Wir haben Standardtechniken der auditiven Hirnstammreaktion (ABR) verwendet und sie auf Junghühner angewendet, ein frühreifes Vogelmodell für die auditive Funktion. Das Protokoll beschreibt die Tierpräparation und ABR-Erwerbstechniken im Detail, mit Schritten, die auf andere Vogel- oder Nagetiermodelle übertragen werden können.
Die auditive Hirnstammreaktion (ABR) ist ein unschätzbarer Assay in der klinischen Audiologie, bei nichtmenschlichen Tieren und in der Humanforschung. Trotz der weit verbreiteten Verwendung von ABRs bei der Messung der auditiven neuronalen Synchronität und der Schätzung der Hörempfindlichkeit in anderen Wirbeltiermodellsystemen wurden seit fast vier Jahrzehnten keine Methoden zur Aufzeichnung von ABRs beim Huhn mehr berichtet. Hühner bieten ein robustes Tierversuchsmodell, da ihr Hörsystem in späten embryonalen und frühen Jungschlüpfstadien kurz vor der funktionellen Reifung steht. Wir haben Methoden demonstriert, die verwendet werden, um ein- oder zweikanalige ABR-Aufnahmen mit subdermalen Nadelelektrodenarrays bei Hühnerschlüpflingen hervorzurufen. Unabhängig von der Elektrodenaufzeichnungskonfiguration (d. h. Montage) enthielten ABR-Aufnahmen 3-4 positiv gehende Peakwellenformen innerhalb der ersten 6 ms eines supraschwellenden Klickstimulus. Die Amplituden von der Peak-to-Trog-Wellenform reichten von 2 bis 11 μV bei hoher Intensität, wobei positive Spitzen die erwarteten Latenzintensitätsfunktionen aufwiesen (d. h. eine Zunahme der Latenz als Funktion der abnehmenden Intensität). Eine standardisierte Kopfhörerposition war entscheidend für optimale Aufnahmen, da lose Haut den Gehörgang verschließen kann und Tierbewegungen den Reizwandler verdrängen können. Die Spitzenamplituden waren kleiner und die Latenzen waren länger, als die Körpertemperatur der Tiere sank, was die Notwendigkeit der Aufrechterhaltung der physiologischen Körpertemperatur unterstützte. Für junge Jungtiere (<3 h nach dem Schlüpfen Tag 1) waren die Schwellenwerte um ~ 5 dB erhöht, die Spitzenlatenzen stiegen um ~ 1-2 ms und die Amplituden von Spitze zu Tal, um ~ 1 μV im Vergleich zu älteren Jungtieren. Dies deutet auf ein potenzielles leitfähiges Problem hin (d. H. Flüssigkeit in der Mittelohrhöhle) und sollte für junge Jungtiere in Betracht gezogen werden. Insgesamt erlauben die hier beschriebenen ABR-Methoden eine genaue und reproduzierbare Aufzeichnung der in-vivo-Hörfunktion bei Hühnerschlüpflingen, die auf verschiedene Entwicklungsstadien angewendet werden könnte. Solche Ergebnisse lassen sich leicht mit menschlichen und Säugetiermodellen von Hörverlust, Altern oder anderen auditiven Manipulationen vergleichen.
Die Untersuchung evozierter neuronaler Reaktionen auf Klangreize reicht über ein halbes Jahrhundertzurück 1. Die auditive Hirnstammreaktion (ABR) ist ein evoziertes Potenzial, das seit Jahrzehnten als Maß für die auditive Funktion sowohl bei nichtmenschlichen Tieren als auch bei Menschen verwendet wird. Die menschliche ABR weist fünf bis sieben Wellenformspitzen auf, die konventionell mit römischen Ziffern (I-VII)2 gekennzeichnet sind. Diese Peaks werden basierend auf ihrer Latenz (Zeitpunkt des Auftretens in Millisekunden) und Amplitude (Peak-to-Trog-Größe in Mikrovolt) der neuronalen Reaktionen analysiert. Die ABR ist maßgeblich an der Bewertung der Funktion und Integrität des Hörnervs sowie der Hirnstamm- und Hörschwellenempfindlichkeit beteiligt. Defizite im auditorischen System führen zu fehlenden, reduzierten, verlängerten oder abnormalen ABR-Latenzen und Amplituden. Bemerkenswerterweise sind diese Parameter bei Menschen und anderen Tieren nahezu identisch, was sie zu einem konsistenten objektiven Test der auditiven Funktion in allen Wirbeltiermodellen3 macht.
