Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Published: January 29, 2022 doi: 10.3791/63121
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 3, 3, 2, 1
1Department of Cellular Biophysics, Max Planck Institute for Medical Research, 2Institute for Theoretical Physics and BioQuant, Heidelberg University, 3Institute for Molecular Systems Engineering (IMSE), Heidelberg University

Summary

UV'ye yakın litografi ve çekiş kuvveti mikroskopisi, mikropatterned hidrojeller üzerindeki hücresel kuvvetleri ölçmek için birleştirilir. Tek hücrelerin hedeflenen ışık kaynaklı salınımı, aynı numune üzerinde yüksek sayıda ölçüm sağlar.

Abstract

Kanalizma kuvveti mikroskopisi (TFM), mekanobiyolojide hücre kuvvetlerini ölçmek için kullanılan başlıca yöntemdir. Genellikle bu, hücre çekişi (2D-TFM) altında deforme olan düz yumuşak substratlara bağlı kalan hücreler için kullanılmaktadır. TFM, polidimetilsiloksina (PDMS) veya poliakrilamid (PA) gibi doğrusal elastik malzemelerin kullanımına dayanır. PA'da 2D-TFM için, yüksek verim elde etmedeki zorluk esas olarak hücre şekillerinin ve çekişlerinin büyük değişkenliğinden kaynaklanır ve standardizasyon çağrısında bulunur. 2D-TFM çalışmaları için mikropatterned PA hidrojellerini hızlı ve verimli bir şekilde imal etmek için bir protokol sunuyoruz. Mikropatternler ilk olarak, hücre dışı matris proteinlerinin sadece mikropatterned bölgelere bağlandığı, yüzeyin geri kalanının hücreler için yapışkansız kaldığı UV'ye yakın ışık kullanılarak maskesiz fotolithografi ile oluşturulur. Hücre dışı matris proteinlerinin mikropatterning aktif aldehit gruplarının varlığından kaynaklanır, bu da tek hücreleri veya hücre gruplarını barındırmak için farklı şekillerde yapışkan bölgelere neden olandır. TFM ölçümleri için, akrilamid ve bis-akrilamid miktarlarını değiştirerek ve düzenli Fourier Transform Traction Sitometri (FTTC) ile hücre çekiş alanlarını yeniden oluşturmak için gömülü floresan boncukların yer değiştirmesini izleyerek farklı esneklikteki PA hidrojellerini kullanıyoruz.

Hücre kuvvetlerinin kesin kaydını daha da sağlamak için, tek hücreler veya hücre grupları için tanımlanmış bölgelerde hücre çekişlerini serbest bırakmak için kontrollü bir desenli ışık dozunun kullanımını açıklıyoruz. Bu yönteme lokal UV aydınlatma çekiş kuvveti mikroskopisi (LUVI-TFM) diyoruz. Enzimyasal tedavi ile tüm hücreler aynı anda numuneden ayrılırken, numunenin farklı bölgelerindeki hücrelerin LUVI-TFM çekiş kuvvetleri sırayla kaydedilebilir. Bu protokolün uygulanabilirliğini gösteriyoruz (i) hücre çekiş kuvvetlerini alt tabakaya kontrollü yapıştırmanın bir işlevi olarak incelemek ve (ii) aynı örnekten daha fazla sayıda deneysel gözlem elde etmek.

Introduction

Hücre dışı ortamlarıyla etkileşime giren yapışkan hücreler, esas olarak hücre dışı matrisi (ECM) aktin sitoskeleton'a bağlayan integrin bazlı odak yapışmalarının aracılık ettiği kuvvetler uygular. Odak yapışıklıkları, integrinlerin fibronektin ve kollajen gibi ECM proteinlerine bağlanması etrafında ortalanan multiprotein montajlarıdır. Integrin kümelenmesi ve odak yapışıklıklarının büyümesi sadece mekanik olarak istikrarlı bir bağlantının kurulması için değil, aynı zamanda hücresel kontrtinaklığın düzenlenmesi için RhoA yolunu etkinleştirenler de dahil olmak üzere diğer odak yapışıklık proteinlerinin işe alınması için de çok önemlidir1. Aktin sitoskeletonunun RhoA'ya bağımlı kontrtinizitesi, hücrelerin alttaki ECM'ye yayılmasına ve göç etmesine ve ayrıca sertliğini hissetmesine izin verir2. Çekiş kuvvetlerinin dağılımı, her ikisi de matris özelliklerine dayanan ve bu nedenle sitoskeletal organizasyonu etkileyen hücrelerin yayılma alanına ve şekline bağlıdır ve sonunda matris mekaniği ile sitoskeletal organizasyon arasında kapalı bir geri bildirim döngüsü oluşturur3,4.

Yüzey mikropatterning teknikleri, ECM yapışkan proteinleri sunan mikron boyutlu bölgeler oluşturarak hücre şeklinin tanımlanmış bir şekilde kontrol altına alınabilmesini sağlar; bu bölgelerin büyüklüğüne, tek hücrelere veya mikropattern5'e yapışan hücre gruplarına göre. ECM proteinleri mikrokontact baskı, foto-desenleme veya lazer desenleme6 gibi farklı yaklaşımlarla cam yüzeyler üzerinde desenlenebilir. UV ışığının (φ = 185 veya 375 nm) yüzey güçlendirme stratejileri ile birlikte kullanılması, farklı şekil ve boyutlarda tasarım ve yüzey kenarlarına yakın yüksek hassasiyete sahip birden fazla protein türünün hareketsiz hale getirilmesi için esneklik sunar7,8. Polietilen glikol (PEG) gibi protein itici kimyasallarla kaplı bölgeler, krom fotomask veya dijital ayna cihazı (DMD) tabanlı maskesiz litografi sistemi ile korunmaktadır. Maskelerdeki desenler, daha sonra ECM proteinleri ile desenlenecek bölgelerin UV ışığına maruz kalmasını sağlar. Hidrojel yüzeylerin ECM proteinleri ile desenlenilmesi, proteinleri cam yüzeyden çıkarmak ve desenlere çapraz bağlantı sağlamak için bir transfer adımı gerektirir. Alternatif olarak, yumuşak malzemeler üzerinde desenleme, önce fotokütle itici bir proteinle kaplanarak, ardından derin UV aydınlatması kullanılarak maskesiz bölgelerin yakılmasıyla elde edilebilir. Derin UV ozon ürettiğinden ve yüzeyi protein bağlama için reaktif hale getirdiğinden, maskesiz bölgeler ECM proteinleri ile kaplanır ve son olarak jel doğrudan maskesiz bölgelerin üzerine polimerize edilir9,10.

