Summary

Untersuchung der Wirkung von Pestiziden auf Caenorhabditis elegans Neuronen

Published: May 27, 2022
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Summary

Junge erwachsene Caenorhabditis elegans Nematoden sind 2-24 h lang unterschiedlichen Konzentrationen kommerzieller Pestizide oder anderer Giftstoffe ausgesetzt. Dann können verschiedene Neuronen mit fluoreszierenden exprimierenden Stämmen sichtbar gemacht werden. Dieses Papier zeigt, wie man Nematoden Pestiziden aussetzt und Neuronenschäden bewertet.

Abstract

Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiger Modellorganismus, der in vielen Forschungslabors verwendet wird, um die Folgen der Exposition gegenüber chemischen Schadstoffen, Pestiziden und einer Vielzahl von toxischen Substanzen zu verstehen. Diese Nematoden sind einfach zu bearbeiten und können verwendet werden, um neue Forschungsergebnisse zu generieren, sogar im Bachelor-Biologielabor. Eine mehrwöchige Laborreihe authentischer, studentischer Forschungsprojekte schult die Studierenden in einem Toolkit von Techniken und Ansätzen in Verhaltensmessungen, Zellbiologie und Mikroskopie, die sie dann auf ihre Projekte anwenden. Eine Technik in diesem Toolkit ist die Quantifizierung des Prozentsatzes von Neuronen, die neurodegenerative Schäden aufweisen, nachdem sie einem chemischen Giftstoff wie einem Pestizid ausgesetzt waren. Junge erwachsene C. elegans-Nematoden können 2-24 h lang unterschiedlichen Konzentrationen kommerziell erhältlicher Pestizide oder anderer Arten von Giftstoffen ausgesetzt sein . Dann können Studenten verschiedene Neuronensubtypen mit fluoreszierenden exprimierenden Stämmen von C. elegans visualisieren. Diese Techniken erfordern keine ausgeklügelte Bildverarbeitungssoftware und sind selbst bei geringen Vergrößerungen wirksam, so dass die Notwendigkeit einer teuren konfokalen Mikroskopie überflüssig wird. Dieses Papier zeigt, wie man die Nematoden mit Pestiziden behandelt und wie man die Neuronen abbildet und bewertet. Es bietet auch ein einfaches Protokoll für die Mikroskopie und Analyse der Neuronenmorphologie. Die für diese Technik verwendeten Materialien sind kostengünstig und in den meisten Biologieabteilungen des Grundstudiums leicht verfügbar. Diese Technik kann mit Verhaltensmaßnahmen wie Fortbewegung, basaler Verlangsamung oder Eiablage kombiniert werden, um eine potenziell veröffentlichungsfähige Reihe von Experimenten durchzuführen und Studenten eine authentische Forschungserfahrung zu sehr niedrigen Kosten zu bieten.

Introduction

Caenorhabditis elegans ist ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Laborausbildung in biologisch-naturwissenschaftlichen Kursen für Einsteiger und Mittelstufen. Dieses Laborverfahren kann als Teil eines mehrwöchigen Moduls verwendet werden, das verschiedene Auswirkungen häufig verwendeter Pestizide auf das Verhalten von C. elegans und die Zellbiologie untersucht. Die Studierenden können lernen, unabhängige Projekte zu entwerfen und durchzuführen, die ihnen Datenanalyse- und Präsentationsfähigkeiten vermitteln. Dieses Papier konzentriert sich auf die Protokolle zur Exposition von C. elegans gegenüber Pestizidmischungen und dann zur Beobachtung und Analyse der Auswirkungen auf die Neuronenmorphologie.

Rasenchemische Pestizidmischungen werden häufig für den privaten und landwirtschaftlichen Gebrauch verwendet und können in jedem örtlichen Gartengeschäft erworben werden. Es gibt zunehmende Besorgnis über die Sicherheit dieser Chemikalien für Mensch und Tier 1,2,3. Die Studierenden können die wissenschaftliche Literatur lesen und ein Pestizid für die experimentelle Bewertung auswählen und dabei grundlegende Biologie und Neurobiologie sowie wichtige Laborfähigkeiten wie experimentelles Design und Analyse und allgemeine Laborfähigkeiten wie Pipettieren und serielle Verdünnungen, Seziermikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, digitale Fotografie und Figurenproduktion erlernen.

Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle können in einem Mittelstufenkurs in Biologie oder Neurowissenschaften allein stehen oder Teil eines mehrwöchigen Moduls sein, das auch Messungen von Verhaltensweisen umfassen kann, die von bestimmten Gruppen von Neuronen gesteuert werden. In diesem Protokoll wird beispielsweise eine Beurteilung der Morphologie cholinerger Neuronen beschrieben, die die Fortbewegung unter Verwendung eines Nematodenstamms steuern, der GFP (LX 929) in cholinergen Neuronen4 exprimiert. Diese Stämme können zu sehr niedrigen Preisen vom Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/) bezogen werden. Stämme, die GFP in dopaminergen Neuronen (OH 7457), cholinerge Neuronen (LX 929) oder mCherry, die in allen Neuronen exprimiert werden (PVX4), exprimieren, sind alle eine gute Wahl. Die Schüler konnten auch die Fortbewegung messen und Daten erhalten, um die Beurteilung der Morphologie zu begleiten. Eine vollständige Beschreibung eines mehrwöchigen Studentengruppenprojekts finden Sie in Susman5.

Dieses Studentengruppenprojekt ist recht kostengünstig und für Gruppen von vier Studenten einfach einzurichten. Zu den benötigten Materialien gehören ein Seziermikroskop, der Zugang zu einem Fluoreszenzverbindungsmikroskop, das eine angeschlossene Digitalkamera haben kann, Petriplatten und Zugang zu Nematodenwachstumsagar, wachstumsbegrenzte Bakterien (Stamm OP50, aus dem CGC), ein Gasflammen-Bunsenbrenner oder eine Alkohollampe, ein Autoklav, Platindraht und allgemeines Labormaterial wie Mikropipetter, Objektträger, Deckgläser und Pasteur-Pipetten aus Glas. Abhängig von dem chemischen Giftstoff, der von den Studentengruppen untersucht wird, müssen die Schritte im Protokoll möglicherweise unter einem Abzug oder mit Handschuhen erfolgen. Dieses Protokoll verwendet chemische Gemische, die wasserlöslich (nicht flüchtig) sind, und alle vom Hersteller empfohlenen sicheren Handhabungsverfahren werden befolgt.

Protocol

Die gesamte Verwendung von wirbellosen Tieren erfolgte in Übereinstimmung mit den Tierpflege- und Verwendungsrichtlinien der Einrichtung. 1. Herstellung von pestizidbeschichteten Petriplatten Bereiten Sie Agar-Petrischalen (6 cm Durchmesser funktionieren am besten) mit Standardverfahren6 zu.HINWEIS: Diese können Monate im Voraus hergestellt und bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt werden. Bringen Sie die Platten auf Raumtemperatur…

Representative Results

Die in diesem Papier beschriebenen Methoden und Protokolle bieten wichtige Laborfähigkeiten für Studenten der Mittelstufe in Biologie oder Neurowissenschaften. Die Studierenden können wichtige Erfahrungen bei der Entwicklung eines unabhängigen Projekts und der Durchführung eines Experiments ihres eigenen Designs sammeln, das zu neuartigen Ergebnissen führen könnte. Abbildung 3 zeigt ein optimales Ergebnis eines Studentenprojekts, das schließlich Teil einer veröffentlichten Arbeit<su…

Discussion

Die in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle arbeiten erfolgreich allein oder im Rahmen eines mehrwöchigen unabhängigen Studentengruppenprojekts. Die Protokolle sind auch für eigenständige, einwöchige Erkundungserfahrungen zugänglich. Die Nematodenstämme sind günstig und im Forschungslabor pflegeleicht. Die Schüler können leicht lernen, wie man Würmer mit einem Wurmpick pflückt oder wie man sie bewegt, indem man Platten mit Wasser spült und ihnen erlaubt, sich durch Schwerkraft abzusetzen. Die Experimen…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die in diesem Manuskript beschriebene Arbeit wurde für eine Mittelstufe in Neurowissenschaften durchgeführt. Die Mittel für die Reagenzien und Vorräte wurden von der Biologieabteilung des Vassar College zur Verfügung gestellt. Die Mikroskope und das digitale Bildgebungssystem wurden auch von der Biologieabteilung des Vassar College zur Verfügung gestellt. Der Autor dankt all den vielen Studenten, die diesen Kurs besucht haben.

Materials

Agar Fisher Scientific BP97445
Agarose Fisher Scientific MP1AGAH0250
Alcohol lamp Fisher Scientific  17012826
Bunsen burner Fisher Scientific 17-012-820
C. elegans strains C. elegans Genetics Center
CaCl Fisher Scientific 10035-04-8
Cholesterol Fisher Scientific AAA1147030
Coverslips Fisher Scientific 12-545-AP
Digital camera Nikon These can vary depending on the requirement
Dissecting scope Nikon SMZ745
E. coli strain (OP50) C. elegans Genetics Center
Ethanol Fisher Scientific BP2818100
Fluorescent scope Nikon These can vary depending on the requirement
Imaging software Nikon These can vary depending on the requirement
Inoculation loop Fisher Scientific  131045
LB Broth Base Fisher Scientific BP9723-500
MgSO4 Fisher Scientific 10034-99-8
Microfuge tubes Fisher Scientific  05408129
Microscope slides Fisher Scientific 22-265446
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20A
Petri dishes Fisher Scientific AS4050
Pipette tips Fisher Scientific 94060316
Pipetters Fisher Scientific 14-386-319
Platinum wire Genesee Scientific 59-1M30P
Potassium Phosphate buffer Fisher Scientific AAJ61413AP
Sodium azide Fisher Scientific AC447810250

Referenzen

  1. Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
  2. Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
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Diesen Artikel zitieren
Raley-Susman, K. M. Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (183), e63845, doi:10.3791/63845 (2022).

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