Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التحكم في الالتصاق الخلية باستخدام تقنيات النقش هيدروجيل للتطبيقات في المجهر قوة الجر

Published: January 29, 2022 doi: 10.3791/63121
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 3, 3, 2, 1
1Department of Cellular Biophysics, Max Planck Institute for Medical Research, 2Institute for Theoretical Physics and BioQuant, Heidelberg University, 3Institute for Molecular Systems Engineering (IMSE), Heidelberg University

Summary

يتم الجمع بين الطباعة الحجرية القريبة من الأشعة فوق البنفسجية والمجهر قوة الجر لقياس القوى الخلوية على الهيدروجيلات micropatterned. يتيح الإطلاق الموجه للخلايا المفردة الناجم عن الضوء عددا كبيرا من القياسات على نفس العينة.

Abstract

قوة الجر المجهرية (TFM) هو الأسلوب الرئيسي المستخدم في علم الأحياء الميكانيكية لقياس قوات الخلية. عادة ما يتم استخدام هذا للخلايا التي تلتزم الركائز الناعمة المسطحة التي تشوه تحت الجر الخلية (2D-TFM). تعتمد TFM على استخدام المواد المرنة الخطية، مثل البوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS) أو البولي أكريلاميد (PA). بالنسبة ل 2D-TFM على السلطة الفلسطينية ، فإن صعوبة تحقيق إنتاجية عالية تنتج بشكل رئيسي عن التباين الكبير في أشكال الخلايا والجر ، مما يدعو إلى التوحيد القياسي. نحن نقدم بروتوكولا لتصنيع بسرعة وكفاءة micropatterned السلطة الفلسطينية الهيدروجيلات لدراسات 2D-TFM. يتم إنشاء المغذيات الدقيقة لأول مرة عن طريق التصوير الضوئي بدون قناع باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية القريبة حيث ترتبط بروتينات المصفوفة خارج الخلية فقط بالمناطق المجهرية ، في حين أن بقية السطح لا يزال غير لاصق للخلايا. يرجع التجزؤ الدقيق لبروتينات المصفوفة خارج الخلية إلى وجود مجموعات ألدهيد نشطة ، مما يؤدي إلى مناطق لاصقة من أشكال مختلفة لاستيعاب الخلايا الفردية أو مجموعات من الخلايا. لقياسات TFM، ونحن نستخدم هيدروجيل السلطة الفلسطينية من مرونة مختلفة عن طريق تغيير كميات من الأكريلاميد وببيس أكريلاميد وتتبع تشريد الخرز الفلورية جزءا لا يتجزأ لإعادة بناء حقول الجر الخلية مع قياس الخلايا تحويل فورييه (FTTC).

لتحقيق مزيد من التسجيل الدقيق لقوات الخلية، ونحن نصف استخدام جرعة تسيطر عليها من الضوء المنقوش لإطلاق الجر الخلية في مناطق محددة لخلايا واحدة أو مجموعات من الخلايا. ونحن ندعو هذه الطريقة المحلية الأشعة فوق البنفسجية قوة الجر المجهر (LUVI-TFM). مع العلاج الأنزيمي ، يتم فصل جميع الخلايا عن العينة في وقت واحد ، في حين أنه مع قوى الجر LUVI-TFM من الخلايا في مناطق مختلفة من العينة يمكن تسجيلها في التسلسل. ونبين قابلية هذا البروتوكول للتطبيق '1' لدراسة قوى الجر الخلوية كدالة للالتصاق الخاضع للرقابة بالركيزة، و'2' تحقيق عدد أكبر من الملاحظات التجريبية من العينة نفسها.

Introduction

عند التفاعل مع بيئتها خارج الخلية ، تمارس الخلايا الملتصقة قوى يتم التوسط فيها بشكل رئيسي من خلال الالتصاقات البؤرية القائمة على integrin التي تربط المصفوفة خارج الخلية (ECM) بالهيكل الخلوي actin. الالتصاقات البؤرية هي تجميعات متعددة الحماية التي تتركز حول ربط integrins إلى بروتينات ECM مثل فيبروكتين والكولاجين. إن تجميع Integrin ونمو التصاقات البؤرية أمر بالغ الأهمية ليس فقط لإنشاء اتصال مستقر ميكانيكيا ، ولكن أيضا لتوظيف بروتينات التصاق بؤرية أخرى ، بما في ذلك تلك التي تنشط مسار RhoA لتنظيم انقباض الخلوية1. تسمح الانقباضات المعتمدة على RhoA للهيكل الخلوي actin للخلايا بالانتشار والهجرة على ECM الأساسي ، وكذلك الشعور بصلابته2. يعتمد توزيع قوى الجر بقوة على منطقة انتشار الخلايا وشكلها ، وكلاهما يعتمد على خصائص المصفوفة وبالتالي يؤثر على التنظيم الهيكل الخلوي ، مما يشكل في نهاية المطاف حلقة تغذية مرتدة مغلقة بين ميكانيكا المصفوفة والتنظيم الهيكل الخلوي3،4.

تقنيات micropatterning السطح تسمح لمراقبة محددة لشكل الخلية من خلال خلق مناطق بحجم ميكرون تقديم البروتينات اللاصقة ECM; وفقا لحجم هذه المناطق، خلايا مفردة، أو مجموعات من الخلايا التي تلتزم micropattern5. يمكن أن تكون منقوشة البروتينات ECM على الركائز الزجاجية من قبل نهج مختلفة مثل الطباعة microcontact، ونقش الصور أو الليزر النقش6. استخدام الأشعة فوق البنفسجية ضوء (λ = 185 أو 375 نانومتر) جنبا إلى جنب مع استراتيجيات السطح المضادة للضروب يوفر المرونة لتصميم مختلف الأشكال والأحجام وشل حركة أنواع البروتين متعددة مع دقة عالية بالقرب من حواف السطح7،8. المناطق المغلفة بالمواد الكيميائية الطاردة للبروتين مثل جليكول البولي إيثيلين (PEG) محمية إما بقناع ضوئي كروم أو نظام مطبوع رقمي بدون قناع (DMD). تسمح الأنماط الموجودة في الأقنعة بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية للمناطق التي سيتم نقشها بعد ذلك ببروتينات ECM. يتطلب نقش أسطح الهيدروجيل مع بروتينات ECM خطوة نقل لإزالة البروتينات من سطح الزجاج وربطها بالأنماط. بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق النقش على المواد الناعمة من خلال طلاء قناع الصورة أولا ببروتين طارد ، يليه حرق المناطق غير المقنعة باستخدام إضاءة الأشعة فوق البنفسجية العميقة. منذ الأشعة فوق البنفسجية العميقة يولد الأوزون ويجعل سطح رد الفعل لربط البروتين، ومغطاة المناطق غير المقنعة مع بروتينات ECM وأخيرا هو بلمرة هلام مباشرة على رأس المناطق غير المقنعة9،10.

يمكن استخدام الهيدروجيلات المنقوشة لأداء TFM ، وهي تقنية تقيس قوى الخلية في واجهة الخلية والمواد11. في 2D-TFM، يستخدم المرء السطح المسطح لفيلم بوليمر سميك، حيث تم تضمين حبات العلامة لتتبع التشوهات12،13،14،15. من أجل استخراج ناقلات الإزاحة ، من الضروري الجمع بين صورتين ، واحدة من الحالة المشوهة وصورة مرجعية واحدة دون تشوهات. ثم يتم تعيين الصورتين على بعضهما البعض مع معالجة الصور. في كثافة علامة عالية، ويتم ذلك عادة مع الجسيمات صورة Velocimetry (PIV)، وهو أسلوب راسخ لإعادة بناء التدفق الهيدروديناميكي. في كثافة علامة منخفضة وفي 3D-TFM، ويتم ذلك عادة مع تتبع الجسيمات Velocimetry (PTV)، والذي يتضمن ميزات محددة من مجموعة البيانات التجريبية. مثال على بديل أرخص حسابيا هو التدفق البصري ، مثل خوارزمية كاناد لوكاس توماسي (KLT)16. في حالة الركائز الهيدروجيل، وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من الخرز الفلورسنت في كثافة عالية أثناء البلمرة المادية، ويتم تسجيل الصور قبل وبعد إطلاق الخلية عند مفرزة الأنزيمية. يؤدي الانفصال الأنزيمي للخلايا الملتصقة ، على سبيل المثال ، عن طريق المحاولة ، إلى إطلاق الجر الخلوي في وقت واحد من جميع الخلايا على الهيدروجيلات ، مما يجعل من الصعب الحصول على تحليل مفصل من عدد كبير من الخلايا.