Desenli hidrojeller, hücre malzemesi arabilme noktasındaki hücre kuvvetlerini ölçen bir teknik olan TFM'yi gerçekleştirmek için kullanılabilir11. 2D-TFM'de, biri deformasyonları izlemek için işaret boncuklarının gömülmüş olduğu kalın bir polimer filmin düz yüzeyini kullanır12,13,14,15. Yer değiştirme vektörlerini ayıklamak için, biri deforme olmuş durumdan ve biri referans görüntü olmak üzere iki görüntüyü deformasyon olmadan birleştirmek önemlidir. İki görüntü daha sonra görüntü işleme ile birbirlerinin üzerine eşlenir. Yüksek işaret yoğunluğunda, bu genellikle hidrodinamik akışı yeniden oluşturmak için iyi kurulmuş bir yöntem olan Parçacık Görüntü Velosimetrisi (PIV) ile yapılır. Düşük işaret yoğunluğunda ve 3D-TFM'de, bu genellikle deneysel veri kümesinin belirli özelliklerini içeren Parçacık İzleme Velosimetrisi (PTV) ile yapılır. Hesaplama açısından daha ucuz bir alternatife örnek olarak Kanade-Lucas-Tomasi (KLT) algoritması16 gibi optik akış verilebilir. Hidrojel substratlar söz konusu olduğunda, floresan boncuklar genellikle malzeme polimerizasyonu sırasında yüksek yoğunlukta gömülür ve enzimatik deklarasyon üzerine hücre salınımı öncesi ve sonrası görüntüler kaydedilir. Yapışan hücrelerin enzimatik olarak biremesi, örneğin trypsinization ile, hidrojellerdeki tüm hücrelerden hücresel çekişlerin aynı anda salınmasına yol açar ve bu da yüksek sayıda hücreden ayrıntılı bir analiz elde etmeyi zorlaştırır.

Burada, hücre şeklini ve lokalizasyonunu kontrol etmek için mikropatterned hidrojeller hazırlamak için bir protokol ve tek tek hücreleri substrattan ayırmak için UV kullanarak çekiş kuvvetlerini sırayla verimli bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Çekiş kuvveti ölçümleri için, floresan boncukların sadece üst katmana gömüldüğü, yoğunluklarını artıran ve dikey yayılmalarını azaltan çift katmanlı PA hidrojelleri üretmek için bir teknik sunuyoruz. Hücresel çekiş kuvvetlerinin UV aracılı salınımının mikropatterning ile birleştirilmesi, desenli hücreler arasında yeterli bir mesafe olması koşuluyla, hücre deklamenti (örneğin, ilgi çekici bölgedeki diğer hücrelerin yapışmasını etkilemeden tek hücrelerin) üzerinde uzamsal kontrol elde etmeyi mümkün kılar. Hücresel çekiş daha sonra 2D-TFM için en verimli ve güvenilir yöntem kullanılarak yeniden oluşturulur, yani Fourier Transform Traction Sitometri (FTTC) düzenlileştirme ile17,18.

Protocol

1. Methacrylated kapakların hazırlanması

NOT: Cam kapaklar, PA hidrojellerini kovalent olarak bağlamak ve bu nedenle hücrelerle inkübasyon sırasında kopmalarını önlemek için metakrilatlanır. Mikroskop cam kapaklar yüksek görüntü kalitesi elde etmek için kullanılır.

  1. 300 mL'lik bir çözelti hazırlamak için temiz bir 400 mL cam beher alın ve bir duman kaputunun içine yerleştirin.
  2. Kabın içine 10 mL çift damıtılmış su (ddH2O) ekleyin. Serolojik pipet kullanarak 18,75 mL asetik asit (%≥99,8 pro analiz, s.a.), 18,75 mL 3-(Trimethoxysilyl)propil methakrilit ve 252,5 mL etanol (%≥99,8 p.a.) ekleyin. Çözeltiyi kristalize bir kaba dökün.
  3. 24 mm yuvarlak cam kapak kapaklarını hassas mendillerle temizleyin. Kapakları özel yapım bir politetrafluoretilen rafa yerleştirin.
  4. Rafı çözeltiye daldırın ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. Rafı alın ve tüm kapakları etanol ile durulayın (%99,8 p.a.). Kapakları hava akışı altında kurutun.
    NOT: Methacrylated kapaklar RT'de 1 aya kadar saklanabilir.

2. Hücre dışı matris proteinlerinin cam kapaklar üzerinde mikropatterning

NOT: Cam kapak örtüleri ilk olarak protein ve hücre kovucudan oluşan bir molekül tabakası ile kaplanır. Bu katman daha sonra mikropatterned bölgelerde hücre dışı matris proteinlerinin daha sonra birikmesine izin vermek için bir fotopatterning tekniği kullanılarak çıkarılır.

  1. 15 mm yuvarlak cam kapak kılıfı alın ve bir Petri kabına yerleştirin. Kapak kılıfının üst tarafını işaretlemek için elmas bir kalem kullanın. Daha sonra 0,4 mbar ve 200 W'da oksijen plazması tedavisi ile 2 dakika boyunca temizliğe devam edin.
  2. Pipet 100 μL% 0.01 poli-L-lizin çözeltisi her kapak kapağının yüzeyinde. RT'de 30 dakika kuluçkaya yatır. Kapakları 10 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesülonik asit (HEPES) pH 8.5 ile yıkayın. Fazla sıvıyı çıkarın, ancak yüzeyi ıslak tutun.
  3. Pipet 100 μL 50 mg/mL poli(etilen glikol) metil eter süksinimimidyl valerik asit (mPEG-SVA) içinde 10 mM HEPES pH 8.5 her kapak kapağının yüzeyinde. RT'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
  4. Yüzeye 2 μL UV'ye duyarlı fotoinitiatör (örneğin PLPP-jel) ve ardından 40 μL etanol (%≥ 99,8 p.a.) ekleyin. Jel ve etanolün yüzeyde homojen bir dağılımını elde etmek için Petri kabını hafifçe ileri geri eğin. Çözeltinin polimerize olmasını 5 dakika bekleyin.
  5. Altta 20 mm delikli 35 mm Petri kabının içine tek bir kapak kılıfı yerleştirin. Bu, altından gelen lazer ışınlarının doğrudan cam yüzeye ulaşmasını sağlar.
  6. Mikroskobu ve bir ışık desenleme modülini açın (bu cihazla çalışmaya yalnızca lazer güvenlik görevlilerinden bir güvenlik girişinden sonra izin verilir). UV-A lazerini 20x hava hedefinde kalibre edin. Örneği fotoinitiatörle birlikte sahneye koyun. Odağı camın yüzeyine ayarlayın ve odak kontrolünü açın. Önceden çizilmiş deseni yükleyin ve kilitleyin.
    1. Inkscape gibi bir grafik yazılımı kullanarak deseni hazırlayın. Desen dosyasının DMD boyutlarını aşmadığından emin olun (1824 x 1140 px, bu da 20 x lenste (0,28 μm/px) 552 x 325 μm'ye karşılık gelir).
      NOT: Desenleme sırasında hata olmamasını sağlayacağından, desen dosyası boyutu olarak DMD boyutunun (1824 x 1140 piksel) kullanılması önerilir. Örneğin, 1830 x 1130 piksel boyutunda bir desen dosyası üretmeyin.
    2. Desenin poliakrilamide aktarılması amacıyla, desenlemenin camın merkezinden kenara kadar yarıçapın sadece% 60-70'ine kadar yapıldığından emin olun.
    3. Tek bir hücreyi desenleme için, desenler arasında 100 μm mesafe ve bir hücre grubu için 150-300 μm çapında 50-100 μm çapında bir çap kullanın. Uygun desen boyutu tipik hücre boyutuna bağlıdır ve hücrelerin yapışmasına izin vermek için yeterince büyük olması gerekir.
  7. Desenleme 30 mJ / mm2 UV dozu ile başlayın. Desenleme süresi desen sayısına bağlıdır. Tek bir desen yapmak yaklaşık 1 s sürer.
  8. Desenleme adımını tamamladıktan sonra, yüzeyi fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez durulayın. Numuneyi 1x PBS'de çözünmüş 100 μL 25 μg/mL fibronektin ve 25 μg/mL fibrinojen Alexa488 ile PBS'de RT'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Diğer ECM proteinleri için, desenli bölgeleri tamamen kapsayan en uygun konsantrasyonları bulun.
  9. Yüzeyi 1x PBS ile üç kez durulayın. Desenli camın cam-PA aktarımı için hemen kullanıldığından emin olun. Hidrojel hazırlığı sırasında desenli camı RT'de PBS'de saklayın.