Ein solches Modellsystem ist das Huhn, und es ist besonders nützlich aus einer Vielzahl von Gründen. Vögel können als altricial oder precocial4 klassifiziert werden. Altricial Vögel schlüpfen mit Sinnen, die sich noch entwickeln; Zum Beispiel zeigen Schleiereulen erst vier Tage nach dem Schlüpfen5 eine konsistente ABR. Frühreife Tiere wie das Huhn schlüpfen mit fast reifen Sinnen. Der Beginn des Gehörs tritt in der Embryonalentwicklung auf, so dass Tage vor dem Schlüpfen (Embryonaltag 21) das auditorische System nahe der funktionellen Reifungsteht 6,7,8. Greifvögel und die meisten Säugetiermodelle sind anfällig für extrinsische Faktoren, die die Entwicklung beeinflussen und eine Tierhaltung erfordern, bis das Gehör reif ist. Hühner-ABRs können am selben Tag wie der Schlupf durchgeführt werden, ohne dass eine Fütterung oder eine angereicherte Umgebung erforderlich ist.
Das embryonale Huhn war ein gut untersuchtes Modell für Physiologie und Entwicklung, insbesondere im auditorischen Hirnstamm. Zu den spezifischen Strukturen gehören der Hähnchen-Cochlea-Kern, unterteilt in Nucleus magnocellularis (NM) und Nucleus angularis (NA), und das Vogelkorrelat der medialen oberen Olive, bekannt als Nucleus laminaris (NL) 6,7. Der ABR ist ideal, um sich auf die zentrale Hörfunktion vor der Ebene des Vorderhirns und des Kortex zu konzentrieren. Die Translation zwischen In-vivo-ABR-Messungen und in-vitro-neuronalen Studien der Entwicklung8, Physiologie9, Tonotopie 10 und Genetik11,12 bietet ideale Forschungsmöglichkeiten, die Studien der gesamten auditiven Funktion unterstützen.
Obwohl die ABR in Säugetiermodellen ausführlich untersucht wurde, gab es für Vögel weniger Fokus. Frühere Vogel-ABR-Studien umfassen Charakterisierungen des Wellensittichs 13, Specht14, Möwe15, Tauchvögel16, Zebrafink17, Tagignalgreifer18, Kanarienvogel19, drei Eulenarten 5,20,21,22 und Huhn 23. Angesichts der fast vier Jahrzehnte seit der letzten gründlichen Charakterisierung der Hühner-ABR haben sich viele der zuvor verwendeten Geräte und Techniken geändert. Erkenntnisse aus Studien in anderen Vogelmodellen können dazu beitragen, eine moderne Hühner-ABR-Methodik zu entwickeln und gleichzeitig als Vergleich mit der Hühner-ABR zu dienen. Dieses Papier wird den Versuchsaufbau und das experimentelle Design skizzieren, um die ABR-Aufzeichnung bei Junghühnern zu ermöglichen, die auch auf embryonale Entwicklungsstadien und andere kleine Nagetier- und Vogelmodelle angewendet werden könnten. Darüber hinaus können angesichts der frühreifen Entwicklung des Huhns Entwicklungsmanipulationen ohne extensive Tierhaltung durchgeführt werden. Manipulationen an einem sich entwickelnden Embryo können nur wenige Stunden nach dem Schlüpfen des Tieres mit nahezu reifen Hörfähigkeiten bewertet werden.
Der auditive Hirnstamm von Vögeln ist gut untersucht, und viele Strukturen sind analog zum Hörweg von Säugetieren. Der Hörnerv liefert erregende Inputs auf die beiden zentralen Kerne erster Ordnung, den Cochlea-Nucleus magnocellularis (NM) und die Angularis (NA). NM sendet bilateral eine exzitatorische Projektion an sein auditives Ziel, den Nucleus laminaris (NL)7. NL projiziert auf den Nucleus mesencephalicus lateralis, Pars dorsalis (MLd)40,41. NL projiziert auch auf den oberen Olivarkern (SON), der eine Rückkopplungshemmung für NM, NA und NL42 bietet. Dieser untere auditorische Hirnstamm-Mikroschaltkreis ist exquisit für die Funktion, die er erfüllt, die Schalllokalisation und das binaurale Hören33 konserviert. Die oberen auditiven Hirnstammregionen des Vogels haben auch Kerne, die analog zum lateralen Lemniscus des Säugetiers und zum Colliculus inferior im Mittelhirn sind. Aufgrund dieser Ähnlichkeiten ist die Zusammensetzung des Vogel-ABR bis zum auditorischen Mittelhirn bei allen Wirbeltieren vergleichbar.