هنا نقدم بروتوكولا لإعداد الهيدروجيلات micropatterned للسيطرة على شكل الخلية وتوطين وطريقة لقياس كفاءة قوى الجر في تسلسل باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لفصل الخلايا الفردية من الركيزة. لقياسات قوة الجر، نقدم تقنية لإنتاج الهيدروجيلات PA ثنائية الطبقات، حيث يتم تضمين الخرز الفلوري فقط في الطبقة العليا، مما يزيد من كثافتها ويقلل من انتشارها الرأسي. الجمع بين إطلاق الأشعة فوق البنفسجية بوساطة من قوى الجر الخلوية مع micropatterning يجعل من الممكن الحصول على السيطرة المكانية على مفرزة الخلية (على سبيل المثال، من خلايا واحدة دون التأثير على التصاق الخلايا الأخرى في المنطقة ذات الاهتمام)، شريطة أن يكون هناك مسافة كافية بين الخلايا المنقوشة. ثم يتم إعادة بناء الجر الخلوي باستخدام الطريقة الأكثر كفاءة وموثوقية ل2D-TFM، وهي فورييه تحويل الجر قياس الخلايا (FTTC) مع إضفاء الطابع النظامي17،18.

Protocol

1. إعداد الميثاكريلاتيونات coverlips

ملاحظة: يتم methacrylated الزجاج coverlips لربط الهيدروجيلات السلطة الفلسطينية بشكل مشترك، وبالتالي منع مفرزة أثناء الحضانة مع الخلايا. وتستخدم مجهر الزجاج coverlips لتحقيق جودة الصورة العالية.

  1. لإعداد محلول سعة 300 مل، خذ كوب زجاجي نظيف سعة 400 مل وضعه داخل غطاء الدخان.
  2. أضف 10 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) إلى الكأس. إضافة 18.75 مل من حمض الخليك (≥99.8٪ تحليل الموالية، ص.أ.)، 18.75 مل من 3-(Trimethoxysilyl)بروبيل ميثاكريلات و 252.5 مل من الإيثانول (≥99.8٪ في اليوم) باستخدام ماصة المصلية. صب الحل في طبق تبلور.
  3. تنظيف أغطية زجاجية مستديرة مقاس 24 مم مع مناديل دقيقة. ضع الأغطية في رف البوليتيترافلور الإيثيلين المصنوع خصيصا.
  4. تزج الرف في الحل واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. خذ الحامل وشطف جميع الأغطية بالإيثانول (99.8٪ في اليوم). جفف الأغطية تحت تدفق الهواء.
    ملاحظة: يمكن تخزين قطع الأغطية الميثاكريلاتية لمدة تصل إلى شهر واحد في RT.

2. micropatterning من البروتينات مصفوفة خارج الخلية على الأغطية الزجاجية

ملاحظة: المغلفة لأول مرة الأغطية الزجاجية مع طبقة من الجزيئات، تتألف من البروتين وطارد الخلايا. ثم تتم إزالة هذه الطبقة باستخدام تقنية التصوير الضوئي، للسماح للترسب اللاحق لبروتينات المصفوفة خارج الخلية في المناطق المجهرية.

  1. خذ غطاء زجاجي مستدير مقاس 15 ملم وضعه على طبق بيتري. استخدم قلم ألماس لوضع علامة على الجانب العلوي من غطاء الغطاء. ثم انتقل إلى التنظيف عن طريق علاج بلازما الأكسجين في 0.4 mbar و 200 W لمدة 2 دقيقة.
  2. ماصة 100 ميكرولتر من محلول بولي-ل-ليسين 0.01٪ على سطح كل غطاء. حضانة لمدة 30 دقيقة في RT. غسل الأغطية مع 10 MM 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-حمض بيبرازينيثانسولفونيك (HEPES) درجة الحموضة 8.5. إزالة أي السائل الزائد ولكن الحفاظ على سطح الرطب.
  3. ماصة 100 ميكرولتر من 50 ملغم / مل بولي (الإيثيلين غليكول) الميثيل الأثير succinimidyl حمض فاليريك (mPEG-SVA) في 10 MM HEPES درجة الحموضة 8.5 على سطح كل غطاء. حضانة لمدة 1 ساعة في RT. شطف الأغطية مع 10 MM HEPES pH 8.5 وتجف تحت تدفق الهواء.
  4. أضف 2 ميكرولتر من الفوتوينيتيات الحساس للأشعة فوق البنفسجية (مثل PLPP-gel) يليها 40 ميكرولتر من الإيثانول (≥99.8٪ في اليوم) على السطح. للحصول على توزيع متجانس من الجل والإيثانول على السطح، إمالة بلطف طبق بيتري ذهابا وإيابا. انتظر لمدة 5 دقائق للحل لبوليمرة.
  5. ضع غطاء واحد داخل طبق بيتري مقاس 35 ملم مع ثقب 20 مم في الأسفل. وهذا يسمح شعاع الليزر القادمة من تحت للوصول مباشرة إلى السطح الزجاجي.
  6. قم بتشغيل المجهر ووحدة النقش الخفيف (لا يسمح بالعمل مع هذا الجهاز إلا بعد إدخال السلامة من موظفي السلامة بالليزر). معايرة الأشعة فوق البنفسجية-A ليزر على هدف الهواء 20x. وضع العينة مع الضوئي على خشبة المسرح. ضبط التركيز على سطح الزجاج وبدوره على التحكم في التركيز. تحميل وقفل نمط مرسومة مسبقا.
    1. قم بإعداد النمط باستخدام برنامج رسومات مثل Inkscape. تأكد من أن ملف النقش لا يتجاوز أبعاد DMD (1824 × 1140 بكسل ، والذي يتوافق مع 552 × 325 ميكرومتر على عدسة 20 × (0.28 ميكرومتر / بكسل)).
      ملاحظة: من المستحسن استخدام حجم DMD (1824 × 1140 بكسل) كحجم ملف النقش، حيث أن هذا سيضمن عدم وجود خطأ أثناء النقش. على سبيل المثال، لا تنتج ملف نقش مع البعد 1830 × 1130 بكسل.
    2. لغرض نقل نمط إلى البولي أكريلاميد، تأكد من أن يتم النقش فقط ما يصل إلى 60٪ -70 ٪ من نصف قطرها من وسط الزجاج إلى الحافة.
    3. لتكتكين خلية واحدة، استخدم قطر 50-100 ميكرومتر مع مسافة 100 ميكرومتر بين الأنماط وقطر 150-300 ميكرومتر لمجموعة الخلية. يعتمد حجم النمط المناسب بشكل كبير على حجم الخلية النموذجي ، ويجب أن يكون كبيرا بما يكفي للسماح للخلايا بالالتصاق.
  7. بدء النقش بجرعة الأشعة فوق البنفسجية من 30 مجم/مم2. تعتمد مدة النقش على عدد الأنماط. صنع نمط واحد يأخذ ما يقرب من 1 ق.
  8. بعد الانتهاء من خطوة النقش، شطف السطح مع المالحة الفوسفات العازلة (PBS) ثلاث مرات. احتضان العينة مع 100 ميكروغرام من 25 ميكروغرام / مل فيبروكتين حل في 1x PBS و 25 ميكروغرام / مل الفيبرينوجين Alexa488 مترافقا في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في RT. بالنسبة لبروتينات ECM الأخرى، ابحث عن التركيزات المثلى التي تغطي المناطق المنقوشة بالكامل.
  9. شطف السطح مع برنامج تلفزيوني 1x ثلاث مرات. تأكد من أن الزجاج المنقوش يستخدم على الفور لنقل الزجاج السلطة الفلسطينية. تخزين الزجاج المنقوش في برنامج تلفزيوني في RT أثناء إعداد الهيدروجيل.