3. Desenli poliakrilamid hidrojellerin imalatı

NOT: Poliakrilamid hidrojeller, yüzeydeki matris proteinlerinin katalizen bağlanması için reaktif aldehit grupları sunmak için oksitlenmiş N-hidroksitil akrilamid (HEA) dahil olmak üzere hazırlanır. Ek olarak, çekiş kuvveti mikroskopi deneyleri sırasında boncuk deplasmanının kaydını iyileştirmek için sadece hidrojel'in üst tabakasına floresan boncukları gömmek için çift katmanlı bir yaklaşım kullanılır.

  1. Methacrylated cam kapakları bir Petri kabına koyun.
  2. Taze oksitlenmiş HEA çözeltisi hazırlamak için, 15 mL santrifüj tüpüne 9,55 mL çift damıtılmış su ekleyin. Ardından, çözeltinin 10 mL'sini almak için 0,5 mL HEA ve 42 mg sodyum (meta) periyodik ekleyin. Çözeltiyi karanlıkta 4 saat boyunca sürekli karıştırın.
  3. 10 mL stok çözeltisi hidrojel elde etmek için Tablo 1'e göre akrilamid, bis-akrilamid ve çift damıtılmış suyu karıştırın (duman kaputunun altında yapın, monomerler nörotoksiktir). Degas ve hava geçirmez bir contaya kapağı kapatın.
    NOT: Stok çözeltisi 4 °C'de 1 yıla kadar aliquotlarda tutulabilir. Kullanmadan önce her zaman Young'ın hidrojel modüllerini karakterize edin.
  4. Çift katmanlı bir PA hidrojel hazırlayın (duman kaputunun altında yapın, monomerler nörotoksiktir).
    1. 1,5 mL'lik bir tüpte 99,3 μL stok çözeltisini, %1 amonyum persülfatın (APS) 0,5 μL'sini ve 0,2 μL tetrametrinediamin (TEMED) karıştırarak alt katmanla başlayın. Çözeltiden 10 μL alın ve methacrylated kapak kapağının ortasına damla yönünde pipetleyin.
    2. Damlacık üzerine dikkatlice 15 mm yuvarlak bir kapak kılıfı yerleştirin ve polimerizasyon için 45 dakika bekleyin. Üst örtü kapağını neşterle yavaşça ayırın.
    3. Üst katman için, 93,3 μLof stok çözeltisini 1 μL taze oksitlenmiş HEA çözeltisi ile hafifçe karıştırın, 5 μL floresan boncuk (200 nm büyüklüğünde boncuklar için kare mikron başına üç boncuklara karşılık gelir), 1.5 mL'lik bir tüpte 0.5 μL% 1 APS ve 0.2 μL TEMED. Çözeltiden 5 μL alın ve zaten polimerize alt tabakanın ortasına damla yönünde pipetleyin.
    4. Mikropatterned kapak kapağını damlacık üzerine hafifçe yerleştirin. Damlacık polimerize için RT'de 45 dakika bekleyin. Desenli tarafın damlacıklara dokunduğundan emin olun. Örtü kapağını neşterle hafifçe ayırın.
  5. 24 mm kapakları iki bileşenli silikon yapıştırıcı kullanarak özel delinmiş 6 kuyulu plakaların altına yapıştırın. 5 dakika sonra kuyulara PBS ekleyin.
  6. Young'ın poliakrilamid hidrojel örneklerinin modülasyonunun atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile karakterize edilir.
    1. AFM tutucusuna küresel bir uçlu bir diyafram takın.
    2. Sert bir substratta (örneğin, cam veya mika) kuvvet mesafesi eğrisi (3-4 V setpoint) elde ederek her bir kantileveri kalibre edin, kantilever hassasiyetini tahmin edin, yüzeyden geri çekin ve yay sabitini elde etmek için bir termal ayar yapın.
    3. Kalibre edilmiş elverdekleri hidrojel numunesinin üzerine yerleştirin ve aşağıdaki parametreleri kullanarak PBS tamponuna kuvvet eğrileri elde edin: 20-30 nN kuvvet setpoint, 5 veya 10 μm/ s yaklaşım ve geri çekme hızı, 5 μm rampa boyutu.
      NOT: PA hidrojel numuneleri içindeki ECM mikropatterned alanları görselleştirmek ve hedeflemek için hava 40x hedefi ve yeşil floresan protein (GFP) filtresi ile donatılmış ters optik mikroskop kullanılmıştır.
    4. AFM analiz yazılımı ile elde edilen kuvveti mesafe eğrilerine karşı çizin.
    5. Temas noktasını bulun ve kuvvete karşı mesafe eğrilerini girinti eğrilerine karşı kuvvete dönüştürün.
    6. Eğrinin girinti kısmını 0,2 ile 0,5 arasında bir Poisson oranı kullanarak Hertz modeline (veya uç geometrisinin işlevine uygun bir mekanik modele) takın.

4. Hücre çekiş kuvvetlerinin UV-A lazer aydınlatma (LUVI-TFM) ile lokal salınımı

NOT: UV-A lazer, hidrojellerin tanımlanmış bölgelerinde lokalize hücrelerde çekiş kuvvetlerini serbest bırakmak için uygulanır. UV-A lazer (yani, φ = 375 nm katı hal lazer, <15 mW) sınıf bir 3B lazerdir. Korumasız lazer ışını gözler ve genellikle cilt için tehlikelidir. Yansıyan ve dağılmış ışık ve radyasyon tehlikeli olabilir. Ayrıca, UV radyasyon cilt kanserine neden olabilir. Cihazlarla çalışmaya ancak lazer güvenlik görevlilerinin güvenlik girişinden sonra izin verilir.

