit 100 μL kaltem 100% ECM.
   2. Saatgut 60 μL Zell/ECM-Gemisch (500 Zellen/μL mit 20% ECM in Differenzierungsmedien) auf der ECM-Beschichtung im Einsatz.
      HINWEIS: Alle anderen Schritte zur Herstellung von Organoiden in den Einsätzen sind die gleichen wie in den Folien, Schritte 2.4-2.5.
   3. 600 μL des Differenzierungsmediums in den unteren Teil des Einsatzes geben. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag, bis die Organoide für Experimente verwendet werden, typischerweise 2-3 Wochen.

3. Herstellung und Isolierung von Organoiden für die Immunfluoreszenz im ganzen Gehäuse

1. Isolierung und Fixierung von Organoiden
   1. Vorbehandlung von 8-Well-Glasboden-Kammerobjektträgern mit Zellkleber (siehe Materialtabelle) für 30 Minuten gemäß Referenz³⁵. Nachdem Sie die Lösung verworfen haben, trocknen Sie die Vertiefungen 30 Minuten lang an der Luft.
   2. Um die Organoide zu ernten, entfernen Sie die Medien von der Oberseite des ECM und fügen Sie dann 50 μL kaltes 1x PBS in jede Vertiefung der 15-Well-Rutschen auf Eis (1: 1 mit ECM-Volumen) hinzu.
   3. Pipettieren Sie 3-5 Mal mit 200 μL der großlaufenden Pipettenspitze auf und ab und dosieren Sie die Lösung dann auf die Mitte einer Vertiefung der 8-Well-Kammerobjektträger.
   4. Entfernen Sie sofort überschüssige Flüssigkeit aus den Vertiefungen durch eine feinspitzen Pipette. Legen Sie dann den Kammerschieber für 40 Minuten in einen 37 ° C-Inkubator, um das Organoid, das am Glasboden haftet, zu verbessern.
   5. Nachdem Sie zweimal vorsichtig mit 1x PBS gewaschen haben, fixieren Sie die Organoide mit 300 μL 4% Paraformaldehyd in jeder Vertiefung für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
   6. Zweimal mit 1x PBS waschen und die Organoide in 1x PBS bei 4 °C zur Immunverfärbung bis zu 2 Wochen lagern.
2. Immunfluoreszenzfärbung
   1. Um die Autofluoreszenz zu reduzieren, fügen Sie 250 μL 50 mM NH₄Cl in 1x PBS für 30 min in jede Vertiefung der Objektträger bei RT hinzu, während Sie sanft auf einem Shaker bei 20 U / min schütteln.
   2. Nachdem Sie zweimal mit 1x PBS gewaschen haben, permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1% Triton X-100 für 30 min bei RT, während Sie bei 20 U / min sanft schütteln.
   3. Nachdem Sie zweimal mit 1x PBS gewaschen haben, fügen Sie 300 μL Blockierlösung, einschließlich 5% BSA und 0,1% Triton X-100 in 1x PBS, in jede Vertiefung für 1 h bei RT hinzu.
   4. Nach dem Waschen Primärantikörper in die entsprechenden Vertiefungen geben, gefolgt von sekundären Antikörpern (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie primäre und sekundäre Antikörperlösungen in 2% BSA und 0,3% Triton X-100 in 1x PBS vor. Inkubieren Sie alle primären Antikörper bei 4 °C für 2 Tage und alle sekundären Antikörper bei 4 °C für 1 Tag.
      HINWEIS: Die Endkonzentrationen hängen von dem für das Experiment gewünschten Protein ab. Bitte überprüfen Sie die Lagerkonzentration auf dem Datenblatt des Herstellers. Berechnen Sie dann die Endkonzentrationen basierend auf den in der Materialtabelle verwendeten Verdünnungen.
   5. Nach der Inkubation waschen Sie die Vertiefungen gründlich mit 1x PBS und fügen Sie DAPI in 2% BSA und 0,3% Triton X-100 in jede Vertiefung für die Kernfärbung hinzu.
   6. Bilden Sie die Organoide mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 20-60-fachen Öl-Tauchobjektiv ab (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie den Z-Stack-Modus, um die oberen und unteren Grenzen des Bildes festzulegen, und verwenden Sie die empfohlene optimale Z-Schritt-Größe, die von der konfokalen Software bestimmt wird.
      HINWEIS: Die folgenden vier konfokalen Laseranregungswellenlängen wurden verwendet: 408,7 nm, 489,1 nm, 561,7 nm und 637,9 nm.

4. Herstellung und Isolierung von Organoiden für histologische Schnitte

1. Um die Organoide für histologische Studien zu ernten, entfernen Sie die Medien aus der Kultur und fügen Sie 50 μL kaltes 1x PBS in jede Vertiefung der Objektträger auf Eis hinzu.
2. Pipetten Sie drei- bis fünfmal mit einer 200-μL-Pipettenspitze mit großer Bohrung auf und ab, kombinieren Sie alle Lösungen aus dem 15-Well-Schieber oder den Kultureinsätzen in einem 15 ml konischen Rohr auf Eis. Stellen Sie das Gesamtlösungsvolumen im Rohr auf 10 ml ein, indem Sie zusätzliche kalte 1x PBS hinzufügen.
3. Zentrieren Sie das Rohr bei 4 °C, 300 x g für 5 min; Den Überstand absaugen und 60 μL warmes Histogel (siehe Materialtabelle) hinzufügen, um es mit dem Organoidpellet zu mischen, wobei eine 200 μL der großkalibrigen Pipettenspitze verwendet wird.
4. Übertragen Sie die Suspension sofort in eine histologische Form. Nach der Konsolidierung des Histogels bei Raumtemperatur wird der Formblock in 4% Paraformaldehyd zur Fixierung über Nacht bei 4 °C gegeben.
5. Nach der Einbettung in Paraffin schneiden Sie den Histogelblock in 5-μm-Querschnitte (z. B. mit einem Mikrotom), fixieren Sie die Abschnitte auf Glasobjektträgern und färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) oder Immunfluoreszenz-markierten Antikörpern. Nehmen Sie Bilder mit einem Hellfeldmikroskop oder einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop auf (siehe Materialtabelle).

5. Bildgebung lebender Organoide

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden mit einem automatisierten Bildgebungssystem durchgeführt (siehe Materialverzeichnis). Verschiedene Bildgebungssysteme müssen diese Schritte gemäß den Anweisungen ihres spezifischen Herstellers anpassen. Unabhängig von der verwendeten Ausrüstung erfordern bildgebende lebende Organoide eine temperaturgesteuerte und befeuchtete Umgebungskammer mit einem begleiteten CO 2-Gasregler.

1. Um die Differenzierung von Organoiden zu überwachen, bevor ein funktioneller Quellassay³⁶ durchgeführt wird, erfassen Sie die gesamten Objektträgerbilder manuell mit einem beliebigen Hellfeldmikroskop oder mit einem automatisierten Bildgebungssystem, wie unten beschrieben.
   1. Schalten Sie das automatische Bildgebungssystem und den CO₂ /_O2-Gasregler ein und lassen Sie das System die automatische Kalibrierung (~ 30 min) abschließen.
   2. Stellen Sie nach Abschluss die Temperatur des Bildgebungssystems auf 37 °C ein. Geben Sie 15 ml steriles Wasser in den Befeuchtungsbehälter_, öffnen Sie die CO 2-Ventile, schließen Sie die Deckel und lassen Sie das Bildgebungssystem vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten vorinkubieren.
   3. Öffnen Sie die automatisierte Bildverarbeitungssoftware, um ein Protokoll für die Bildgebung einzurichten, und wählen Sie den Speicherort für die experimentellen Rohdaten aus.
      HINWEIS: Eine Beispielprotokolldatei (Supplementary File 1), die für das Bildgebungssystem spezifisch ist, wurde als Vorlage für die automatisierte Bildgebung von Organoiden zur Überwachung der Organoiddifferenzierung bereitgestellt.
   4. Sobald die Umgebungseinstellungen erfüllt sind, übertragen Sie sofort bis zu zwei 15-Well-Objektträger mit Deckeln in die Umweltkammer im Objektträgereinsatz des automatisierten Bildsystems (siehe Materialtabelle).
   5. Wählen Sie die zu bebildernden Vertiefungen aus und beginnen Sie mit der Bildgebung, um die Bildgebung der gewünschten Vertiefungen abzuschließen.
      HINWEIS: Die empfohlenen Grundeinstellungen sind: 4x und 10x Luftobjektiv, Hellfeldkanal, 2 x 2 Montage für 4x Objektiv, um den gesamten Bohrlochbereich abzudecken, 4 x 4 Montage für ein 10x Objektiv. Z-Stack-Einstellungen: drei bis sechs Z-Stack-Slices, Z-Step-Größe = 50-100 μm, ein bis zwei Slices unter dem Autofokuspunkt und drei bis fünf Slices darüber.
2. Um lebende Organoide für die Verwendung in einem Forskolin-induzierten Quellungsassay (FIS) abzubilden, verwenden Sie ein Mikroskop mit einem automatisierten Tisch, der mit einer umweltkontrollierten Bildgebungskammer ausgestattet ist, die eine Temperatur- und CO_2-Kontrolle ermöglicht.
   1. Beginnen Sie mit den Schritten 5.1.1-5.1.4 und ersetzen Sie die Protokolldatei in Schritt 5.1.3 durch die Protokolldatei in der Beispielprotokolldatei (Ergänzende Datei 2), die spezifische Einstellungen für die Durchführung eines FIS-Assays enthält.
   2. Passen Sie vor jedem Experiment die Belichtungseinstellungen an, indem Sie mindestens drei Vertiefungen für jede Folie (ganz links, Mitte und ganz rechts) auswerten. Wenden Sie die X- und Y-Koordinaten-Offsets an, um sicherzustellen, dass sich das Ziel für alle Bohrungen in der Mitte des Bohrlochs befindet.
      HINWEIS: Die empfohlenen Grundeinstellungen sind: 4x Luftobjektiv, Kanal 1 = Helles Feld, Kanal 2 = DAPI, 2 x 2 Montage (vier Bildkacheln). Z-Stack-Einstellungen: drei bis vier Z-Stack-Slices, Z-Step-Größe = 50-100 μm, eine Slice unter dem Autofokuspunkt und zwei bis drei Slices darüber. Bildaufnahmezeit: 8 h mit 20-minütigen Intervallen (Gesamtzahl der Lesevorgänge = 25; Read 1 ist T = 0).
   3. Sobald alle Einstellungen entsprechend ausgewählt sind, wählen Sie die Vertiefungen aus, die für beide Folien abgebildet werden sollen, oder wählen Sie alle aus und beginnen Sie den Lauf gemäß den Anweisungen des Geräts.
   4. Speichern Sie nach dem Ausführen das Experiment, schließen Sie die Bildgebungssoftware, und fahren Sie das Bildgebungssystem³⁷ herunter.

6. Ausgangslumenmessungen

HINWEIS: Dies geschieht mit manueller Bildanalysesoftware (siehe Materialverzeichnis). Eine ähnliche Methodik kann mit einer Open-Source-Software³⁸ oder einer anderen Software verfolgt werden, die die Fläche einer Region auf einem Bild messen kann.

1. Öffnen Sie in der Software das Bedienfeld "Automatisierte Messung", indem Sie mit der rechten Maustaste auf den unteren Bildschirmrand klicken, Messung und dann Automatisierte Messergebnisse auswählen. Die Fläche jeder Region von Interesse (ROI), die gemessen wird, wird dort angezeigt.
2. Öffnen Sie das Organoidbild in der Software und wählen Sie 5-10 Organoide mit sichtbaren Lumen aus.
   HINWEIS: Lumen sind ein kreisförmiger Bereich in der Mitte des Organoids, der sich in seiner Farbe sichtbar vom Rest des Organoids unterscheidet (Abbildung 2A).
3. Halten Sie mit der Polygon-ROI-Messfunktion einen Rechtsklick auf das Bild gedrückt, um das Menü zu öffnen, und wählen Sie Polygonal ROI , um das vollständige Organoid zu skizzieren, um die Gesamtoberfläche (TSA) des Organoids zu erhalten. Beschreiben Sie dann mit demselben Feature den Lumenbereich (LA) (Abbildung 2B).
4. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Organoide im Bohrloch und alle Vertiefungen im Assay.
5. Exportieren Sie die Daten nach Excel. Teilen Sie den LA durch die TSA und mitteln Sie alle Organoide aus der Probe, um das Baseline Lumen Ratio (BLR) ^11,13 zu erhalten.
   HINWEIS: Typischerweise haben ~ 87% der Nicht-CF-Organoide eine BLR über 0,6 und 97% über 0,5, während nur 14% der CF-Organoide eine BLR über 0,6 und 31% über 0,5 haben.

7. Vorbehandlung und automatisierte Bildgebung von HNE-Organoiden

HINWEIS: Alle Vorbehandlungsschritte werden in einer sauberen Biosicherheitskabine durchgeführt. Richten Sie das automatisierte Bildgebungssystem und die Software zur Aufzeichnung des Assays vor Schritt 7.1 vor. Die Inkubation mit DAPI ist optional, wird aber als ausfallsicher empfohlen, wenn die Qualität von Hellfeldbildern beeinträchtigt ist. In diesem Fall kann stattdessen der DAPI-Kanal (377 nm) analysiert werden.

1. Vorinkubieren Sie die Organoide in einer Vertiefung von 15-Well-Objektträgern mit 50 μL Differenzierungsmedien, die DAPI enthalten, mit oder ohne 100 μM CFTRinh-172 (siehe Materialtabelle) in einem 37 °C Inkubator für 1 h. Während die Organoide inkubieren, führen Sie Schritt 5.2.1 mit einem benutzerdefinierten Schwellungsassay-Protokoll nach Supplementary File 2 durch.
2. Entfernen Sie das Vorinkubationsmedium mit einer Pasteur-Pipette aus Glas mit Aspiration. Geben Sie 10 μM Forskolin und 100 μM IBMX (Stimulationscocktails) (siehe Materialtabelle) für ein Gesamtvolumen von 50 μL Differenzierungsmedien in jedes Well.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Blasen in die Brunnen eingeführt werden. Blasen auf den Bildern wirken sich auf die automatisierte Analyse aus.
3. Beginnen Sie unverzüglich mit dem FIS-Imaging-Protokoll gemäß den Schritten 5.2.2 bis 5.2.4. Erfassen Sie Bilder alle 20 Minuten in jedem Bohrloch mit einer Gesamtlaufzeit von 8 h.

8. Automatisierte Analyse des Forskolin-induzierten Schwellungstests auf HNE-Organoiden

1. Öffnen Sie die automatisierte Bildanalysesoftware, suchen Sie das zuvor aus Schritt 7.3 gespeicherte Experiment, und rufen Sie die Bilder des Experiments auf.
2. Wählen Sie das zu bewertende Gefäßfenster aus und wählen Sie die Option mit den verarbeiteten Bildern, die zusammengefügt und z-projiziert wurden. Dieser Schritt sollte ein Bild des gesamten Bohrlochs mit allen Organoiden innerhalb des Bildgebungsrahmens zur Maskierung von Bewertungen und Messungen liefern.
3. Wählen Sie das zu bewertende Bohrlochbild aus. Wählen Sie Analysieren aus. Wiederholen Sie diesen Vorgang für andere Bilder, um eine angemessene Maskierung für alle Bilder sicherzustellen, die in den automatisierten Messungen enthalten sind. Speichern Sie die Einstellungsparameter.
4. Nachdem Sie die Analyseeinstellungen abgeschlossen haben, übernehmen Sie die Änderungen. Die Software ändert die Messungen basierend auf den Einstellungen.
   HINWEIS: Nachdem die anfängliche Bildvorverarbeitung abgeschlossen ist, sollten Qualitätskontrollmaßnahmen (QC) durchgeführt werden, um eine konsistente Maskierung zu gewährleisten. Dazu gehören die manuelle Überprüfung aller Vertiefungen, um sicherzustellen, dass sich Organoide innerhalb des Bildgebungsrahmens befinden, Blasen oder Ablagerungen nicht unangemessen maskiert sind, und die Überprüfung der Maskierung in Hellfeld- und DAPI-Kanälen.
5. Exportieren Sie die Daten für die zusammenfassende Analyse (einschließlich Grafiken und statistischer Analysen).

Die Expansion von HNE ist für eine blühende Organoidkultur unerlässlich. HNEs aus einer erfolgreichen Probenentnahme sollten sich auf über 70% Konfluenz um 10 Tage ausdehnen. Ein Beispiel für erfolgreiche und nicht erfolgreiche Stichproben ist in Abbildung 1A bzw. Abbildung 1B dargestellt. Die Zellen müssen verworfen werden, wenn sie 14 Tage nach der Co-Kultur mit bestrahlten 3T3-Zellen keinen 70%igen Zusammenfluss erreichen können. Kontaminierte Zellen sind sofort zu entsorgen, wenn sie nicht schnell mit zusätzlichen antimikrobiellen Wirkstoffen gerettet werden können.

Das Wachstum der Organoide wurde in 15-Well-Objektträgern und Kultureinsätzen verglichen. Die Kultureinsätze sind dicker und weiter vom Objektiv entfernt als die optisch optimierten Dias und wirken sich auf das Bild und die Auflösung aus. Trotzdem wurde bei diesen beiden Kulturmethoden kein signifikanter Unterschied in der Morphologie beobachtet, wie in Abbildung 2 gezeigt. Morphologische Unterschiede sind zwischen Nicht-CF- und CF-Organoiden zu sehen, wie in Abbildung 3A gezeigt. Nicht-CF-Organoide neigen dazu, ein größeres Lumen zu haben, das mehr Flüssigkeit enthält. Im Gegensatz dazu haben CF-Organoide normalerweise ein kleineres Lumen mit weniger Flüssigkeit und sind manchmal mit Schleim und Ablagerungen gefüllt. Die Lumengröße wurde manuell gemessen (Abbildung 3B), und das Ausgangs-Lumenverhältnis wurde berechnet und in Abbildung 3C gezeigt. Querschnittsorganoide wurden mittels H&E- und Immunfluoreszenzfärbung charakterisiert. Die repräsentativen Bilder sind in Abbildung 4A,B dargestellt. Atemwegsepithelmarker wie Zilien, Schleim und Tight Junction werden in Organoiden durch ganzmontierbare Immunfluoreszenzfärbung in Abbildung 5A-D gezeigt. Je nach Anwendung kann eine geschnittene oder ganzmontierbare Immunfluoreszenz eingesetzt werden. Die Whole-Mount-Methode behält die dreidimensionale Natur des Organoids bei und hält das Innere des Organoids intakt, wie in der zuvor veröffentlichten Arbeit13 gezeigt.

Die CFTR-Funktion wurde mittels Forskolin-induzierter Schwellung (FIS) unter Verwendung eines automatisierten Bildgebungssystems beurteilt. Für Funktionsassays werden aufgrund der besseren Bildauflösung nur 15-Well-Dias verwendet. Ein repräsentatives Forskolin-Dosis-Wirkungs-Experiment von Nicht-CF-Freiwilligen (n = 5 Probanden) ist in Abbildung 6A dargestellt, um die Gründe für die optimierte Bildgebungszeit und -analyse zu veranschaulichen. Daten, die Nicht-CF- und CF-Organoid-Antworten vergleichen, sind in früheren Veröffentlichungen11,13 detailliert beschrieben. Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung zeigt die inkrementelle Änderung der CFTR-Aktivität, um den besten Ansatz für Messungen zu demonstrieren. Die Assay-Dauer von 1 h und 8 h wurde ausgewertet (Abbildung 6B,C) sowie die Analyse unter Verwendung der durchschnittlichen Bruchteilsänderung (AFC) gegenüber der Fläche unter der Kurve (AUC) ist in den Abbildungen 6C,D zu sehen. Basierend auf unseren früheren Erfahrungen erreicht die Schwellung bei den meisten Probanden und Bedingungen nach 8 h ein Plateau und führt in einigen Fällen zu einem Platzen der Organoide in dieser Zeit. Daher waren die Assays auf nur 8 h beschränkt. Bei dieser verlängerten Assay-Länge wird die Schwellung nichtlinear. Die Verwendung der AUC berücksichtigt auch sowohl die Größenänderungen als auch die Veränderungsrate. Daher wurde die AUC über 8 h für alle FIS-Assays in der endgültigen Methodik verwendet.

Abbildung 1: Hellfeldbilder von HNEs in Co-Kultur. HNEs dehnen sich in Expansionsmedien mit bestrahlten und inaktivierten 3T3-Fibroblasten für 10 Tage aus. Ein invertiertes Hellfeldmikroskop wird zur Abbildung der Zellen verwendet. (A) HNEs wachsen gut in einem großen Cluster (schwarzer Pfeil). Im Gegensatz dazu wachsen die HNEs in (B) schlecht in zwei kleinen Clustern (schwarze Pfeile), die bestrahlte 3T3-Zellen umgeben. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: HNE-Organoidbildung in einem 15-Well-Objektträger und Kultureinsatz. Hellfeldbilder von Organoiden wurden mit einem invertierten Hellfeldmikroskop über 21 Tage aufgenommen. Organoide im 15-Well-Dia (A) haben präzisere und schärfere Bilder als die im Kultureinsatz (B). Es wurde kein morphologischer Unterschied zwischen den im Objektträger kultivierten Organoiden und dem Insert beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Organoid-Lumengröße (Panel A) und Lumenmessungen (Panel B und C). (A) Nicht-CF-Organoide haben typischerweise ein größeres Lumen und mehr Flüssigkeit als CF-Organoide (F508del/F508del). (B) Eine Methode zur manuellen Messung der Gesamtoberfläche (TSA), die durch den roten Umriss und die Lumenfläche (LA) angezeigt wird, die durch den grünen Umriss in einem einzigen Organoid angezeigt wird. (C) Ein Beispiel für die Verwendung der Gesamtoberfläche und der Lumenfläche zur Berechnung des Ausgangs-Lumenverhältnisses (LA: TSA) in Organoiden aus einem Nicht-CF- im Vergleich zu einem CF-Probanden. Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Querschnitt der in Paraffin eingebetteten Organoide. (A) Ein Beispiel für H&E-Färbungen in Organoiden aus einem Nicht-CF- und CF-Subjekt (F508del/F508del). (B) Immunfluoreszierende Färbung von Kielen in einem Organoid. Grün ist die Zilien (weißer Pfeil), die mit Acetyl-Tubulin und FITC-markierten sekundären Antikörpern gefärbt sind, und blau ist der Kern, der mit DAPI markiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Konfokale Bilder der Immunfluoreszenz ganzer Montierung in Organoiden. (A,C) Maximale Projektionsbilder der beiden repräsentativen Organoide. (B,D) Dreidimensionale Rekonstruktionsbilder von (A) bzw. (C). Ein 8-Well-Glasbodenobjektträger wurde auf der Plattform eines konfokalen Mikroskops angebracht, und die 40-fache Linse wurde verwendet, um die Mikroaufnahmen zu erstellen. Für die Bildgebung und Rekonstruktion der Bilder wurde eine Bildanalysesoftware eingesetzt. Weiße Pfeile zeigen Schleim (in B) und Zilien (in C) innerhalb des Lumens der Organoide an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Begründung für die Länge des Anschwellenassays und Analysemethoden. Forskolin (FSK)-induzierter Schwellungstest (FIS) zum Testen der CFTR-Funktion an den primären Nasenepithelzellen. Die in den Abbildungen angegebene unterschiedliche Dosis von Forskolin wurde in 21 Tage alte Organoide in den Differenzierungsmedien verabreicht; Die organoide Schwellung wurde sofort mit dem automatisierten Imager für 8 h aufgezeichnet. Nach 8 h wird die Schwellung in (A) (n = 5, Nicht-CF-Probanden) unter Verwendung der durchschnittlichen Bruchänderung (AFC) gezeigt. FSK Dosis-Wirkungs-Verhältnis wird mit AFC bei 1 h (B) vs. bei 8 h (C) verglichen, was darauf hindeutet, dass der 8-h-Assay einen signifikanteren Quellunterschied zwischen verschiedenen FSK-Dosen erzeugen kann als die bei 1 h. AFC (C) im Vergleich zur Fläche unter der Kurve, AUC (D) bei 8 h werden verglichen, was darauf hindeutet, dass AUC einen geringfügigen Quellunterschied als AFC widerspiegeln kann. Die X-Achse in Tafeln (B-D) stellt die verschiedenen Behandlungsbedingungen dar, die den Symbolen in der Abbildungslegende entsprechen. Alle Fehlerbalken in den Abbildungen zeigen die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Alle Komponenten für die Herstellung der Erweiterungsmedien. Die detaillierten Informationen über die Konzentration des Reagenzienbestands, die Lagerhaltung, die Menge des Bestands für die Herstellung eines 500-ml-Mediums und die Endkonzentration wurden beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Alle Komponenten für die Herstellung von Differenzierungsmedien. Die detaillierten Informationen über die Konzentration des Reagenzienbestands, die Lagerhaltung, die Menge des Bestands für die Herstellung eines 500-ml-Mediums und die Endkonzentration wurden beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Eine Beispielprotokolldatei speziell für das Bildgebungssystem wird als Vorlage für die automatisierte Bildgebung von Organoiden zur Überwachung der Organoiddifferenzierung bereitgestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Eine Beispielprotokolldatei mit spezifischen Einstellungen für die Durchführung eines FIS-Assays. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

JSG ist als Erfinder auf einer Patentanmeldung 20170242033 der University of North Carolina aufgeführt, die ein ähnliches Modell beschreibt. Wenn lizenzierte Technologie von UNC Lizenzgebühren produziert, erhalten die Erfinder einen Anteil an den Einnahmen. Ansonsten erklären die Autoren keine Interessenkonflikte. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, bei der Sammlung, Analyse oder Interpretation von Daten, beim Schreiben des Manuskripts oder bei der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.