Während mehrere Vogelarten drei positive Peaks innerhalb von 6 ms nach Stimulusbeginn aufweisen, weist die Korrelation von ABR-Peaks mit zentralen auditiven Strukturen eine gewisse Variabilität auf. Welle I kann vernünftigerweise als die erste neuronale Reaktion der peripheren basilalen Papille und des Hörnervs angesehen werden und zeigt eine geringe Variabilität zwischen Individuen (Abbildung 1C). Die nachfolgende Wellenidentifizierung ist weniger sicher und kann sich zwischen den Arten unterscheiden. Kuokkanen et al.17 haben kürzlich festgestellt, dass Welle III der ABR der Schleiereule von NL erzeugt wird; Daher ist es vernünftig zu argumentieren, dass Welle II von NM und NA des Cochlea-Nucleus20 stammt. Die Eulenwelle III wurde jedoch als der positive Peak definiert, der 3 ms nach Beginn des Reizes erzeugt wurde. Dies entspricht der Welle II, wie sie im ABR des Junghuhns definiert ist. In der Schleiereule ABR wurden die Wellen I und II kombiniert.
Während das Junghuhn in der Regel innerhalb von 6 ms drei Spitzen aufwies, wurde gelegentlich ein vierter Peak beobachtet (siehe z. B. Abbildung 1A). Bevölkerungsdaten, eine größere Stichprobengröße und zusätzliche experimentelle Paradigmen wären erforderlich, um eine vierte Welle und in einigen Fällen eine fünfwellige Hühner-ABR zu unterstützen. Das konsistenteste Ergebnis waren die drei hier gezeigten Spitzendarstellungen.
Da die ABR als Maß für die neuronale Synchronität definiert ist, könnten die Hauptkerne im Hörweg jeden positiv gehenden Peak in der ABR darstellen. Das Signal, das vom Hörnerv zu NM / NA und dann zu NL weitergeleitet wird, kann die Wellen I, II und III im ABR des Junghuhns definieren. Darüber hinaus könnte der später auftretende vierte Höhepunkt der Hühner-ABR eine obere Hirnstamm- oder Mittelhirn-Hörstruktur darstellen. Bei der Charakterisierung von Vogel-ABRs sollte auch der Unterschied zwischen frühreifen und altrischen Vögeln berücksichtigt werden. Die Reifung der auditiven Reaktionen variiert je nach Art und wird auch durch andere kritische Merkmale wie Raubtierverhalten und / oder Stimmlernenbeeinflusst 4. Unabhängig davon lassen sich die beschriebenen Methoden und Techniken leicht auf eine Vielzahl von Vogel- und Wirbeltierarten anwenden.
Die Bedeutung der Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei Tieren ist in Abbildung 2 dargestellt. Als die innere Körpertemperatur abnahm, stieg die Latenz der ABR-Reaktionen bei gleicher Reizintensität an. Dies ist ausgeprägter, wenn die Körpertemperatur unter 32 °C36,37 fällt. Der Latenzanstieg der ABR um etwa 1 ms ist geringer als zuvor beim Hühnchen23. Katayama 23 verwendete jedoch ein 12 Tage altes Jungtier, das gekühlt und anschließend über einen Zeitraum von 4 Stunden erwärmt wurde. Die Daten in Abbildung 2 wurden während des Abkühlvorgangs über einen Zeitraum von 20 Minuten aufgezeichnet. Um die beste Qualität und die konsistentesten Aufzeichnungen zu erhalten, muss die Körpertemperatur des Tieres aufrechterhalten werden, und alle Aufzeichnungen sollten bei der gleichen physiologischen Temperatur bei Tieren durchgeführt werden.
Der Einfluss des Alters auf die ABR ist gering, aber wichtig zu berücksichtigen. Während nur die Latenz der Wellen I und II der ABR signifikant unterschiedlich war, liegt dies zum Teil daran, dass in Abbildung 3 nur drei junge Jungtiere verwendet wurden; die anderen drei wiesen keine drei identifizierbaren ABR-Spitzen auf. ABR-Amplituden- und Schwellenwertverschiebungen können auch offensichtlich sein, wenn große Stichprobengrößen verwendet oder frequenzspezifische ABRs verglichen werden. Dieser altersbedingte Effekt könnte durch Flüssigkeit im Mittelohr des Huhns verursacht werden. Solche leitfähigen Veränderungen führen zu einem deutlichen Anstieg der ABR-Schwellenwerte sowohl für menschliche als auch für andere Säugetiermodelle38,39.
Unter Verwendung von zwei verschiedenen Aufzeichnungsmontagen wurden ähnliche Reaktionen beobachtet (Abbildung 4A). Während die häufigste Montage die Referenzelektrode hinter dem Reizempfängsohr platziert, kann die Referenzelektrode im Halsgewebe nützlich sein, wenn der ABR von einem chirurgischen Eingriff begleitet wird. Wenn jedoch zweikanalige ABR-Aufnahmen verwendet werden, sollten die Referenzelektroden separat und symmetrisch platziert werden, was schwierig ist, wenn die Referenzelektrode im Nacken platziert wird. Die Mastoidposition für die Referenzelektrode wird empfohlen, um so viele Aspekte der Aufzeichnung wie möglich zu standardisieren. Zweikanal-ABR-Aufzeichnung ist ein effektives Werkzeug, das wenig zusätzliche Vorbereitung erfordert und zu ähnlichen Reaktionen zwischen den Ohren führt. Geringfügige Amplitudenunterschiede waren wahrscheinlich auf die Positionierung des Kopfhörers zurückzuführen. Die Zweikanalaufzeichnung ermöglicht einen einfachen Vergleich zwischen einem experimentell manipulierten Ohr oder einer Gehirnhälfte und einer Kontrolle. Dieses Setup wäre auch für das Testen von binauralen ABRs erforderlich. Zukünftige Experimente mit dem Hühner-ABR können sich auf frühere Literatur zur Aufzeichnung von Konfigurationen und Montagenbeziehen 34.
Diese Methodik ist mit mehreren Einschränkungen verbunden. Wie in Schritt 5.1 erwähnt, kann eine schlechte Spekulumplatzierung zu einer Verschiebung um 40 dBSPL als Reaktion führen. Dies könnte zu einer falschen Interpretation eines manipulierten oder veränderten Tieres führen. Die folgenden Vorsichtsmaßnahmen werden empfohlen: Erfassen Sie eine große Stichprobe von Kontrolldaten, bevor Sie die ABRs von manipulierten oder mutierten Modellen erfassen. Verringern Sie die Stimulusintensität zwischen den Aufnahmen nicht um mehr als 20 dBSPL. Wenn sich die Amplitude oder Latenz stärker als erwartet verschiebt, überprüfen Sie die Tier- und Spekulumposition. Wiederholen Sie diesen ABR-Reiz, um Veränderungen zu beobachten. Wenn sich das Spekulum bewegt hat, erwerben Sie frühere Tests erneut. Eine weitere Einschränkung ist die Kalibrierung von ABRs. Ohne eine ordnungsgemäße Kalibrierung zur Aufzeichnung des Schalldruckpegels ist die dem Tier präsentierte Intensität unbekannt. Verwenden Sie bei der Messung der Klangausgabe das gleiche Spekulum wie bei experimentellen Aufnahmen und ein kleines Mikrofon in einem Hohlraum, der sich der Gehörgangslänge des Tieres (~ 5 mm) annähert. Messen Sie die gleichen Tonfrequenzen, die in Experimenten verwendet werden, da Kalibrierungen frequenzspezifisch sind. Das Handbuch für Hardware- und Softwaresysteme kann Anweisungen für die Kalibrierung enthalten. Es gibt auch zusätzliche Filter wie lineare Phasen- und Minimalphasenfilter, die Klick- und Toneburst-ABRs43 verbessern können. Diese Filter wurden in der vorliegenden Studie nicht verwendet. Zusätzliche Überlegungen, wie die Anstiegs- und Abfallzeit einer spektralen Tonexplosionshülle, die sich als Funktion der Frequenz ändert oder die Anstiegs- und Abfallzeit der Klickreize ändert, wurden ebenfalls nicht untersucht. Dies sind gute zukünftige Untersuchungen, sobald zuverlässige und konsistente ABRs erworben werden können.
Der Vergleich des Junghuhns mit anderen Vogelmodellen ist vielversprechend. Wellensittiche und Östliche Kreischeulen zeigen auch drei positive Mikrovoltspitzen innerhalb der ersten 6 ms des ABR13,22. Bei verschiedenen Spechtarten sind auch drei Spitzen zu sehen, aber ihre Latenz ist später in der Zeit. Darüber hinaus liegt der Bereich der besten Frequenzempfindlichkeit bei Spechten zwischen 1500 und 4000 Hz, was etwas höher ist als der beste Schwellenwert des Huhns bei 1000 Hz. Beim erwachsenen Huhn liegt die beste Empfindlichkeit bei 2000 Hz35, so dass das Hören hoher Frequenzen verbessert werden kann, wenn sich Hühnerschlüpflinge zu Erwachsenen entwickeln. Diese Entwicklung wird sich zwischen den Vogelarten unterscheiden, wobei die altriciale oder frühreife Entwicklung des Tieresberücksichtigt wird 4.
Die hier beschriebenen experimentellen Methoden können helfen zu bestimmen, welche Faktoren zu Nachteilen oder Veränderungen der auditiven Reaktionen und Schwellenwerte sowie zu Studien in verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung führen. Genetische Manipulation, Alterung und Lärmbelastung sind bekannte Manipulationen bei Tieren und anderen Vogelmodellen 24,25,44,45. Diese Methoden sollten auf das Hühnermodell ausgeweitet werden, da Techniken wie die In-Ovo-Elektroporation die Expression von Proteinen ermöglichen, die fokal und zeitlich auf einer Seite des auditorischen Hirnstammskontrolliert werden 12,46. Dies ermöglicht den direkten Vergleich von ABRs aus dem genetisch manipulierten Ohr mit dem kontralateralen Steuerohr unter Verwendung eines Zweikanal-Aufzeichnungsparadigmas.
Insgesamt ist die ABR von Junghühnern eine nützliche Forschungsmethode, die fast identisch mit Messungen der Hörfunktion in menschlichen und anderen Säugetiermodellen ist. Es ist auch eine nicht-invasive In-vivo-Methodik . Abgesehen von der anästhetischen Injektion und der subdermalen Elektrodenplatzierung von wenigen Millimetern ist keine weitere physikalische Manipulation erforderlich. Ein Jungtier könnte theoretisch mehrmals über einen Entwicklungszeitverlauf von Tagen oder Wochen getestet werden, wenn es in einer geeigneten Umgebung aufbewahrt wird. Dieses Protokoll legt nicht nur die notwendigen Schritte und Aufzeichnungsparameter für die ABR des Junghuhns fest, sondern schlägt auch Merkmale eines Vogel-ABR vor, die weitere Tests der auditiven Hirnstammfunktion beeinflussen können.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird unterstützt durch die NIH/NIDCD R01 DC017167
1/8 inch B&K Microphone | Brüel & Kjær | 4138 | Type 4138-A-015 also works |
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | M011110 | |
Custom Sound Isolation Chamber | GK Soundbooth Inc | N/A | Custom built |
DC Power Supply | CSI/Speco | PSV-5 | |
ER3 Insert Earphone | Intelligent Hearing Systems | M015302 | Used as sound transducer |
Euthasol | Virbac | 710101 | Controlled Substance; euthanasia solution |
Insulin Syringe (29 G) | Comfort Point | 26028 | |
Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | Controlled Substance |
Power Supply | Powervar | 93051-55R | |
Rectal Probe | YSI | 401 (10-09010) | Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor |
Subdermal needles | Rhythmlink | RLSND107-1.5 | |
Temperature Monitor | YSI | 73ATA 7651 | Works with any 400 series rectal probe |
Xylazine | Anased | 59399-110-20 | Used with ketamine and water for anesthetic |