  1. PBS'i kuyulardan apire edin.
  2. Büyüme ortamında 6 kuyu plakası başına tohum 3 x 106 hücre. Fibroblastlar için, L-glutamin içeren ve% 10 Foetal Sığır Serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) kullanın. Hücreleri gece boyunca %37 °C/5 CO2'de kuluçkaya yatırın. Mikroskopiye başlamadan önce yüzen hücreleri çıkarmak için örnekleri yıkayın.
  3. 37 °C ve %5 CO2 atmosfer sıcaklığı elde etmek için mikroskop inkübasyon odasını ve gaz kaynağını açın.
  4. Mikroskobu ve lazer desen modülini açın. Gerekirse, Leonardo yazılımını kullanarak UV-A lazerini 20x hava hedefinde yeniden kalibre edin. Özel yapım 6 kuyu plakasını numunelerle birlikte sahneye yerleştirin. Pa'nın yüzeyine odaklanın.
  5. Aydınlatma desenini kur ve ilgi çekici hücreleri işaretle. Hidrojel yüzeyine yeniden odaklanın. Brightfield kanalındaki hücrelerin görüntüsünü alın. Cy5 kanalına geçin (uzak kırmızı filtre, 650 nm ekscitasyon, 670 nm emisyon) ve deforme olmuş durumdaki boncukların görüntüsünü alın.
  6. Lazer kanalına kay. Lazeri 3 dakika açın. Özel kurulumumuzda, bu 6.000 mJ / mm2'lik bir ışık dozu ile karşılık geldi.
  7. Cy5 kanalına geçin ve boncukların biçimlendirilmemiş durumda bir görüntüsünü alın.
    NOT: Fare embriyonik fibroblastlarını kullanarak deneme yapmak için, referans/biçimsiz görüntüyü kaydetmek için 15 dakika pozlama sonrası bekleyin ( Temsili Sonuçlar bölümüne bakın). Diğer hücre türlerinde farklı olabilir. İlgi çekici başka bir hücre için 4,5-4,7 adımlarını yeniden yineleyin.
  8. UV-A aydınlatmadan sonra yüksek oksidatif stresi ölçmek için piyasada bulunan reaktifi (CellRox) kullanın. CellRox azaltılmış durumda floresan değildir ve reaktif oksijen türleri tarafından oksitlendiğinde, maksimum ~665 nm emisyona sahip floresanlardır.
  9. Sağlanan protokole göre, görüntüleme ortamına 5 μM reaktif ekleyin ve 37 °C/5% CO2'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın. Ardından, hücreleri ılık 1x PBS ile 3x yıkayın ve görüntüleme medyasını değiştirin. Cy5 sinyalini, benzer bir ışık maruziyeti kullanarak UV-A aydınlatması öncesi ve sonrası floresan görüntüleme ile kaydedin.

5. Görüntü işleme, parçacık görüntü velosimetrisi ve çekiş kuvvetlerinin hesaplanması

NOT: Hücre çekiş kuvvetleri floresan boncukların yer değiştirmesi analiz edilerek kaydedilir ve parçacık görüntü velosimetrisine dayalı görüntü analiz araçları kullanılarak hesaplanır.

  1. Fiji'yi kullanarak lazerden önce (yani deforme olmuş) ve lazerden sonra floresan boncuk görüntülerini açın. İki görüntüyü tek yığın olarak birleştirme (Resim | Yığınlar | Yığına Resimler).
  2. StackReg eklentisini kullanarak iki görüntü arasındaki yanal sürüklenmeyi düzeltin (P. Thévenaz, İsviçre Federal Teknoloji Enstitüsü Lozan). Görüntüleri 8 bit'e değiştirme (Resim | | yazın 8 bit) ve 1024 x 1024 pix'e yeniden ölçeklendirin (Resim | Ölçek). Her zaman başında referans görüntüsü olan bir Görüntü Sırası (TIFF biçimi) olarak kaydedin.
  3. OpenPIV projesinde uygulandığı gibi PIV alanından bir çapraz korelasyon tekniği19 kullanarak öteleme vektör alanını alın.
    1. Rahat (biçimsiz) görüntünün ve deforme olmuş görüntünün piksel cinsinden wR ve wD boyutunda arama pencereleriyle kaplatılmış olduğundan emin olun. Her arama penceresi için, aşağıdaki formülü kullanarak bir çapraz korelasyon işlevi tanımlayın:
      Equation 1
      Burada, R(i,j) ve D(i,j), seçili arama penceresine kesilen ve daha sonra ayna dolgulu iki görüntünün yoğunluk alanlarını açıklar. Equation 2 ve Equation 3 ortalama değerlerini açıklar. Pencere boyutları wR = 32 ve wD = 32 olarak seçilir ve komşu arama pencereleri arasında %70'lik bir çakışma kullanılır.
    2. Her arama penceresi için, çapraz korelasyon işlevini en iyi duruma getiren ve arama penceresinin orta konumuna atayan bir yer değiştirme vektörü Equation 4 belirleyin. Subpixel doğruluk, açıklandığı gibi maxima bölgesinin etrafına bir Gauss uyumu kullanılarak elde edilir20.
    3. Belirsiz yer değiştirme vektörlerini bulun ve kaldırın. Çapraz korelasyon işlevinin 1,5 eşiğinin altındaki en yüksek iki yerel maksima arasındaki oranın belirsiz olarak kabul edildiği arama pencerelerine karşılık gelen yer değiştirme vektörleri21.
    4. 1.522 artık eşiği için normalleştirilmiş ortanca testini başarısız olan yer değiştirme vektörlerini atın.
    5. (İsteğe bağlı) Tüm yer değiştirmelerden sabit bir vektör Equation 5 çıkararak kalan yanal sürüklenmeyi düzeltin. Bu, hücreden uzak seçili bir alandaki yer değiştirme kaybolduğu için yapılır.
    6. Elde ettiği deplasman vektör alanını, kübik bir polinom enterpolasyonu kullanarak giriş görüntülerinin 4 px aralığıyla normal bir ızgaraya enterpolasyon yapın. Eksik veri noktaları düzgün bir çift değişkenli spline ekstrapolasyon kullanılarak doldurulur. Piksel cinsinden bir yer değiştirme vektörü, görüntünün piksel oranına göre yerel bir deformasyonla ilgilidir (20x hava lensi için 0,33 μm/px).
    7. (İsteğe bağlı) Sonraki analizde zil takıntı yapıtlarını azaltmak için görüntüyü aynala ped.
    8. Sürüklenme düzeltmesi nedeniyle kenar etkisini ortadan kaldırmak için deformasyon alanını Tukey pencere işleviyle 0,2-0,3 parametresiyle çarpın. Bu deneyde, FOV'un merkezinde yer alan mikropatterned alan ilgi çekicidir.
  4. Düzenli Fourier Transform Traction Sitometrisi (FTTC)18 kullanarak çekişi yeniden yapılandırın. Düzenlileştirme olarak en basit makul seçimi, yani 0. 26 tarafından tanımlanan Genelleştirilmiş Çapraz Doğrulama (GCV) işlevini en aza indirebilecek şekilde en uygun normalleştirme parametresi φ seçilir:
    Equation 6
    Burada, tüm Fourier örnekleme modları için verilen φ değeri için yeniden yapılandırılmış çekiş alanının x ve y bileşenlerini içeren yığılmış bir vektör bulunur ve G, FTTC için tanımlandığı gibi çekiş alanlarını karşılık gelen deplasman alanlarına eşleyen doğrusal operatördür. Toplam vektör bileşenleri üzerinde çalışıyor. ui, tüm Fourier örnekleme modları için yer değiştirme alanının x ve y bileşenleridir. GCV, kötü pozlanmış ters problemler alanında yaygın olarak kullanılır ve TFM'de sıklıkla kullanılan L eğrisi kriterine iyi bir alternatiftir. Lanzcos filtresi, sınırlı frekans alanı ve yer değiştirme alanı yukarı örneklemesi nedeniyle yapıtları azaltmak için kullanılır. Çekiş hesaplaması, Young'ın PA modülüne (örneğin, 11,3 kPa) ve Poisson'un oranına (örneğin, çapraz bağ konsantrasyonuna bağlı olarak 0,2 ile 0,5 aralığındaki PA için) bağlıdır.

Representative Results

PA hidrojelleri, PA'nın kovalent bağlantısı için reaktif gruplar sunan methacrylated cam kapaklar üzerinde polimerize edildi. Bu şekilde, hidrojelleri sulu bir çözeltiye yerleştirirken, alt tabakadan kopması önlenmiştir (Şekil 1A-D). Hidrojel yüzeyinin yakınında yüksek yoğunluklu fidüsyal belirteçler elde etmek için çift katmanlı bir PA hidrojel hazırlanmasını geliştirdik. Alt tabaka, herhangi bir floresan boncuk olmadan, methacrylated kapaklı üzerinde polimerize edildi. Daha sonra, boncuk içeren başka bir katman alt tabakanın üzerine polimerize edildi (Şekil 1E-H), genellikle tek bir odak düzleminde boncuk dağılımı elde etmek ve boncuk yoğunluğunu artırmak için kullanılan tortulaşma ihtiyacının yerini aldı. TFM ölçümleri sırasında hücre şekli üzerinde kontrol sağlamak için, fibronektin desenli mikroyapıların cam kapaklıktan polimerize pa'ya doğrudan aktarılması yoluyla mikropatterned PA hidrojelleri ürettik (Şekil 1F-F'). Üst hidrojel tabaka çözeltisine% 1 geleneksel olmayan çapraz bağlayıcı (oksitlenmiş HEA) eklenmesi, fibronektin amin gruplarına yaygın olarak bağlanan aldehit grupları sağlar.

Yaklaşık 60 μm kalınlığında pa hidrojeller ve hidrojel yüzeyine yakın üst tabakada kapalı floresan boncuklar hazırladık. Bu tip hidrojel, ters mikroskoplarla hücresel çekişleri görüntülemek için uygun bir substrattır ve yeterince kalındır (TFM'yi gerçekleştirmek için minimum kalınlığın 20-30 μm olduğu bildirilmiştir)18 cam substratın herhangi bir etkisini önlemek için. Floresan boncukların lokalizasyonu konfokal mikroskopi ile görüntülendi (Şekil 1I). Hidrojel üzerinde protein transferini görselleştirmek için floresan etiketli ECM proteinleri kullandık ve epiflooresans mikroskopisi ile görüntüledik (Şekil 1J). Yapışkan hücrelerin parlak alan görüntülerinin yer paylaşımında gösterildiği gibi, hücre gruplarının veya tek hücre gruplarının yapışmasını sağlamak için 100 μm (sol taraf) ve 50 μm (sağ taraf) çapında mikropatterned fibronektin daireleri hazırladık ve floresan olarak etiketlenmiş fiducial boncuklar ve fibronektin mikropatternleri. Farklı bir örnekte, tek hücrelerin mikropatterned fibronektinlere yapışkan tepkisi, paxillin gibi fokal yapıştırma proteinlerinin lokalizasyonunu görüntülemek için dolaylı immünofluoresans mikroskopisi ile doğrulandı (Şekil 1K).

Hem ECM protein kaplaması hem de hidrojel sertliği hücre yapışıklığı için çok önemli parametrelerdir26. PA hidrojellerimizin mekanik özelliklerini karakterize etmek için AFM27 tarafından epiflororesans mikroskobu ile birlikte nanoindentasyon deneyleri gerçekleştirdik. Üç farklı sertliğin hidrojel substratları kurulumuzla hazırlandı ve test edildi (Şekil 2 ve Tablo 1). Küre şeklindeki AFM dokunsallarına döngüsel olarak yaklaşıldı ve kırılmamış PA hidrojellerinden geri çekildi ve kuvvet mesafesi eğrileri kayıt altına alırken Alexa488-mikropatterned alanlara eşlenen fibrinojen. Daha sonra, Temas noktası değerlendirmesi ve Hertz modelinin uygulanması, her numunenin Young modülü (E) tahmin etmemizi sağladı. ECM mikropatterning, Genç'in modülünde değişiklik yapmadı, bu da her bir pa hidrojel ile karşılaştırılabilir kaldı.

Alt tabakadaki yapışık hücreler tarafından uygulanan çekiş kuvvetlerini ölçmek için, hücre çekişlerini serbest bırakmak için yakın UV lazer modülü (UV-A 6000 mJ/mm2) ile donatılmış geniş alan epifluoresans mikroskobu üzerinde gerçekleştirilen referans tabanlı TFM için deneysel bir kurulum geliştirdik (Şekil 3A). Lazer ışını aydınlatması mekansal olarak zamansal olarak kontrol edilebildiğinden, sadece yüksek lazer dozu ile tek bir hücreyi veya hücre kümesini seçici olarak açığa çıkarmak mümkün değildir, aynı zamanda ve daha da önemlisi, tripsin gibi bir sindirim enzimi kullanarak tüm numuneden hücre çıkarmanın yıkıcı ara adımı artık gerekli değildir. Bu kadar yüksek lazer dozu ile hücreleri aydınlatmak, hücre ölümüne yol açan yüksek bir oksidatif strese neden oldu (Şekil 3B). Hücre ölümü, boncuk yer değiştirmesi ile belirtildiği gibi substrattan çekiş salınımını sağladı (Şekil 3A'da gösterilmiştir). PA hidrojellerinin mikron büyüklüğündeki bölgelerini seçici olarak aydınlatmak için UV-A aydınlatmasını bir ışık desen modülü ile birleştirdik (Şekil 3B-C). Bu şekilde mikropatterned hücre kümelerinin (Şekil 3C, F) veya tek hücrelerin (Şekil 3B) çekişlerini serbest bırakmak mümkündür. Daha da önemlisi, zamanımızda ECM desenli hidrojellerin mekanik özellikleri UV maruziyeti tarafından önemli ölçüde etkilenmedi (Şekil 2C). Oksidatif stresteki artış Şekil 3D,E'de gösterilmiştir. Çekiş kuvvetleri, Genelleştirilmiş Çapraz Doğrulama (Şekil 3B, F) tarafından seçilen bir düzenlileştirme parametresi ile düzenli fttc kullanılarak yeniden inşa edilmiştir. Tek hücreler için kuvvetlerin salınımı 15 dakikalık bir süre içinde meydana geldi ve LUVI-TFM'nin sonucu tripsin bazlı TFM ile karşılaştırılabilir (Şekil 3G-H).

