Summary

Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer

Published: November 30, 2021
doi:

Summary

Hier stellen wir ein reproduzierbares In-vitro-Elektroporationsprotokoll für die genetische Manipulation von primären Kleinhirn-Granulazellvorläufern (GCPs) vor, das kostengünstig, effizient und lebensfähig ist. Darüber hinaus demonstriert dieses Protokoll auch eine einfache Methode für die molekulare Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Hedgehog-Signalwege in primären GCP-Zellen.

Abstract

Das primäre Cilium ist eine kritische Signalorganelle, die auf fast jeder Zelle vorkommt, die Hedgehog (Hh) -Signalreize von der Zelloberfläche überträgt. Im Granulatzellvorläufer (GCP) fungiert das primäre Cilium als zentrales Signalzentrum, das die Proliferation von Vorläuferzellen orchestriert, indem es den Hh-Signalweg moduliert. Die Untersuchung der primären Cilium-abhängigen Hh-Signalmaschinerie wird durch in vitro genetische Manipulation der Signalwegkomponenten erleichtert, um ihre dynamische Lokalisierung zum primären Cilium sichtbar zu machen. Die Transfektion von Transgenen in den Primärkulturen von GCPs unter Verwendung der derzeit bekannten Elektroporationsmethoden ist jedoch im Allgemeinen kostspielig und führt häufig zu einer geringen Zelllebensfähigkeit und unerwünschten Transfektionseffizienz. Dieses Papier stellt ein effizientes, kostengünstiges und einfaches Elektroporationsprotokoll vor, das eine hohe Transfektionseffizienz von ~ 80-90% und eine optimale Zelllebensfähigkeit aufweist. Dies ist eine einfache, reproduzierbare und effiziente genetische Modifikationsmethode, die auf die Untersuchung des primären Cilium-abhängigen Hedgehog-Signalwegs in primären GCP-Kulturen anwendbar ist.

Introduction

Kleinhirn-GCPs werden häufig verwendet, um die Maschinerie des Hh-Signalwegs in neuronalen Vorläuferzelltypen aufgrund ihrer hohen Häufigkeit und hohen Empfindlichkeit gegenüber dem Hh-Signalweg in vivo zu untersuchen1,2,3,4. In GCPs fungiert das primäre Cilium als pivotaler Hh-Signaltransduktionshub5, der die Proliferation der Vorläuferzellen orchestriert6,7,8. Die In-vitro-Visualisierung von Hh-Signalkomponenten auf dem primären Cilium ist aufgrund ihrer niedrigen endogenen Basalspiegel oft eine Herausforderung. Daher sind die transgene Modifikation der Proteinexpressionsniveaus und die Fluorophormarkierung des interessierenden Gens nützliche Ansätze, um den Signalweg bei molekularer Auflösung zu untersuchen. Die genetische Manipulation von GCP-Primärkulturen unter Verwendung von Liposomen-basierten Transfektionsansätzen führt jedoch häufig zu einer geringen Transfektionseffizienz, was weitere molekulare Untersuchungen behindert9. Die Elektroporation erhöht die Effizienz, erfordert jedoch in der Regel exorbitante herstellerspezifische und zelltypbeschränkte Elektroporationsreagenzien10.

In diesem Artikel wird eine hocheffiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Manipulation der Hh-Signalwegkomponenten in GCP-Primärkulturen vorgestellt. Mit diesem modifizierten Elektroporationsprotokoll wurde ein mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiertes smoothened transgene (pEGFP-Smo) effizient an GCPs abgegeben und erreichte hohe Zellüberlebens- und Transfektionsraten (80-90%). Darüber hinaus zeigten die transfizierten GCPs, wie durch die immunzytochemische Färbung belegt, eine hohe Empfindlichkeit gegenüber der durch Geglätteten Agonisten induzierten Aktivierung des Hh-Signalwegs durch den Transport von EGFP-Smo zu den primären Zilien. Dieses Protokoll ist unmittelbar anwendbar und vorteilhaft für Experimente, die eine genetische In-vitro-Veränderung von schwer zu transfizierenden Zelltypen wie Primärzellkulturen für Menschen und Nagetiere sowie vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen beinhalten.

Protocol

Alle tierbezogenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für den Umgang mit Tieren und dem vom Gesundheitsministerium in Hongkong genehmigten Protokoll durchgeführt. Tierversuchslizenzen gemäß der Animal (Control of Experiments) Ordinance (Cap. 340) wurden vom Gesundheitsministerium der Regierung von Hongkong erhalten. Die Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit der vom HKBU-Forschungsbüro und dem Laborsicherheitsausschuss genehmigten Tiersicherheitsethik durchgeführt. Ausführliche Informat…

Representative Results

Unter Verwendung des Opti-MEM (siehe Materialtabelle) als universelles Reagenz könnte diese vorgeschlagene Elektroporationsmethode eine konstant hohe Elektroporationseffizienz von ~ 80-90% erreichen (Abbildung 1). Die Elektroporationseffizienz des Smo-EGFP-Vektors wurde bei DIV 2 nach der Elektroporation durch Quantifizierung des Prozentsatzes grün fluoreszenzpositiver Zellen in allen gepaarten Box-Protein-6 (Pax6)-exprimierenden GCP-Zellen bestimmt. Die Elektroporationsef…

Discussion

Die Transfektion von Transgenen in primärer GCP-Kultur durch Elektroporationsmethode ist typischerweise mit einer geringen Zelllebensfähigkeit und einer schlechten Transfektionseffizienz assoziiert9,10. Dieses Papier stellt ein kostengünstiges und reproduzierbares Elektroporationsprotokoll vor, das eine hohe Effizienz und Lebensfähigkeit bewiesen hat. Darüber hinaus demonstrieren wir auch eine einfache Methode zur Untersuchung des primären Cilium-abhängige…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch den HKBU Seed Fund und den Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), den Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) an C.H.H. Hor.

Materials

GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C. H. H. Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor. J. Vis. Exp. (177), e63283, doi:10.3791/63283 (2021).

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