3. تصنيع هيدروجيلات البولي أكريلاميد المنقوشة

ملاحظة: يتم إعداد هيدروجيلات البولي أكريلاميد، بما في ذلك الأكريلاميد N-هيدروكسي إيثيل المؤأكسد (HEA) لتقديم مجموعات ألدهيد التفاعلية للربط التساهمي لبروتينات المصفوفة على السطح. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام نهج طبقة مزدوجة لتضمين حبات الفلورسنت فقط على الطبقة العليا من الهيدروجيل لتحسين تسجيل إزاحة الخرز أثناء تجارب المجهر قوة الجر.

  1. وضع الأغطية الزجاجية الميثاكريلاتية في طبق بيتري.
  2. لإعداد محلول HEA المؤتأكسد الطازج، أضف 9.55 مل من الماء المقطر المزدوج إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. ثم، إضافة 0.5 مل من HEA، و 42 ملغ من الصوديوم (ميتا) periodate للحصول على 10 مل من الحل. تحريك باستمرار الحل في الظلام لمدة 4 ساعة.
  3. مزيج الأكريلاميد، بيس أكريلاميد، والمياه المقطرة المزدوجة وفقا للجدول 1، للحصول على 10 مل من هيدروجيل حل الأسهم (تفعل ذلك تحت غطاء الدخان، مونومرات هي السامة للأعصاب). ديغا وإغلاق الغطاء إلى ختم محكم.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بحل الأسهم في الأسعار لمدة تصل إلى سنة واحدة عند 4 درجات مئوية. تميز دائما معامل الشباب من الهيدروجيل قبل الاستخدام.
  4. إعداد هيدروجيل السلطة الفلسطينية مزدوجة الطبقات (تفعل ذلك تحت غطاء محرك السيارة الدخان، مونومرات هي السامة للأعصاب).
    1. ابدأ بالطبقة السفلية عن طريق خلط 99.3 ميكرولتر من محلول المخزون بلطف ، و0.5 ميكرولتر من 1٪ من كبريتات الأمونيوم (APS) ، و0.2 ميكرولتر من رباعي ميثيل إيثيلينديامين (TEMED) في أنبوب 1.5 مل. تأخذ 10 ميكرولتر من الحل وماصة عليه دروبوايز على وسط غطاء الميثاكريلاتي.
    2. ضع بعناية غطاء مستدير 15 ملم على القطرة وانتظر لمدة 45 دقيقة للبوليمرة. فصل بلطف coverslip الأعلى مع مشرط.
    3. للطبقة العليا، مزيج بلطف 93.3 μLof حل الأسهم مع 1 ميكرولتر من محلول HEA المؤأكسدة الطازجة، 5 ميكرولتر من الخرز الفلوري (المقابلة لثلاث حبات لكل ميكرون مربع للخرزات من 200 نانومتر الحجم الخرز)، 0.5 ميكرولتر من 1٪ APS، و 0.2 ميكروغرام من TEMED في أنبوب 1.5 مل. تأخذ 5 ميكرولتر من الحل وماصة انها dropwise على وسط الطبقة السفلية البوليمر بالفعل.
    4. ضع بلطف غطاء الأغطية المصغرة على القطرة. انتظر لمدة 45 دقيقة في RT حتى تبلمرة القطرة. تأكد من أن الجانب المنقوش يلمس القطيرات. فصل بلطف غطاء مع مشرط.
  5. الغراء 24 ملم coverslips إلى الجزء السفلي من لوحات 6 آبار حفر مخصص باستخدام اثنين من مكون السيليكون الغراء. بعد 5 دقائق، إضافة برنامج تلفزيوني إلى الآبار.
  6. تميز معامل الشباب لعينات هيدروجيل البولي أكريلاميد عن طريق المجهر القوة الذرية (AFM).
    1. قم بتركيب علبة تلميح كروية على حامل AFM.
    2. معايرة كل cantilever عن طريق الحصول على منحنى قوة المسافة (3-4 V setpoint) على الركيزة الصلبة (على سبيل المثال، الزجاج أو الميكا)، استقراء حساسية cantilever، التراجع عن السطح، وأداء لحن الحرارية للحصول على ثابت الربيع بهم.
    3. ضع الكانتيليفيرات المعايرة فوق عينة الهيدروجيل والحصول على منحنيات القوة في مخزن PBS المؤقت ، باستخدام المعلمات التالية: نقطة تعيين قوة nN 20-30 ، نهج 5 أو 10 ميكرومتر / ثانية وسرعة التراجع ، حجم منحدر 5 ميكرومتر.
      ملاحظة: تم استخدام مجهر بصري مقلوب، مجهز بهدف 40x الهواء ومرشح البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتصور واستهداف المناطق ECM-micropatterned داخل عينات هيدروجيل السلطة الفلسطينية.
    4. رسم القوة المكتسبة مقابل منحنيات المسافة مع برنامج تحليل AFM.
    5. ابحث عن نقطة الاتصال وحول منحنيات القوة مقابل المسافة إلى قوة مقابل منحنيات المسافة البادئة.
    6. تناسب جزء المسافة البادئة من منحنى مع نموذج هيرتز (أو نموذج الميكانيكا مناسبة في وظيفة من هندسة تلميح)، وذلك باستخدام نسبة بواسون بين 0.2 و 0.5.

4. الافراج المحلي من قوات الجر الخلية بواسطة الأشعة فوق البنفسجية ليزر الإضاءة (LUVI-TFM)

ملاحظة: يتم تطبيق الليزر UV-A لإطلاق قوى الجر في الخلايا المترجمة في مناطق محددة من الهيدروجيل. ليزر UV-A (أي λ = 375 نانومتر ليزر الحالة الصلبة، <15 كيلوواط) هو ليزر 3B من الدرجة. شعاع الليزر غير المهزواة خطير على العينين وغالبا على الجلد. يمكن أن يكون الضوء المنعكس والمتناثر والإشعاع خطيرا. وعلاوة على ذلك، قد تسبب الأشعة فوق البنفسجية سرطان الجلد. لا يسمح بالعمل مع الأجهزة إلا بعد إدخال السلامة من موظفي السلامة بالليزر.