Figure 1
Şekil 1: TFM için desenli fibronektin-substrat preparat şeması. (A) Alt tabaka için çözelti methacrylated yüzey üzerine pipetlenmiştir. (B) Damlacığın üzerine daha küçük bir temiz kapak kılıfı dikkatlice yerleştirilir. (C) Jelleşme süresi 45 dk'dır. (D) Üst kapakçık ayrılmıştır. Alt katman hazır. (E) Üst tabaka için çözelti hidrojel üzerine pipetlenmiştir. (F) Desenli kapak kapağı damlacık üzerine dikkatlice yerleştirilir. (F') Yapışkan proteinlerin cam üzerine mikropatterningi, UV-litografiye yakın maskesiz olarak üretilir ve daha sonra camdan PA hidrojel'e aktarılır. Yapışkan proteinlerin serbest amin grupları, örneğin fibronektin, PA yüzeyindeki aldehit gruplarına kovalent olarak bağlanır. (G) Jelleşme süresi 45 dk'dır. (H) Üst kapakçık ayrılmıştır. Desenli PA hidrojel hazır. (I) Yüzeye yakın yüksek yoğunluklu fidüsyal boncukları gösteren konfokal ksyz mikrografinin 3D gösterimi. (J) PA yüzeyinde floresan etiketli fibronektin (macenta) gömülü floresan boncuklu (yeşil) bir mikrografi, hücrelerin parlak bir alan görüntüsü ile kaplanmış. (K) Daire şeklindeki fibronektin mikropatterine (100 μm) bağlı tek bir hücrenin dolaylı immünofluoresans mikroskopisi. Çekirdek (mavi), paxillin (kırmızı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Numune mekanik özelliklerinin AFM tarafından karakterizasyonu. (A) AFM nanoindentasyon deneysel kurulumu. Küre şeklindeki bir kantilever, UV tedavisinden önce veya sonra ECM mikropatternlerini ve çift katmanlı PA (%5 Akrilamid, %0,3 Bis-akrilamid) alanlarının desensiz bölgelerini araştırmak için kullanılır. (B) ECM mikropattern (siyah) için girinti eğrisi ile temsili kuvvet. Hertz fit (kırmızı), Young'ın numunenin modülünü (E) hesaplamak için kullanılır. (C) UV-A maruziyeti sonrası desensiz çift katmanlı PA alanları (ECM yok), ECM mikropattern ve ECM mikropattern için mekanik ölçümler. Barlar ± S.E.M. (Brown-Forsythe ve Welch ANOVA testi) anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Yerel UV-A aydınlatma TFM (LUVI-TFM), geniş bir görüş alanında yerel çekiş kuvveti ölçümleri sağlar. (A) Yerel UV-A aydınlatma TFM şeması. Hücreler, biçimsiz (referans) görüntüyü elde etmek için yüksek dozda UV-A lazer ile tedavi edilir. (B) UV-A lazer aydınlatmadan önce tek bir hücrenin parlak alan görüntüsü. Orta: UV-A lazer aydınlatmadan sonra tek bir hücrenin parlak alan görüntüsü. Sağ: 50 μm çapında UV ışık huzmesi (kırmızı kesikli çizgi) ile aydınlatılmış fibronektin kaplı PA hidrojeline (E = 5,74 kPa) bağlı kalan tek bir MEF'in çekiş kuvveti. (C) Sol: Mikropatterned fibronektin (daire, 100 μm çapında) bağlı bir fare embriyonik fibroblast kümesinin (MEF) çekiş kuvvetlerinin kaydı. Küme 200 μm çapında UV ışık huzmesi (kırmızı kesikli çizgi) ile aydınlatıldı. Sağ: Mikropatterned fibronektin (daire, 300 μm çap) bağlı bir fare embriyonik fibroblast kümesinin (MEF) çekiş kuvvetlerinin kaydı. Küme 300 μm çapında UV ışık huzmesi (kırmızı kesikli çizgi) ile aydınlatıldı. Ölçek çubuğu = 200 μm. (D,E) Floresan mikroskopi ile yüksek UV-A lazer dozu tespit edildikten sonra artan Cy5 sinyal yoğunluğu ile belirtilen hücrelerde oksidatif streste bir artış. Oksidatif stres hücre ölümüne yol açar. Ölçek çubuğu = 200 μm. (F) Sol: Mikropatterned fibronektin (daire, 100 μm çapında) bağlı bir fare embriyonik fibroblast kümesinden (MEF) stres ısı haritası. Sağ: Mikropatterned fibronektin (daire, 300 μm çapında) bağlı bir fare embriyonik fibroblastlar (MEF) kümesinden stres ısı haritası. (G) 100 μm fibronektin mikropatternlerine yapışmış MEF hücreleri UV-A maruziyeti sonrasında çekişlerini yavaşça serbest bırakır. Tam sürüm 15 dakika sonra elde edilir (referans görüntü daha sonra 15 dakika pozlama sonrası çekildi). (H) 300 μm çapında desenli fibronektin'e bağlı kalan MEF hücreleri için geleneksel tripsin bazlı TFM ile karşılaştırma. UV-A aydınlatmasının (6.000 mJ/mm2) ve ardından 15 dakikalık beklemenin sonucu, geleneksel tripsin tedavisinden önemli ölçüde farklı değildir (yani, 20 dakika için% 0.05). Çubuklar S.E.M. anlamına gelir (iki kuyruklu Öğrenci t testi, ****P < 0.0001, * P < 0.05, ns P ≤0.5). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Akrilamid (%) Bis-akrilamid (%) % 40 stok çözeltisinden akrilamid (ml) %2 stok çözeltisinden bis-akrilamid (ml) Su (ml) Genç modülü (kPa)
4 0.1 1 0.5 8.5 5,74 ± 0,53
5 0.15 1.25 0.75 8 9,69 ± 0,68
5 0.3 1.25 1.5 7.25 11,33 ± 1,06

Tablo 1: Hidrojel stok çözeltisi karışımları ve eldeki esneklik

Tüm veriler Max Planck Society'nin (Edmond) Açık Erişim Veri Deposu'na yatırılır ve aşağıdaki adresten erişilebilir: https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf

Discussion

Bu protokolde, TFM çalışmaları için fidüsyal belirteçler olarak kullanılan floresan boncuk içeren mikropatterned PA hidrojellerinin hazırlanmasını açıklıyoruz. Yaklaşımımız üç adıma dayanmaktadır: 1) çift katmanlı PA hidrojellerin hazırlanması; 2) ECM proteinlerinin mikropatterning ve hidrojel yüzeye aktarılması; 3) TFM için desenli UV'ye yakın ışık kullanımı. Alt tabakadaki hücre çekişlerini analiz etmek için deneysel kurulum, floresan boncukların yer değiştirmesiyle ilgili kuvvetleri hesaplamak için bilinen sertlik değerlerine sahip doğrusal elastik malzemelerin kullanılmasını gerektirir26. PA hidrojellerin hazırlanması kolaydır, sertlik kolayca ayarlanabilir ve genellikle sertlik algılama ve TFM18,28 için kullanılırlar. Bununla birlikte, tekrarlanabilir polimerizasyon süreleri ve tüm hidrojelin homojen polimerizasyonunu elde etmek için, reaktiflerin depolama koşullarına ve zamanına dikkat edilmelidir, örneğin, APS aktivitesini kaybetmemek için bir kurutucuda tutulmalıdır; TEMED doğrudan ışıktan korunmalıdır. Oksitlenmiş HEA kullanımı, tam ve istikrarlı bir protein tabakasının oluşumunu sağlamak için avantajlı olabilecek hidrojel yüzeydeki matris proteinlerinin katalent bağlanmasına izin verir. Oksitlenmiş HEA çözeltisi, PA hidrojelleri her imal ettiğinde taze olarak hazırlanmalıdır. Çift katmanlı PA hidrojel üç ana avantaj sunar: 1) jeli son derece ince hale getirmeye gerek kalmadan hidrojel yüzeye yakın fidücial boncukların homojen bir dağılımını yeniden elde etmek için alternatif bir yol sağlar (yani, <20 μm). Hidrojel kalınlığı üzerindeki kontrol, TFM ile doğru ölçümler elde etmek için çok önemlidir. Elastik substrat çok ince olduğunda, fibroblastlar gibi güçlü yapışık hücreler alttaki sert cam substratı hissedebilir ve mekanik olarak yanıt verebilir29,30. Kalın hidrojeller, kuvvetin yeniden inşası için görüntü alımını daha zor hale getirir. Ayrıca, ultra ince mikroskopi slaytları kullanılmadığı sürece, hidrojel takmak için kullanılan cam substratın ek kalınlığı göz önüne alındığında, birçok mikroskop bunları barındırmak için yeterli alana sahip olmayacaktır. 2) Çift katmanlı PA hidrojelde, PA hidrojel yüzeyine yakın fidüsyal boncukların homojen dağılımı, bir santrifüj kullanmadan, aksine hassas miktarlarda hidrojel çözeltilerinin ve floresan boncukların basit bir inkübasyonu ile elde edilir. PiV analizi yapılırken yüksek boncuk yoğunluğu önemli bir avantajdır, çünkü konfokal mikroskopiye gerek kalmadan çekiş kuvvetlerinin çözünürlüğünü ve sinyal-gürültü oranını arttırır. 3) Boncukların hücre malzemesi arayüzüne yakın ince bir tabakaya hapsedilmesi, epifluoresans mikroskoplarının yanı sıra konfokal mikroskoplarla çekiş kuvvetlerinin görüntülenmesini sağlar. Hidrojel hazırlarken, kullanıcı protokolün sonraki adımlarına geçmeden önce alt cama sıkıca yapışdığından emin olmalıdır. Hidrojel yüzeyine zarar vermeden yüzeyin üstündeki camı çıkarmak zor olabileceğinden, hidrojel tabakalarının polimerizasyonu için belirtilen kuluçka süresini takip etmenizi öneririz.

Elastik özellikleri ölçmek için en iyi bilinen teknikler AFM, nanoindentasyon, çekme testleri ve romatizmadır. Bununla birlikte, nanoindentasyon, elastik özelliklerin belirlenmesini etkileyebilecek malzemeler üzerinde çok yüksek suşlara neden olan suşlara neden eder. Öte yandan çekme testleri ve romatizma makroskopik ölçüm teknikleridir, hücreler ise mikroskobik ölçekte etkileşime girer31,32. AFM, fizyolojik koşullar altında daha az suşla mikro ölçekli ölçümlere izin verir. Deneysel ayrıntılar eksikse (örneğin, girinti kuvveti ve hızı) veya yetersiz veri kaydedilirse AFM ölçümlerinin güvenilirliği olumsuz etkilenebilir27. Huth ve arkadaşları, Ölçüm ayrıntılarını sabit tutmayı vurgulayan Young'ın modülünü AFM verilerinden çıkarmak için bir algoritma tanımlar27. Bu algoritma Young'ın modülünün kesin ve güvenilir bir şekilde belirlenmesini sunar ve deneylerimiz için kullanılmıştır. Ek olarak, farklı günlerde üretilen numunelerde birçok eğri ölçtük ve çok benzer sonuçlar elde ettik (ortalama değerlerin değişimi 1-2 kPa). Bu, jellerimizin sertliğinin güvenilir bir şekilde tahmin edilebileceğini göstermektedir.

Bu protokolde, cam üzerinde mikropatterned bölgeler oluşturmak için bir fotopatterning modülü kullanıyoruz, daha sonra hidrojel yüzeylere aktarılıyor. Bu protokolde gösterilen mikropatterning, DMD (dijital mikro ayna cihazı) tabanlı maskesiz UV'ye yakın litografiye (φ = 375 nm)7 dayanmaktadır. Bir DMD, bir çip üzerinde çok sayıda mikromirrörden oluşur. Tek bir piksel tek bir mikro aynaya karşılık gelir. Bir bilgisayardan pikselli desen görüntü dosyası DMD aracılığıyla yansıtılır ve objektif bir lens kullanılarak yüzeye odaklanır. Proteinlerin mikropatterning için, odaklanmış lazer ışığı bir fotoinitiatör yardımıyla itici polimer fırçaları cleave için kullanılır. Daha sonra, maruz kalan bölgeler ECM proteinleri ile doldurulur. Bu maskesiz ablasyon yöntemi, foto maskesi kullanımına dayanmediği için yeni desenler tasarlamada büyük esneklik sunar. Bir desen tasarlamak ve uygulamak çok kolaydır, çünkü Inkscape gibi ücretsiz bir yazılım kullanmak sadece birkaç dakika sürer. Ancak, kısa sürede üretilen desen ve numune sayısı büyük bir dezavantajdır, çünkü bu yöntem her seferinde yalnızca tek bir substratı desenlamak için kullanılabilir. Fotopatterning modülü, birkaç miliwatt yayan yakın bir UV katı hal lazer kaynağı kullanır. Korumasız lazer ışını gözler ve cilt için tehlikelidir. Yansıyan ve dağılmış ışık ve radyasyon da tehlikeli olabilir. Elleçleme, lazer subaylarından gelen bir güvenlik talimatı ile birlikte verilmelidir. Bir fotopatterning modülü kullanırken protokoldeki en kritik adım, mikropatterning ve ablasyon sırasında lazerin yüzeye düzgün bir şekilde odaklandığından emin olmaktır. Desenleme sırasında UV ışığının tutarlı bir aydınlatma dozu (zamanla çarpılır) lazerin yüzeye nasıl odaklandığına bağlıdır. Zayıf odak nedeniyle yüzeydeki zayıf bir yoğunluk, ECM'nin hidrojel yüzeyine transferinin başarısız olmasına neden olabilir ve bu da hiçbir hücrenin hidrojele bağlanmamasına neden olabilir.

TFM deneylerinde, yapışık hücrelerin ve fidüsiyal belirteçlerin ilk görüntülemesinden sonra, hücreler rahat durumlarını kaydetmek için trypsin tedavisi ile PA hidrojelinden salınır. Bu adımı gerçekleştirmenin bir dezavantajı, örneği mikroskopi aşamasında işlemektir. Perfüzyon odası olmadan, kabın kapağını açmak, ortamı aspire etmek, durulama ve pipetleme tripsin çözeltisi yeni başlayanlar ve deneyimli kullanıcılar için bir meydan okumadır. Aslında, bu prosedürler ksyz eksenlerindeki sürüklenmenin önemli bir kaynağıdır ve pozisyon ve odaklanma kaybına neden olandır. Yerel UV aydınlatma protokolümüz, TFM'i yeni başlayanlar için daha erişilebilir bir teknik haline getirir. Ticari olarak mevcut bir mikroskopi tabanlı maskesiz fotopatterning modülü kullandığımız belirtilmelidir, ancak prensip olarak herhangi bir UV-A aydınlatma sistemi, sonunda hücre çekiş kuvvetlerinin kaydedilmediği substratların bölgelerini korumak için bir maske ile birlikte kullanılabilir. Hücrelerin önemli dozda düşük dalga boyu görünür ışığa (örneğin, DAPI emisyonunu heyecanlandıran mor ışık) maruz bırakılması, fototoksikite ve hücre ölümü ile sonuçlanabilecek oksidatif stresin artmasına neden olacaktır. Bu nedenle, bu teknik UV lazer modülü olmayan bir epifluoresans mikroskopunda bile uygulanabilir. Ancak yoğunluk çok daha zayıf olduğu için bu durumda enzymatik tedavi ile TFM'yi başarmak çok daha kolay olacaktır.

LUVI-TFM ile tek hücrelerin veya küçük hücre gruplarının lokal olarak birleşmesi nedeniyle aynı örneği çeşitli ölçümler için kullanmak mümkündür. Bununla birlikte, komşu hücrelerden güç kaydedilmemesi için ayırmak için hücre seçimine dikkat edilmelidir. Bu nedenle, mikropatternlerin yokluğunda tek hücreli ölçümler için kalabalık bölgelerden kaçınılmalıdır; tek mikropatterned hücreler üzerinde ölçümler için, desenler tek yapılar arasındaki mesafe desenli alanın çapının en az iki katı olacak şekilde tasarlanmalıdır. Ayrıca, bitişik desenlerdeki hücreleri sırayla kullanmamanızı, aksine alt tabakadaki uzak bölgelerden örneklemenizi öneririz. Ölçümümüz, odak kontrol özelliği ve lensin çalışma mesafesinin yeterince uzun olduğu ve bir kuyudan diğerine hızlı hareketin yüksek oranda ayarlanabilir olduğu 40 x hava NA = 0,9 lens ile donatılmış bir epifluoresans mikroskobu üzerinde iyi bir şekilde gerçekleştirilir. TFM uygulamaları için hücrelerin hedeflenen ayırması, tek bir hücrenin veya tüm küçük hücre kümesinin (örneğin, çapı 300 μm'ye kadar) hücresel kuvvetini ölçmek için etkilidir. Kurulumumuzu kullanarak, tek hücrelerin UV tedavisi için hücre yuvarlama ve dekupeksleme gözlemledik (Şekil 3A), küçük hücre kümeleri için ise nadiren kopma meydana geldi. Bu, hücre çekiş kuvvetlerinin hafife almasına neden olabilir. Daha büyük hücre kümeleri için, kullanıcıların tüm kümeyi görüntülemesi için 20x hava hedefi kullanması gerektiğinden ve bir odak denetimi özelliği gerektiğinden, enzimatik ayırma önerilir. 20x hava lensinin odak derinliği çok daha uzun olduğundan, yol tutuşu daha yüksek büyütme hedefi kadar kritik olmayacaktır. Aydınlatma dozu yüzeydeki lazer odağına bağlı olduğundan, kullanıcı odakların hücrelerin ablasyonu için doğru ayar olduğundan emin olmalıdır. Komşu işlenmemiş hücrelerle olası mekanik etkileşimler nedeniyle hücre kolektiflerinde LUVI-TFM'nin kullanılmasındaki olası sınırlamaların farkında olsak da, bu yönün hedeflenen hücre ekstrüzyonunun mekaniği üzerine yapılan çalışmalar için yararlı olabileceği ortaya çıkabilir, örneğin epitel monolayerlerden.

Sonuç olarak, TFM yaklaşımımız mikropatterned hücrelerin ışık kaynaklı salınımı ile birleştiğinde, hücre yapıştırma kuvvetlerini ölçmek için sağlam ve yüksek verimli bir protokol sağlıyoruz. Bu yöntemin çok yönlülüğü, çözünürlüğü ve duyarlılığı artırmayı amaçlayan mikroskopi ve görüntüleme kurulumu kullanılarak daha fazla kullanılabilir.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Protokol video prodüksiyonunda destek için Bayan Rebecca Alvarado'ya ve el yazması hakkındaki yapıcı eleştiriler için Bay Stephen Casale'ye teşekkür ederiz. Yardımcı tartışmalar için Max Planck Tıbbi Araştırma Enstitüsü Hücresel Biyofizik Bölümü'nden meslektaşlarımıza teşekkür ederiz. Max-Planck-Gesellschaft'tan E.A.A.-A.'ya .C. ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15'den E.A.A.'ya.C-A. ve P4'den ABD'ye; DFG EXC 2082/1-390761711'den ABD'ye) ayrıca büyük ölçüde kabul edilir. J.B. Carl Zeiss Vakfı'na finansal destek için teşekkür eder. E.A.C.-A., C.S. ve U.S.S., Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) tarafından desteklenen Max Planck Okul Meselesi aracılığıyla fon sağlayarak. C.S. Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklenmektedir (Consolidator Grant PHOTOMECH, no.101001797).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate #440159 Sigma Aldrich
Acetic acid #33209 Honeywell
Acrylamide 40 % #1610140 Bio-Rad CAUTION : toxic, work under a fume hood
AFM cantilever #CP-CONT-BSG-A-G NanoAndMore 5 μm spherical tip
AFM system #NanoWizard3 JPK Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter
Ammonium persulfate #A3678 Sigma
Bis-acrylamide 2 % #1610142 Bio-Rad CAUTION : toxic, work under a fume hood
Camera sCMOS #C11440-42U30 Hamamatsu
Camera sCMOS #ANDORZYLA4.2 Oxford Instrument
CellRox #C10422 Thermo Fisher
Custom incubator chamber EMBLEM
Dental glue #1300 100 Picodent
DMEM #41965 Thermo Fisher
Epifluorescence microscope #Eclipse Ti2E Nikon
Epifluorescence microscope #Axiovert200 Zeiss
Ethanol #9065.3 Carl Roth
FBS South America #S181T Thermo Fisher
Fibrinogen #F13191 Invitrogen Alexa488 conjugate
Fibronectin #F1141 Sigma
Fluorescent beads 200 nm #F8805 Invitrogen Carboxylated (365/415)
Fluorescent beads 200 nm #F8848 Invitrogen Carboxylated (505/515)
Fluorescent beads 200 nm #F8810 Invitrogen Carboxylated (580/605)
Fluorescent beads 200 nm #F8807 Invitrogen Carboxylated (660/680)
Glass coverslip 15 mm round #41001115 Assistent
Glass coverslip 24 mm round #41001124 Assistent
Microscope Objective #MRH08230 Nikon 20x air NA 0.45
Mouse Embryonic Fibroblasts #CRL-2991 ATCC
mPEG-SVA #MPEG-SVA-5000 Laysan Bio
N-Hydroxyethyl acrylamide #697931 Aldrich
Plasma cleaner #100-E TePla
PLPP gel #PLPPgel Alveole
Poly-L-lysine #P4823 Sigma Aldrich
Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) SuSoS
Sodium(meta) periodate #S1878 Sigma Aldrich
TEMED #17919 Thermo Scientific
UV Patterning module #PRIMO Alveole
UVO cleaner #342-220 Jelight

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B., Bershadsky, A. Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors. Cell. 110 (2), 139-142 (2002).
  2. Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -l, Hosoya, H. Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7 (2006).
  3. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
  4. Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation. Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).
  5. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  6. Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).
  7. Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
  8. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).
  9. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  10. Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
  11. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  12. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  13. Polacheck, W. J., Chen, C. S. Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools. Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).
  14. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).
  15. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
  16. Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. Dynamics of force generation by spreading platelets. Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).
  17. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  18. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
  19. Willert, C. E., Gharib, M. Digital particle image velocimetry. Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).
  20. Lourenco, L., Krothapalli, A. On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV. Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).
  21. Adrian, R. J., Westerweel, J. Particle Image Velocimetry. , Cambridge University Press. (2011).
  22. Westerweel, J., Scarano, F. Universal outlier detection for PIV data. Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).
  23. Dembo, M., Wang, Y. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  24. Schwarz, U. S., et al. Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization. Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).
  25. Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package. Computer Physics Communications. 256, 107313 (2020).
  26. Vedadghavami, A., et al. Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications. Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).
  27. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
  28. Oria, R., et al. Force loading explains spatial sensing of ligands by cells. Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).
  29. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  30. Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).
  31. Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).
  32. Galluzzi, M., et al. Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials. Nat Communications. 9 (1), 3584 (2018).

Tags

Biyomühendislik Sayı 179 Çekiş kuvveti mikroskopisi (TFM) mikropatternler hidrojeller hücre yapışıklıkları hücre dışı matris hücre mekaniği ultraviyoleye yakın (UV) litografi
Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christian, J., Blumberg, J. W.,… More

Christian, J., Blumberg, J. W., Probst, D., Lo Giudice, C., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C., Schwarz, U. S., Cavalcanti-Adam, E. A. Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy. J. Vis. Exp. (179), e63121, doi:10.3791/63121 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter