Summary

Bewertung eines zuverlässigen Biomarkers in einem Stuhlligatur- und Punktions-induzierten Mausmodell der Sepsis

Published: December 09, 2022
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Summary

Dieses Protokoll stellt die operativen Details der Stuhlligatur und -punktion (CLP) in einem Mausmodell der Sepsis dar. CLP ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken, um ein Tiermodell für Sepsis zu erstellen. Daher ist ein standardisiertes CLP-Protokoll erforderlich, um zuverlässige Forschungsergebnisse zu erzielen.

Abstract

Sepsis ist eine schwere lebensbedrohliche und sich schnell entwickelnde Krankheit, die jährlich weltweit Millionen von Todesfällen verursacht. Forscher haben enorme Anstrengungen unternommen, um die Pathophysiologie der Sepsis anhand verschiedener Tiermodelle aufzuklären. Das Mausmodell der durch Cekalligatur und Punktion induzierten Sepsis (CLP) ist in Laboratorien weit verbreitet. Die drei technischen Aspekte, die den Schweregrad und die Replizierbarkeit des CLP-Modells beeinflussen, sind der Prozentsatz des gebundenen Blinddarms, die Größe der für die Stuhlpunktion verwendeten Nadel und das Volumen des in die Bauchhöhle gepressten Kots. Die schnelle und spezifische Diagnose einer Sepsis ist ein entscheidender Faktor, der das Ergebnis beeinflusst. Der Goldstandard für die Sepsis-Diagnose ist die mikrobielle Kultur; Dieser Prozess ist jedoch zeitaufwendig und manchmal ungenau. Der Nachweis von Sepsis-spezifischen Biomarkern ist schnell, aber die vorhandenen Biomarker sind aufgrund einer kurzen Halbwertszeit, Nicht-Spezifität und unzureichender Sensitivität unbefriedigend. Daher besteht ein dringender Bedarf an einem zuverlässigen Biomarker für Sepsis in den frühen Stadien. Frühere Publikationen deuten darauf hin, dass exzessive neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) bei Sepsis auftreten. Citrulliniertes Histon H3 (CitH3) als NET-Komponente ist sowohl bei septischen Tieren als auch bei Patienten erhöht, und das Vorhandensein von CitH3 ist ein zuverlässiger diagnostischer Biomarker für Sepsis. Die vorliegende Studie zielte darauf ab, ein standardisiertes Mausmodell der CLP-induzierten Sepsis zu beschreiben und einen zuverlässigen Blutbiomarker für Sepsis zu etablieren. Unsere Arbeit kann in Zukunft zur frühzeitigen und genauen Diagnose einer Sepsis beitragen.

Introduction

Sepsis ist definiert als lebensbedrohliche Organfunktionsstörung, die durch eine fehlregulierte Wirtsreaktion auf Infektionverursacht wird 1, und septischer Schock ist die häufigste Todesursache in schweren Fällen von Sepsis2. Sepsis und septischer Schock verursachen jedes Jahr weltweit Millionen von Todesfällen3. Der Schlüssel zur Verbesserung des Ergebnisses von Patienten mit Sepsis ist die sofortige Einleitung von Behandlungen wie Antibiotika4. Die Goldstandardmethode für die Diagnose von Sepsis ist die mikrobielle Kultur; Die mikrobielle Kultur ist jedoch zeitaufwendig und kann zu falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnissen führen, was die klinische Signifikanz stark einschränkt5. Daher ist es sehr wünschenswert, einen Blutbiomarker für Sepsis zu identifizieren. Procalcitonin gilt als idealer Sepsis-Biomarker, hat aber eine begrenzte diagnostische Wirksamkeit, da es Sepsis nicht von sterilen Erkrankungen unterscheiden kann6.

Die Ligatur und Punktion im Stuhl der Maus (CLP) wird häufig verwendet, um ein Modell der Sepsis in der wissenschaftlichen Forschung zu erstellen. CLP ist eines der am weitesten verbreiteten Sepsismodelle, da es die polymikrobielle Peritonitis nachahmt und sowohl entzündungsfördernde als auch entzündungshemmende Immunantworten aktiviert7. Es ist allgemein anerkannt, dass CLP ein klinisch relevanteres Sepsismodell schafft als alternative Techniken wie die Injektion von bakteriellem Endotoxin. Daher gilt CLP als das klassische Sepsis-Modell für den Einsatz in der Forschung8. Ein großer Nachteil von CLP ist jedoch seine Reproduzierbarkeit, da der Schweregrad des Modells von mehreren Faktoren wie dem Prozentsatz der Blinddarmligierung, der Nadelgröße, der Anzahl der Punktionen und der Laparotomietechnik beeinflusst wird. Daher ist es notwendig, das CLP-induzierte Sepsis-Modell zu standardisieren. Die vorliegende Studie beschreibt die Protokolldetails des CLP-induzierten Sepsismodells, um das standardisierte Verfahren aufzuzeigen und seine Reproduzierbarkeit zu erhöhen.

Die Entzündungsreaktion tritt im frühen Stadium der Sepsis auf, wobei Neutrophile übermäßige Mengen an Oxidationsmitteln und Proteasen freisetzen, die Organschäden verursachen8. Ein Schlüsselfaktor in der Pathophysiologie der Sepsis ist die Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs), die nukleäre und zytosolische Komponenten wie DNA, citrullinierte Histone und antimikrobielle Proteinasen freisetzen9. Neuere Studien deuten darauf hin, dass eine übermäßige Erzeugung von NETs die Pathologie der Sepsis vermittelt; In der Zwischenzeit übt eine Abnahme der NETs durch enzymatische Hemmung der Peptidylarginin-Deiminase (PAD) durch Chemikalien wie YW3-56 oder Cl-Amidin einen Pro-Überlebenseffekt in Mausmodellen der Sepsis10,11 aus. Citrulliniertes Histon H3 (CitH3) wurde 2011 als Sepsis-spezifisches Protein identifiziert12, und nachfolgende Publikationen haben gezeigt, dass die zirkulierende CitH3-Konzentration ein zuverlässiger diagnostischer Biomarker für Sepsis13,14 ist. CitH3 gilt als empfindlicherer und langlebigerer Biomarker als Procalcitonin und ist spezifischer bei der Unterscheidung von Sepsis als entzündliche Zytokine13.

In dieser Studie haben wir einen zuverlässigen diagnostischen Biomarker für Sepsis in einem CLP-induzierten Mausmodell der Sepsis evaluiert.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt, die vom Animal Review Committee am Xiangya Hospital und der Central South University (Nr. 202103149) genehmigt wurden. 1. Vorbereitung Wählen Sie männliche C57BL / 6J-Mäuse aus (Gewicht: 20-25 g; Alter: 8-12 Wochen) und halten Sie 3 Tage lang unter, bevor Sie irgendwelche Eingriffe durchführen. Wiegen Sie die Maus. Betäuben Sie die Maus mit 1,5% Isofluran durch Ei…

Representative Results

Wie in Abbildung 2A gezeigt, wurde in der Scheingruppe kein CitH3 durch Western Blotting nachgewiesen. Die Serumkonzentration von CitH3 stieg nach CLP signifikant an, und dieser Anstieg wurde durch die Hemmung der NET-Bildung durch die Verabreichung von YW3-56, einem pAVK-Inhibitor10, blockiert. Abbildung 2B zeigt die SerumCitH3-Konzentrationen, die durch ELISA bestimmt wurden. 24 h nach CLP war die Serumkonzentration von CitH3 i…

Discussion

CLP führt Krankheitserreger in den Bauch ein, um ein präklinisches Modell der Sepsis zu erstellen. Bei der Durchführung von CLP ist es wichtig, sterile Bedingungen zu verwenden, um die Interferenz exogener Bakterien zu beseitigen und genaue Dosierungen von Anästhetika zu verwenden16. Die drei technischen Aspekte von CLP, die den Schweregrad und die Replizierbarkeit des Sepsismodells beeinflussen, sind der Prozentsatz des gebundenen Blinddarms, die Größe der Nadel, die für die Stuhlpunktion …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Professor Wang Wei und Dr. Liu Shuai für die Hilfe bei den Experimenten. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Young Research Funding des Xiangya Hospital, Central South University (Nr. 2019Q10), der National and Science Foundation der Provinz Hunan (Nr. 2020JJ4902) und der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82202394) finanziert.

Materials

21G needle
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine  R&D Systems Inc DY999
anti-CitH3 monoclonal antibody laboratory self developed
anti-CitH3 polyclonal antibody Abcam ab5103
anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch 111-035-003
C57BL/6 mice Xiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidine Sigma Aldrich SML2250
depilatory cream
Dnase I Sigma Aldrich 11284932001
isoflurane Sigma-Aldrich 26675-46-7
ketoprofen Sigma Aldrich PHR1375
silk sutures (4-0 & 6-0)
surgical instruments 
YW3-56 GLPBIO GC48263

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Diesen Artikel zitieren
Yaozhen, L., Kemin, W., Xiaoyu, J., Yang, O., Hongying, T., Baihong, P. Evaluation of a Reliable Biomarker in a Cecal Ligation and Puncture-Induced Mouse Model of Sepsis. J. Vis. Exp. (190), e63584, doi:10.3791/63584 (2022).

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