  1. يستنشق برنامج تلفزيوني من الآبار.
  2. البذور 3 × 106 خلايا لكل لوحة 6-جيدا في متوسط النمو. بالنسبة للخلايا الليفية، استخدم متوسط النسر المعدل (DMEM) عالي الجلوكوز في دولبيكو الذي يحتوي على L-glutamine ويكمل ب 10٪ مصل الجنين البقري (FBS) و1٪ البنسلين / العقدية. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO2. غسل العينات لإزالة الخلايا العائمة قبل البدء في الفحص المجهري.
  3. قم بتشغيل غرفة حضانة المجهر وإمدادات الغاز للحصول على درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ من الغلاف الجوي CO2 .
  4. تشغيل المجهر ووحدة النقش بالليزر. إذا لزم الأمر، إعادة معايرة الليزر الأشعة فوق البنفسجية-A على هدف الهواء 20x باستخدام برنامج ليوناردو. ضع لوحة 6-well المصنوعة خصيصا مع العينات على المسرح. ضبط التركيز على سطح السلطة الفلسطينية.
  5. إعداد نمط الإضاءة ووضع علامة على الخلايا ذات الاهتمام. إعادة التركيز على سطح الهيدروجيل. الحصول على صورة الخلايا في قناة برايتفيلد. التبديل إلى قناة Cy5 (مرشح أحمر بعيد، 650 نانومتر الإثارة، 670 نانومتر الانبعاثات) واتخاذ صورة من الخرز في حالة مشوهة.
  6. التحول إلى قناة الليزر. تشغيل الليزر لمدة 3 دقائق. في الإعداد الخاص بنا، وهذا يتوافق مع جرعة خفيفة من 6000 mJ/mm2.
  7. التبديل إلى قناة Cy5 والحصول على صورة من الخرز في حالة غير متشكلة.
    ملاحظة: للتجربة باستخدام الخلايا الليفية الجنينية للفأرة، انتظر لمدة 15 دقيقة بعد التعرض لتسجيل الصورة المرجعية/غير المشكلة (راجع قسم النتائج التمثيلية ). قد يكون مختلفا بالنسبة لنوع آخر من الخلايا. كرر الخطوات 4.5-4.7 مرة أخرى لخلية أخرى (خلايا) ذات أهمية.
  8. لقياس الإجهاد التأكسدي المرتفع بعد إضاءة الأشعة فوق البنفسجية-A، استخدم الكاشف المتاح تجاريا (CellRox). CellRox غير فلوري في الحالة المنخفضة ، وعندما تتأكسد بواسطة أنواع الأكسجين التفاعلية ، تفلور مع حد أقصى للانبعاثات يبلغ ~ 665 نانومتر.
  9. وفقا للبروتوكول المقدم، أضف 5 ميكرومترات كاشفة إلى وسائط التصوير واحتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية/5٪ من ثاني أكسيد الكربون. ثم، غسل الخلايا 3x مع برنامج تلفزيوني 1x الحارة واستبدال وسائل الإعلام التصوير. سجل إشارة Cy5 عن طريق التصوير الفلوري قبل وبعد إضاءة الأشعة فوق البنفسجية A باستخدام التعرض للضوء مماثلة.

5. معالجة الصور ، velocimetry صورة الجسيمات وحساب قوى الجر

ملاحظة: يتم تسجيل قوى الجر الخلية عن طريق تحليل إزاحة حبات الفلورسنت وتحسب باستخدام أدوات تحليل الصور على أساس velocimetry صورة الجسيمات.

  1. فتح صور الخرز الفلوري، قبل (أي مشوهة) وبعد الليزر (أي غير مشوه) باستخدام فيجي. دمج صورتين ككومة واحدة (صورة | | المكدسات صور إلى المكدس).
  2. الانجراف الجانبي الصحيح بين الصورتين باستخدام البرنامج المساعد StackReg (P. Thévenaz، المعهد الاتحادي السويسري للتكنولوجيا لوزان). تغيير الصور إلى 8 بت (صورة | اكتب | 8 بت) وإعادة المقياس إلى 1024 × 1024 بكسل (صورة | مقياس). حفظ ك تسلسل صورة (تنسيق TIFF) مع صورة المرجع دائما في البداية.
  3. الحصول على حقل متجه الإزاحة باستخدام تقنية الارتباط المتبادل19 من حقل PIV كما هو مطبق في مشروع OpenPIV.
    1. تأكد من تغطية الصورة المريحة (غير المشوهة) والصورة المشوهة بنوافذ بحث بحجم wR و wD بالبكسل. لكل إطار بحث، قم بتعريف دالة ارتباط متبادل باستخدام الصيغة التالية:
      Equation 1
      هنا، R(i,j) و D(i,j) تصف حقول كثافة الصورتين الاقتطاع إلى إطار البحث المحدد ومرآة مبطنة لاحقا. Equation 2 ووصف Equation 3 متوسط قيمتها. يتم اختيار أحجام الإطارات لتكون wR = 32 و wD = 32 ويتم استخدام تداخل 70٪ بين إطارات البحث المجاورة.
    2. لكل إطار بحث تحديد متجه Equation 4 إزاحة الذي يحسن دالة الارتباط المتبادل وتعيين إلى الموضع المركزي من إطار البحث. يتم الحصول على دقة Subpixel باستخدام تناسب الغاوسية حول منطقة ماكسيما كما هو موضح20.
    3. البحث عن ناقلات الإزاحة الغامضة وإزالتها. ناقلات الإزاحة المقابلة لنوافذ البحث حيث تعتبر النسبة بين أعلى حدين محليين لدالة الارتباط المتبادل تحت عتبة 1.5 غامضة21.
    4. تجاهل ناقلات الإزاحة التي تفشل في الاختبار الوسيط العادي لنسبة متبقية من 1.522.
    5. (اختياري) تصحيح الانجراف الجانبي المتبقي عن طريق طرح متجه Equation 5 ثابت من جميع عمليات الإزاحة. ويتم ذلك لأن الإزاحة في منطقة محددة بعيدة عن الخلية تختفي.
    6. 4- أن يجزم حقل متجه الإزاحة الناتج إلى شبكة منتظمة مع تباعد قدره 4 بكسل من صور الإدخال باستخدام استنتاج متعدد الحدود مكعب. يتم تعبئة نقاط البيانات المفقودة باستخدام استقراء ثنائي المتغيرات متجانس. يرتبط متجه الإزاحة بالبكسل بتشوه محلي بنسبة بكسل الصورة (0.33 ميكرومتر/بكسل للعدسة الهوائية 20x).
    7. (اختياري) مرآة لوحة الصورة للحد من القطع الأثرية رنين في التحليل اللاحق.
    8. ضرب حقل تشوه بواسطة وظيفة نافذة Tukey للقضاء على تأثير الحافة بسبب تصحيح الانجراف، مع معلمة من 0.2-0.3. في هذه التجربة ، فإن المنطقة المصغرة التي تقع في وسط FOV هي ذات أهمية.
  4. إعادة بناء الجر باستخدام قياس الخلايا تحويل فورييه تحويل (FTTC)18. كما تنظيم نستخدم أبسط خيار معقول، وهي 0th ترتيب Tikhonov (L2) 23،24،25. يتم اختيار معلمة الانتظام الأمثل λ بحيث تقلل من وظيفة التحقق من صحة الصليب المعمم (GCV) المعرفة من قبل26:
    Equation 6
    هنا τλ هو متجه مكدس يحتوي على المكونات س و ص من حقل الجر المعاد بناؤها لقيمة معينة من λ لجميع وسائط أخذ العينات فورييه وG هو المشغل الخطي رسم خرائط حقول الجر إلى حقل التشريد المقابلة لها، كما هو محدد لFTTC. يتم تشغيل المجموع عبر مكونات متجهة. ui هي المكونات x و y لحقل الإزاحة لجميع أوضاع أخذ العينات من فورييه. يستخدم GCV على نطاق واسع في مجال المشاكل العكسية غير المطروحة بشكل جيد وهو بديل جيد لمعيار منحنى L الذي يستخدم غالبا في TFM. يتم استخدام فلتر Lanzcos لتقليل القطع الأثرية التي تقدمها بسبب مساحة التردد المحدودة وزدح حقل الإزاحة. يعتمد حساب الجر على معامل الشباب للسلطة الفلسطينية (على سبيل المثال، 11.3 كيلو باسكال) ونسبة بواسون (على سبيل المثال، للسلطة الفلسطينية في النطاق بين 0.2 و 0.5 اعتمادا على تركيز الوصلات المتقاطعة).

Representative Results

وقد تم بلمرة هيدروجيل السلطة الفلسطينية على الأغطية الزجاجية الميثاكريلاتية، التي تقدم مجموعات تفاعلية للربط التساهمي للسلطة الفلسطينية. وبهذه الطريقة، عند وضع الهيدروجيلات في محلول مائي، تم منع انفصالها عن الركيزة (الشكل 1A-D). للحصول على كثافة عالية من علامات fiducial بالقرب من سطح الهيدروجيل، وضعنا إعداد هيدروجيل السلطة الفلسطينية ذات الطبقات المزدوجة. تم بلمرة الطبقة السفلية ، دون أي حبات فلورية ، على غطاء الميثاكريلاتي. وفي وقت لاحق، تم بلمرة طبقة أخرى تحتوي على الخرز فوق الطبقة السفلية (الشكل 1E-H)، لتحل محل الحاجة إلى الترسيب، والذي يستخدم في كثير من الأحيان لتحقيق توزيع الخرز في مستوى بؤري واحد وزيادة كثافة الخرز. لتحقيق السيطرة على شكل الخلية خلال قياسات TFM، أنتجنا هيدروجيلس السلطة الفلسطينية micropatterned عن طريق النقل المباشر للهياكل المجهرية المنقوشة فيبروكتين من غطاء زجاجي إلى السلطة الفلسطينية قبل البوليمر (الشكل 1F-F'). إضافة 1٪ crosslinker غير التقليدية (HEA المؤأكسدة) في الحل طبقة هيدروجيل الأعلى يوفر مجموعات ألدهيد التي تربط بشكل متناقض لمجموعات أمين فيبروكتين.

أعددنا هيدروجيل السلطة الفلسطينية، والتي هي ما يقرب من 60 ميكرومتر في سمك والخرز الفلورية المحصورة في الطبقة العليا بالقرب من سطح الهيدروجيل. هذا النوع من الهيدروجيل هو ركيزة مناسبة لتصوير الجر الخلوي مع المجاهر المقلوبة وسميكة بما فيه الكفاية (تم الإبلاغ عن الحد الأدنى من سمك لأداء TFM أن يكون 20-30 ميكرومتر)18 لمنع أي تأثير للركيزة الزجاج. تم تصوير توطين الخرز الفلوري بواسطة المجهر الكونفوجال (الشكل 1I). لتصور نقل البروتين على الهيدروجيل، استخدمنا بروتينات ECM المسماة بالفلورسنت وصورناها عن طريق المجهر الفلوري (الشكل 1J). أعددنا دوائر ميكروباترنيد من فيبروكتين يبلغ قطرها 100 ميكرومتر (الجانب الأيسر) و 50 ميكرومتر (الجانب الأيمن) للسماح بالالتصاق بمجموعات من الخلايا أو الخلايا المفردة ، كما هو موضح في تراكب صور الحقل الساطعة للخلايا الملتصقة ، والخرز الوثني المسمى بالفلورسنت والخلايا الدقيقة الفيبرونيكتين. على عينة مختلفة، تم التحقق من صحة استجابة التصاق الخلايا المفردة إلى فيبروكتين micropatterned عن طريق المجهر immunofluorescence غير المباشرة لتصوير توطين بروتينات الالتصاق البؤري مثل باكسيلين (الشكل 1K).

كل من طلاء البروتين ECM وتصلب الهيدروجيل هي المعلمات الحاسمة لالتصاق الخلية26. لتوصيف الخصائص الميكانيكية لدينا هيدروجيلس السلطة الفلسطينية، قمنا بإجراء تجارب المسافات النانوية من قبل AFM27، إلى جانب المجهر epifluorescence. تم إعداد واختبار ركائز هيدروجيل من ثلاث صلابات مختلفة مع الإعداد لدينا (الشكل 2 والجدول 1). تم الاقتراب دوريا من كبسولات AFM على شكل كرة وتم سحبها من الهيدروجيلات غير المصححة للسلطة الفلسطينية والفيبرينوجين المترافقة مع المناطق التي تم تجميعها في Alexa488 - micropatterned ، أثناء تسجيل منحنيات مسافة القوة. في وقت لاحق، سمح لنا تقييم نقطة الاتصال وتطبيق نموذج هيرتز بتقدير معامل يونغ (E) لكل عينة. لم يغير الترند المجهري ECM معامل الشباب ، والذي ظل مشابها لكل من الهيدروجيلات السلطة الفلسطينية غير المصححة.

لقياس قوى الجر التي تمارسها الخلايا الملتصقة على الركيزة ، قمنا بتطوير إعداد تجريبي ل TFM المرجعي القائم على المجهر واسع النطاق مجهز بوحدة ليزر الأشعة فوق البنفسجية القريبة (UV-A 6000 mJ /mm2) لإطلاق الجر الخلوي (الشكل 3A). كما يمكن التحكم في الإضاءة شعاع الليزر spatio زمنيا، ليس فقط هو أنه من الممكن لفضح انتقائي خلية واحدة أو كتلة الخلية مع جرعة ليزر عالية، ولكن أيضا والأهم من ذلك، الخطوة المتوسطة التخريبية لإزالة الخلايا من العينة بأكملها باستخدام إنزيم الجهاز الهضمي مثل تريبسين لم يعد ضروريا. الخلايا المضيئة مع مثل هذه الجرعة الليزر عالية تسبب الإجهاد التأكسدي مرتفعة مما يؤدي إلى موت الخلية (الشكل 3B). وأسفر موت الخلية عن إطلاق الجر من الركيزة، كما هو مبين في إزاحة الخرز (الموضحة في الشكل 3 ألف). جمعنا بين إضاءة الأشعة فوق البنفسجية A ووحدة النقش الخفيفة لإلقاء الضوء بشكل انتقائي على المناطق بحجم ميكرون من الهيدروجيلات السلطة الفلسطينية (الشكل 3B-C). وبهذه الطريقة يمكن إطلاق قوة الجر لمجموعات الخلايا المصغرة (الشكل 3C، F) أو الخلايا المفردة (الشكل 3B). الأهم من ذلك، في موازين عصرنا لم تتأثر الخصائص الميكانيكية للهيدروجيلات المنقوشة ECM بشكل كبير بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية (الشكل 2C). تظهر زيادة في الإجهاد التأكسدي في الشكل 3D,E. وأعيد بناء قوى الجر باستخدام نظامية FTTC مع معلمة تنظيم اختارها التحقق من صحة الصليب المعمم (الشكل 3B، واو). وقد حدث إطلاق القوات لخلايا واحدة على مدى فترة 15 دقيقة، ونتيجة لLUVI-TFM مماثلة ل TFM القائم على التريبسين (الشكل 3G-H).

Figure 1
الشكل 1: مخطط إعداد فيبروكتين الركيزة المنقوشة لTFM. (A) يتم أنابيب الحل للطبقة السفلية على سطح ميثاكريلاتي. (ب) يتم وضع غطاء نظيف أصغر بعناية على القطيرات. (ج) وقت الهلام هو 45 دقيقة (D) يتم فصل غطاء العلوي. الطبقة السفلية جاهزة. (ه) الحل للطبقة العليا هو pipetted على هيدروجيل. (F) يتم وضع غطاء منقوش بعناية على القطيرات. (واو)' يتم إنتاج micropatterning من البروتينات اللاصقة على الزجاج عن طريق قناع بالقرب من الأشعة فوق البنفسجية الطباعة الحجرية، ومن ثم نقلها من الزجاج إلى هيدروجيل السلطة الفلسطينية. مجموعات أمين الحرة من البروتينات اللاصقة، على سبيل المثال، فيبروكتين، ربط بشكل مشترك لمجموعات ألدهيد على سطح السلطة الفلسطينية. (G) وقت الهلام هو 45 دقيقة.( H) يتم فصل الغطاء العلوي. هيدروجيل السلطة الفلسطينية منقوشة جاهزة. (I) تمثيل ثلاثي الأبعاد لميكروجراف xyz confocal يظهر كثافة عالية من الخرز ال fiducial بالقرب من السطح. (J) ميكروجراف من فيبروكتين المسمى فلوريا (أرجواني) على سطح السلطة الفلسطينية مع حبات الفلورسنت جزءا لا يتجزأ (الأخضر)، تراكب مع صورة حقل مشرق من الخلايا. (ك) التصوير المجهري المناعي غير المباشر لخلية واحدة ملتصقة بورم فيبروكتين ميكروباترن على شكل دائرة (100 ميكرومتر). النواة (الأزرق)، باكسيلين (أحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توصيف عينة الخصائص الميكانيكية من قبل AFM. (أ) الإعداد التجريبي للمسافات النانوية AFM. يتم استخدام كانتيليفر على شكل كرة للتحقيق في النترات الدقيقة ECM قبل أو بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية ، والمناطق غير المنقوشة من المناطق ذات الطبقات المزدوجة PA (5٪ أكريلاميد ، 0.3٪ بيس أكريلاميد). (ب) القوة التمثيلية مقابل منحنى المسافة البادئة للماء ECM (أسود). يستخدم هيرتز صالح (الأحمر) لحساب معامل يونغ (E) من العينة. (ج) القياسات الميكانيكية للمناطق السلطة الفلسطينية مزدوجة الطبقات غير منقوشة (لا ECM)، ECM micropattern وECM micropattern بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية-A. الحانات تظهر يعني ± S.E.M. (براون فورسيث وويلش ANOVA اختبار). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تتيح الإضاءة المحلية للأشعة فوق البنفسجية -A TFM (LUVI-TFM) قياسات قوة الجر المحلية داخل مجال رؤية كبير. (أ) مخطط الإضاءة المحلية للأشعة فوق البنفسجية-A TFM. يتم التعامل مع الخلايا بجرعة عالية من الأشعة فوق البنفسجية ليزر للحصول على صورة غير مشوهة (المرجع). (ب) صورة برايتفيلد لخلية واحدة قبل إضاءة الليزر للأشعة فوق البنفسجية A. الوسط: الصورة المشرقة لخلية واحدة بعد إضاءة الليزر بالأشعة فوق البنفسجية A. اليمين: قوة الجر من MEF واحد التمسك فيبروكتين المغلفة PA هيدروجيل (E = 5.74 كيلو باسكال) مضيئة مع شعاع الأشعة فوق البنفسجية قطرها 50 ميكرومتر (خط أحمر متقطع). (ج) إلى اليسار: تسجيل قوى الجر لمجموعة من الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) التمسك الفيبروكتين micropatterned (دائرة، قطر 100 ميكرومتر). وقد أضاءت الكتلة مع 200 ميكرومتر قطر الأشعة فوق البنفسجية ضوء شعاع (خط أحمر متقطع). اليمين: تسجيل قوى الجر لمجموعة من الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) التمسك فيبروكتين micropatterned (دائرة، قطرها 300 ميكرومتر). وقد أضاءت الكتلة مع 300 ميكرومتر قطر الأشعة فوق البنفسجية ضوء شعاع (خط أحمر متقطع). شريط المقياس = 200 ميكرومتر (D,E) زيادة في الإجهاد التأكسدي في الخلايا التي تشير إليها زيادة كثافة إشارة Cy5 بعد اكتشاف جرعة ليزر عالية من الأشعة فوق البنفسجية-A عن طريق المجهر الفلوري. الإجهاد التأكسدي يؤدي إلى موت الخلية. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (F) إلى اليسار: خريطة حرارة الإجهاد من مجموعة من الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) التي تلتزم بالفيبروكتين المفرغ (دائرة قطرها 100 ميكرومتر). اليمين: خريطة حرارة الإجهاد من مجموعة من الخلايا الليفية الجنينية للفأرة (MEF) التي تلتزم بالفيبروكتين المفرغ (دائرة، قطرها 300 ميكرومتر). (G) خلايا MEF التمسك 100 ميكروباترن فيبروكتين فيبروكتين الإفراج ببطء الجر بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ألف. يتم تحقيق الإصدار الكامل بعد 15 دقيقة (تم التقاط الصورة المرجعية بعد ذلك 15 دقيقة بعد التعرض). (ح) مقارنة مع التربسين التقليدية القائمة على TFM لخلايا MEF التمسك قطرها 300 ميكرومتر منقوشة فيبروكتين. نتيجة إضاءة الأشعة فوق البنفسجية A (6000 مجم / مم2) تليها 15 دقيقة في الانتظار غير مختلفة بشكل كبير عن علاج التريبسين التقليدي (أي 0.05٪ لمدة 20 دقيقة). أشرطة تظهر يعني S.E.M. (اثنين الذيل الطالب تي اختبار، **** P < 0.0001، * P < 0.05، ns P ≤0.5). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أكريلاميد (٪) بيس أكريلاميد (٪) أكريلاميد من محلول الأسهم 40 ٪ (مل) بيس أكريلاميد من محلول الأسهم 2 ٪ (مل) الماء (مل) معامل يونغ (kPa)
4 0.1 1 0.5 8.5 5,74 ± 0,53
5 0.15 1.25 0.75 8 9,69 ± 0,68
5 0.3 1.25 1.5 7.25 11,33 ± 1,06

الجدول 1: مخاليط محلول مخزون هيدروجيل والمرونة الناتجة

يتم إيداع جميع البيانات في مستودع بيانات الوصول المفتوح لجمعية ماكس بلانك (إدموند) ويمكن الوصول إليها من خلال العنوان التالي: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Discussion

في هذا البروتوكول، ونحن نصف إعداد micropatterned PA الهيدروجيلات التي تحتوي على حبات الفلورسنت، والتي تستخدم كعلامات fiducial لدراسات TFM. ويستند نهجنا على ثلاث خطوات: 1) إعداد هيدروجيل السلطة الفلسطينية مزدوجة الطبقات؛ (2) إعداد الهيدروجيلات السلطة الفلسطينية ذات الطبقات المزدوجة؛ (2) إعادة تنظيم الهيئة؛ (3) إعداد الكبسولات الهيدرولوجية ذات الطبقات المزدوجة؛ ( 2) micropatterning من البروتينات ECM ونقلها على سطح الهيدروجيل؛ 3) استخدام منقوشة بالقرب من الأشعة فوق البنفسجية ضوء لتي اف ام. الإعداد التجريبي لتحليل الجر الخلية إلى الركيزة يتطلب استخدام مواد مرنة خطية مع قيم صلابة معروفة لحساب القوى المتعلقة بإزاحة الخرز الفلوري26. السلطة الفلسطينية هيدروجيلس سهلة التحضير، صلابة يمكن ضبطها بسهولة، وأنها تستخدم عادة لاستشعار صلابة و TFM18،28. ومع ذلك ، للحصول على مرات البلمرة القابلة للاستنساخ والبوليمرة المتجانسة للهيدرجيل بأكمله ، ينبغي إيلاء الاهتمام لتخزين الظروف والوقت للكواشف ، على سبيل المثال ، يجب الاحتفاظ APS في مجفف لتجنب فقدان نشاطها ؛ يجب حماية TEMED من الضوء المباشر. استخدام HEA المؤتأكسدة يسمح الربط التساهمي للبروتينات مصفوفة على سطح الهيدروجيل، والتي قد تكون مفيدة لتحقيق تشكيل طبقة بروتين كامل ومستقر. وينبغي إعداد حل HEA المؤتأكسدة طازجة في كل مرة يتم فيها تصنيع الهيدروجيلات السلطة الفلسطينية. يوفر هيدروجيل السلطة الفلسطينية ثنائي الطبقات ثلاث مزايا رئيسية: 1) أنه يوفر طريقة بديلة للحصول على توزيع متجانس للخرزات ال fiducial بالقرب من سطح الهيدروجيل ، دون الحاجة إلى جعل الجل رقيقا للغاية (أي <20 ميكرومتر). السيطرة على سمك الهيدروجيل أمر بالغ الأهمية للحصول على قياسات دقيقة مع TFM. عندما تكون الركيزة المرنة رقيقة جدا ، قد تشعر الخلايا القوية الملتصقة مثل الخلايا الليفية وتستجيب ميكانيكيا للركيزة الزجاجية الصلبة الأساسية29،30. الهيدروجيلات سميكة جعل الحصول على صورة لإعادة بناء القوة أكثر تحديا. وعلاوة على ذلك، فإن العديد من المجاهر ليس لديها مساحة كافية لاستيعابها، بالنظر إلى سمك إضافي من الركيزة الزجاجية المستخدمة لإرفاق الهيدروجيل، ما لم يتم استخدام الشرائح المجهرية فائقة الصغر. 2) في هيدروجيل السلطة الفلسطينية ذات الطبقات المزدوجة، يتم تحقيق التوزيع المتجانس للخرزات fiducial بالقرب من سطح هيدروجيل السلطة الفلسطينية دون استخدام جهاز طرد مركزي، ولكن بدلا من ذلك مع حضانة بسيطة من كميات دقيقة من حلول الهيدروجيل والخرز الفلوري. كثافة حبة عالية هي ذات فائدة كبيرة عند إجراء تحليل PIV لأنه يزيد من دقة قوى الجر ونسبة الإشارة إلى الضوضاء دون الحاجة إلى المجهر confocal. 3) حصر الخرز في طبقة رقيقة قريبة من واجهة الخلية والمواد تمكن التصوير من قوى الجر مع المجاهر epifluorescence فضلا عن المجاهر confocal. عند إعداد الهيدروجيل، يجب على المستخدم التأكد من أنه يلتزم بقوة بالزجاج السفلي قبل الشروع في الخطوات اللاحقة للبروتوكول. نوصي باتباع وقت الحضانة المشار إليه لبوليمرة طبقات الهيدروجيل ، لأنه قد يكون من الصعب إزالة الزجاج فوق السطح دون الإضرار بسطح الهيدروجيل.

التقنيات الأكثر شهرة لقياس الخصائص المرنة هي AFM ، المسافات النانوية ، اختبارات الشد ، وقياس الريوميتري. ومع ذلك ، فإن المسافات النانوية تحفز ضغوطا عالية جدا على المواد التي يمكن أن تؤثر على تحديد الخصائص المرنة. اختبارات الشد وقياس الريوميتري من ناحية أخرى هي تقنيات قياس العيان، في حين تتفاعل الخلايا على مقياس مجهري31،32. يسمح AFM بالقياسات على النطاق الدقيق مع انخفاض السلالات في ظل الظروف الفسيولوجية. يمكن أن تتأثر موثوقية قياسات AFM سلبا إذا كانت التفاصيل التجريبية مفقودة (على سبيل المثال، قوة المسافة البادئة والسرعة) أو تم تسجيل بيانات غير كافية27. يصف Huth وآخرون خوارزمية لاستخراج معامل يونغ من بيانات AFM ، والتي تؤكد الحفاظ على تفاصيل القياس constant27. تقدم هذه الخوارزمية تحديدا دقيقا وموثوقا لمعامل يونغ واستخدمت في تجاربنا. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بقياس العديد من المنحنيات على عينات ملفقة في أيام مختلفة واكتسبنا نتائج مشابهة جدا (تباين متوسط القيم من كاليفورنيا 1-2 كيلو باسكال). وهذا يدل على أن صلابة المواد الهلامية لدينا يمكن التنبؤ بها بشكل موثوق.

في هذا البروتوكول، نستخدم وحدة فوتوباترنينج لإنشاء مناطق مجهرية على الزجاج، والتي يتم نقلها بعد ذلك إلى أسطح الهيدروجيل. ويستند micropatterning هو مبين في هذا البروتوكول على DMD (جهاز المرآة الدقيقة الرقمية) القائم على قناع شبه الأشعة فوق البنفسجية الطباعة الحجرية (λ = 375 نانومتر)7. وDMD يتكون من عدد كبير من الميرات الصغيرة على رقاقة. يتوافق بكسل واحد مع مرآة صغيرة واحدة. يتم إسقاط ملف صورة النمط المنقطة من جهاز كمبيوتر من خلال DMD ويركز على السطح باستخدام عدسة موضوعية. بالنسبة ل micropatterning من البروتينات ، يتم استخدام ضوء الليزر المركز لترابط فرش البوليمر الطاردة بمساعدة فوتونيتياتور. بعد ذلك ، تمتلئ المناطق المعرضة ببروتينات ECM. توفر طريقة الاستئصال بدون قناع هذه مرونة كبيرة في تصميم أنماط جديدة ، لأنها لا تعتمد على استخدام قناع ضوئي. تصميم وتطبيق نمط من السهل جدا لأنه يأخذ سوى عدة دقائق باستخدام مجانية مثل Inkscape. ومع ذلك، فإن عدد الأنماط والعينة المنتجة في فترة قصيرة من الزمن هو عيب رئيسي، حيث لا يمكن استخدام هذه الطريقة إلا لأنماط ركيزة واحدة في كل مرة. تستخدم وحدة التصوير الضوئي مصدر ليزر قريب من الأشعة فوق البنفسجية الصلبة التي تنبعث منها عدة ملليواطات. شعاع الليزر غير المهزوا خطير على العينين والجلد. يمكن أن يكون الضوء المنعكس والمتناثر والإشعاع خطيرا أيضا. يجب أن يكون التعامل معها مصحوبا بتعليمات السلامة من ضباط الليزر. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول عند استخدام وحدة فوتوباترنينج هو التأكد من أن أثناء micropatterning والاجتثاث الليزر يركز بشكل صحيح على السطح. تعتمد جرعة الإضاءة المتسقة (الكثافة مضروبة في الوقت) من ضوء الأشعة فوق البنفسجية أثناء النقش على كيفية تركيز الليزر على السطح. قد تؤدي كثافة ضعيفة على السطح بسبب ضعف التركيز إلى فشل نقل ECM إلى سطح الهيدروجيل مما يؤدي إلى عدم تعلق الخلايا بالهيدرجيل.

في تجارب TFM ، بعد التصوير الأولي للخلايا الملتصقة والعلامات الودودولوجية ، يتم إطلاق الخلايا من هيدروجيل السلطة الفلسطينية عن طريق علاج التريبسين لتسجيل حالتها المريحة. عيب في تنفيذ هذه الخطوة هو التعامل مع العينة على مرحلة المجهر. دون غرفة التخبط، وفتح غطاء الطبق، وسبيراتينغ المتوسطة، والشطف، والحل الجربسين pipetting تمثل تحديا للمبتدئين والمستخدمين ذوي الخبرة. في الواقع، هذه الإجراءات هي مصدر رئيسي للانجراف في محاور xyz ، مما أدى إلى فقدان الموقف والتركيز. لدينا بروتوكول الإضاءة الأشعة فوق البنفسجية المحلية يجعل TFM تقنية أكثر سهولة للمبتدئين. وتجدر الإشارة إلى أننا استخدمنا وحدة تصويرية خالية من الأقنعة متاحة تجاريا، ولكن من حيث المبدأ يمكن استخدام أي نظام إضاءة للأشعة فوق البنفسجية- A، في نهاية المطاف بالاشتراك مع قناع لحماية مناطق الركائز، حيث لا ينبغي تسجيل قوى الجر الخلوية. إن تعريض الخلايا بجرعة كبيرة من الضوء المرئي منخفض الطول الموجي (على سبيل المثال، الضوء البنفسجي الذي يثير انبعاث DAPI) سيؤدي إلى زيادة الإجهاد التأكسدي، والذي يمكن أن يؤدي إلى السمية الضوئية وموت الخلايا. لذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية حتى في المجهر epifluorescence دون وحدة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. ومع ذلك ، حيث أن الكثافة أضعف بكثير ، سيكون من الأسهل بكثير إنجاز TFM مع العلاج الأنزيمي في هذه الحالة.

مع LUVI-TFM من الممكن استخدام نفس العينة لعدة قياسات بسبب انفصال محلي من خلايا واحدة أو مجموعات صغيرة من الخلايا. ومع ذلك، ينبغي إيلاء الاهتمام لاختيار الخلايا لفصل، لتجنب تسجيل القوات من الخلايا المجاورة. وبالتالي، بالنسبة لقياسات الخلية الواحدة في غياب الترباسات الدقيقة، ينبغي تجنب المناطق المزدحمة؛ بالنسبة للقياسات على الخلايا المصغرة المفردة ، يجب تصميم الأنماط بحيث تكون المسافة بين الهياكل المفردة ضعف قطر المنطقة المنقوشة على الأقل. نوصي أيضا بعدم استخدام خلايا من أنماط متجاورة في التسلسل ، ولكن بدلا من أخذ عينات منها من مناطق بعيدة على الركيزة. يتم إجراء قياسنا بشكل جيد على مجهر epifluorescence مجهز بميزة التحكم في التركيز وعدسة 40 × الهواء NA = 0.9 ، حيث تكون مسافة عمل العدسة طويلة بما فيه الكفاية والحركة السريعة من بئر إلى آخر غير قادرة للغاية. مفرزة الخلايا المستهدفة لتطبيقات TFM فعالة لقياس القوة الخلوية لخلية واحدة أو مجموعة خلايا صغيرة كاملة (على سبيل المثال، يصل قطرها إلى 300 ميكرومتر). باستخدام الإعداد لدينا، لاحظنا التقريب الخلية ومفرزة لعلاج الأشعة فوق البنفسجية من الخلايا المفردة (الشكل 3A)، في حين أن مفرزة نادرا ما حدث لمجموعات الخلايا الصغيرة. وهذا قد يؤدي إلى التقليل من شأن قوى الجر الخلية. بالنسبة لمجموعات الخلايا الكبيرة، يوصى بالانزيم الإنزيمي، حيث يجب على المستخدمين استخدام هدف هواء 20x لتصوير الكتلة بأكملها، وهناك حاجة إلى ميزة التحكم في التركيز البؤري. وبما أن عمق تركيز عدسة الهواء 20x أطول بكثير ، فإن المناولة لن تكون حاسمة مثل هدف التكبير الأعلى. يجب على المستخدم التأكد من أن التركيز يتم ضبطه بشكل صحيح لاجتثاث الخلايا ، لأن جرعة الإضاءة تعتمد على تركيز الليزر على السطح. في حين أننا ندرك القيود المحتملة في استخدام LUVI-TFM في تجمعات الخلايا بسبب التفاعلات الميكانيكية المحتملة مع الخلايا غير المعالجة المجاورة ، يمكن أن يتحول هذا الجانب في الواقع إلى أن يكون مفيدا للدراسات حول آليات قذف الخلايا المستهدفة ، على سبيل المثال ، من الطبقات الأحادية الظهارية.

في الختام، مع نهجنا TFM جنبا إلى جنب مع إطلاق الضوء الناجم عن الخلايا micropatterned، ونحن نقدم بروتوكول قوي وعالي الإنتاجية لقياس قوات الالتصاق الخلية. ويمكن زيادة استغلال براعة هذه الطريقة باستخدام المجهر وإعداد التصوير بهدف تحسين الدقة والحساسية.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

ونشكر السيدة ريبيكا ألفارادو على الدعم المقدم في إنتاج الفيديو البروتوكولي والسيد ستيفن كاسالي على النقد البناء على المخطوطة. نشكر زملاء قسم الفيزياء الحيوية الخلوية، معهد ماكس بلانك للبحوث الطبية على المناقشات المفيدة. الدعم المالي من ماكس بلانك-جيسلشافت إلى E.A.C.-A. ودويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129، projektnummer 240245660، P15 إلى E.A.C.-A. و P4 إلى الولايات المتحدة؛ DFG EXC 2082/1-390761711 إلى الولايات المتحدة) هو أيضا معترف به إلى حد كبير. J.B. يشكر مؤسسة كارل زايس على الدعم المالي. E.A.C.-A., C.S. والولايات المتحدة تعترف التمويل من خلال ماكس بلانك مدرسة المسألة إلى الحياة بدعم من وزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية (BMBF). C.S. مدعوم من قبل مجلس البحوث الأوروبي (الموحد منحة PHOTOMECH, no.101001797).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate #440159 Sigma Aldrich
Acetic acid #33209 Honeywell
Acrylamide 40 % #1610140 Bio-Rad CAUTION : toxic, work under a fume hood
AFM cantilever #CP-CONT-BSG-A-G NanoAndMore 5 μm spherical tip
AFM system #NanoWizard3 JPK Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter
Ammonium persulfate #A3678 Sigma
Bis-acrylamide 2 % #1610142 Bio-Rad CAUTION : toxic, work under a fume hood
Camera sCMOS #C11440-42U30 Hamamatsu
Camera sCMOS #ANDORZYLA4.2 Oxford Instrument
CellRox #C10422 Thermo Fisher
Custom incubator chamber EMBLEM
Dental glue #1300 100 Picodent
DMEM #41965 Thermo Fisher
Epifluorescence microscope #Eclipse Ti2E Nikon
Epifluorescence microscope #Axiovert200 Zeiss
Ethanol #9065.3 Carl Roth
FBS South America #S181T Thermo Fisher
Fibrinogen #F13191 Invitrogen Alexa488 conjugate
Fibronectin #F1141 Sigma
Fluorescent beads 200 nm #F8805 Invitrogen Carboxylated (365/415)
Fluorescent beads 200 nm #F8848 Invitrogen Carboxylated (505/515)
Fluorescent beads 200 nm #F8810 Invitrogen Carboxylated (580/605)
Fluorescent beads 200 nm #F8807 Invitrogen Carboxylated (660/680)
Glass coverslip 15 mm round #41001115 Assistent
Glass coverslip 24 mm round #41001124 Assistent
Microscope Objective #MRH08230 Nikon 20x air NA 0.45
Mouse Embryonic Fibroblasts #CRL-2991 ATCC
mPEG-SVA #MPEG-SVA-5000 Laysan Bio
N-Hydroxyethyl acrylamide #697931 Aldrich
Plasma cleaner #100-E TePla
PLPP gel #PLPPgel Alveole
Poly-L-lysine #P4823 Sigma Aldrich
Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) SuSoS
Sodium(meta) periodate #S1878 Sigma Aldrich
TEMED #17919 Thermo Scientific
UV Patterning module #PRIMO Alveole
UVO cleaner #342-220 Jelight

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B., Bershadsky, A. Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors. Cell. 110 (2), 139-142 (2002).
  2. Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -l, Hosoya, H. Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7 (2006).
  3. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
  4. Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation. Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).
  5. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  6. Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).
  7. Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
  8. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).
  9. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  10. Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
  11. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  12. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  13. Polacheck, W. J., Chen, C. S. Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools. Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).
  14. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).
  15. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
  16. Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. Dynamics of force generation by spreading platelets. Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).
  17. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  18. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
  19. Willert, C. E., Gharib, M. Digital particle image velocimetry. Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).
  20. Lourenco, L., Krothapalli, A. On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV. Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).
  21. Adrian, R. J., Westerweel, J. Particle Image Velocimetry. , Cambridge University Press. (2011).
  22. Westerweel, J., Scarano, F. Universal outlier detection for PIV data. Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).
  23. Dembo, M., Wang, Y. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  24. Schwarz, U. S., et al. Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization. Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).
  25. Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package. Computer Physics Communications. 256, 107313 (2020).
  26. Vedadghavami, A., et al. Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications. Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).
  27. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
  28. Oria, R., et al. Force loading explains spatial sensing of ligands by cells. Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).
  29. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  30. Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).
  31. Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).
  32. Galluzzi, M., et al. Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials. Nat Communications. 9 (1), 3584 (2018).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 179، المجهر قوة الجر (TFM)، micropatterns، الهيدروجيل، الالتصاق الخلية، مصفوفة خارج الخلية، ميكانيكا الخلية، شبه الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الطباعة الحجرية
التحكم في الالتصاق الخلية باستخدام تقنيات النقش هيدروجيل للتطبيقات في المجهر قوة الجر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christian, J., Blumberg, J. W.,… More

Christian, J., Blumberg, J. W., Probst, D., Lo Giudice, C., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C., Schwarz, U. S., Cavalcanti-Adam, E. A. Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy. J. Vis. Exp. (179), e63121, doi:10.3791/63121 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter