Zeitaufgelöste In vivo Messung der Neuropeptiddynamik mittels kapazitiver Immunsonde im Schweineherzen

Mehrere chemische Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von Biomarkern werden routinemäßig sowohl in der Proteinchemie als auch in der klinischen Diagnostik eingesetzt, insbesondere bei der Krebsdiagnose und der Beurteilung des Fortschreitens von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Derzeit beruhen Methoden wie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), der enzymgebundene Immunsorbentien-Assay (ELISA) und die Massenspektrometrie auf der Probenentnahme aus dem Gefäßkompartiment ^1,2,3 durch Bulk-Flüssigkeitsentnahme oder dem interstitiellen Kompartiment durch Mikrodialyse. Die Mikrodialyse verwendet einen semipermeablen Membranschlauch bekannter Länge, der in einer Region von Interesse platziert wird. Die Sammelflüssigkeit wird über mehrere Minuten⁴ durch das Röhrchen geleitet, um die Probe für die Analyse⁵ zu sammeln, wodurch die zeitliche Auflösung begrenzt wird. Auf diese Weise liefern die entnommenen Proben nur einen gemittelten Wert über die Zeit der lokalen Mikroumgebung und sind durch die Perfusionsrate und die Sammlung eines ausreichenden Probenvolumens begrenzt. Darüber hinaus erfordern diese Methoden die Bündelung experimenteller Daten und die Mittelung von Signalen; Daher können sie die Variabilität zwischen den Subjekten nicht berücksichtigen. Wichtig ist, dass die Zeit zwischen der Probenentnahme und der anschließenden Offline-Analyse ein sofortiges klinisches Eingreifen und Therapeutika ausschließt.

Im vorliegenden Protokoll wird die Verwendung eines kapazitiven Immunsonden-Biosensors (CI-Sonde) zur zeitaufgelösten elektrischen Detektion spezifischer bioaktiver Peptide skizziert. Neuropeptid Y (NPY), das aus postganglionären sympathischen Neuronen freigesetzt wird, die das Gefäßsystem, das Endokard, die Kardiomyozyten und die intrakardialen Ganglien innervieren, ist ein wichtiger neuromodulatorischer Peptidtransmitter im Herz-Kreislauf-System 6,7,8,9. Die hier vorgestellte Methode wurde entwickelt, um NPY zu messen, und die experimentelle Machbarkeit wird in einem Schweineherzmodell demonstriert. Dieser Ansatz gilt jedoch für jedes bioaktive Peptid, für das ein selektiver Antikörper verfügbar ist¹⁰. Diese Methode beruht auf dem kapazitiven Übergang zwischen einer Platindrahtsonde und der leitfähigen Flüssigkeit an der funktionalisierten Spitze^11,12. In dieser Anwendung wurde die Wechselwirkung durch einen Antikörper gegen das Zielneuropeptid (NPY) vermittelt, das an die Elektrodenspitze gebunden war und die leitfähige Flüssigkeitsumgebung anschloss. Diese Funktionalisierung wurde durch die galvanische Abscheidung von reaktivem Polydopamin auf die Spitze der Platindrahtsonde^10,13 erreicht.

Wenn die antikörperfunktionalisierte Sonde in einer Region von Interesse in vivo platziert wird, führt die evozierte endogene NPY-Freisetzung zu einer Bindung an die einfangenden Antikörper auf der Sondenspitze, und die leitfähige Flüssigkeit an der Elektrodenoberfläche wird durch das NPY-Protein verdrängt. Lokale Veränderungen in der elektrischen Umgebung führen zur Verdrängung von hochbeweglichen, hochdielektrischen Flüssigkeiten mit einem unbeweglichen, statisch geladenen Molekül. Dies verändert die Elektroden-Fluid-Grenzfläche und damit ihre Kapazität, die als Änderung des Ladungsstroms als Reaktion auf ein Schritt-Funktions-Befehlspotential gemessen wird. Ein negatives "Reset"-Potential wird unmittelbar nach jedem einzelnen Messzyklus eingesetzt, um gebundenen NPY durch elektrostatische Wechselwirkung aus dem Antikörper abzustoßen und so die Antikörperbindungsstellen für nachfolgende Messrunden^{zu räumen 10}. Dies ermöglicht effektiv die zeitaufgelöste Messung von NPY. Die einzigartige CI-Technik überwindet die oben beschriebenen Einschränkungen der mikrodialysebasierten immunchemischen Methoden, um dynamische Biomarkerspiegel aus einem einzigen Experiment ohne Datenpooling oder Signalmittelung über mehrere Experimente zu messen⁹ und liefert Daten in nahezu Echtzeit. Darüber hinaus bietet die Fähigkeit, diese Methode an jeden Biomarker von Interesse anzupassen, für den ein geeigneter Antikörper auf einer zeitaufgelösten und lokalisierten Skala existiert, einen großen technischen Fortschritt in der immunchemischen Messung zur Bewertung des Krankheitsverlaufs und zur Anleitung therapeutischer Interventionen.

Die Software zur Datenerfassung und -analyse wurde in IGOR Pro (einer vollständig interaktiven Softwareumgebung) speziell geschrieben. Ein Analog-Digital-Wandlersystem (A/D) gab eine Befehlsspannung unter Computersteuerung aus und erfasste Daten von einem benutzerdefinierten Verstärker. Der Verstärker besaß bestimmte einzigartige Eigenschaften. Dazu gehörte ein Rückkopplungswiderstand (umschaltbar) für jeden der vier Erfassungskanäle, so dass 1 MOhm oder 10 MOhm Rückkopplungsspannungsklemmschaltungen gewählt werden konnten, um die Variabilität der Elektrode zu integrieren. Eine Bühneneinheit mit einem einzigen Kopf und einer gegenseitigen Masse / Referenzschaltung für alle vier Erfassungskanäle wurde ebenfalls gebaut, um das Gerät in der Nähe der Truhe in einem einzigen physischen Modul zu platzieren. Eine 1 MOhm Feedback-Widerstandseinstellung wurde verwendet, um alle gemeldeten Daten zu sammeln.

Die Filter- und Verstärkungseinstellungen wurden vom Verstärker telegrafiert und in der Datendatei aufgezeichnet. Die Daten wurden mit 1 kHz über einen 2-poligen analogen Bessel-Filter gefiltert, der mit 10 kHz digitalisiert wurde. Durch die Potentialdifferenz zwischen der Sonde und der umgebenden leitfähigen Lösung entsteht eine kapazitive Helmholtz-Schicht an der Sondenspitze. Die Ligandenbindung an den Antikörper an der Sondenspitze führt zu einer veränderten lokalen Ladung und damit zu einer Änderung der Helmholtz-Kapazität. Diese Änderung der kapazitiven Komponente der Schaltung führt zu einer Verschiebung der Größenordnung der eingespeisten Ladung, die erforderlich ist, um die Sonde auf das Potential im Stufenfunktionsspannungsprotokoll zu bringen. Somit führt die Bindung eines bestimmten Liganden an die funktionalisierte Sonde zu einer Veränderung der Elektrodenkapazitätsmessung als Änderung des kapazitiven Spitzenstroms.

Alle Tierversuche wurden vom Animal Research Committee der University of California, Los Angeles, genehmigt und gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8. Auflage, 2011) durchgeführt. Erwachsene männliche Yorkshire-Schweine von etwa 75 kg wurden für In-vivo-Studien ^{verwendet 10}.

1. Kapazitive Immunsondenherstellung und -funktionalisierung

1. Schneiden Sie einen 25 cm langen perfluoralkoxybeschichteten (PFA)-beschichteten Platindraht (siehe Materialtabelle) und streifen Sie etwa 5 mm PFA-Beschichtung von einem Ende mit einem Skalpell ab, wobei Sie darauf achten sollten, nicht in den Platindraht zu schneiden.
2. Setzen Sie das abisolierte Ende des Platindrahtes in einen vergoldeten 1-mm-Steckerstift ein und crimpen Sie die Anschlussstiftzähne mit einer Nadelzange um das abisolierte Ende des Platindrahtes (siehe Materialtabelle).
3. Löten Sie den Platindraht an den vergoldeten Anschlussstift. Achten Sie darauf, keine übermäßige Menge an Lot zu verwenden.
4. Dopaminlösung herstellen, indem 50 mg Dopamin HCl in 50 ml 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 6,0) durch Rühren gelöst werden.
5. Sobald das Dopamin vollständig aufgelöst ist, legen Sie die Spitze des Platindrahtes in das Gefäß, das das frisch hergestellte Dopamin-ergänzte PBS enthält. Stecken Sie einen goldenen Steckerstift in einen Kanal der Kopfstufe (siehe Materialtabelle).
6. Schließen Sie die AgCl-Scheibenelektrode (Masseelektrode, siehe Materialtabelle) an den Erdungskanal in der Kopfstufe an. Legen Sie die AgCl-Scheibe in das Gefäß, das Dopamin-ergänztes PBS und Platindraht enthält; Achten Sie darauf, nur die Scheibenelektrode und nicht irgendeine Länge des Drahtes oder Löts einzutauchen. Schließen Sie einen Draht-Shunt an die Referenzkanäle der Kopfstufe an, bevor Sie fortfahren.
7. Öffnen Sie die interaktive Datenerfassungssoftware (siehe Materialverzeichnis). Bereiten Sie ein Sawtooth-Elektrodepositions-Befehlspotentialprotokoll mit den folgenden Parametern vor: Startpotential = −0,6 V; Endpotential = +0,65 V; Abtastrate = 0,04 V∙^s-1; Ablagedauer = 420 s. Beginnen Sie mit dem Polydopamin-Abscheidungsprotokoll und stellen Sie sicher, dass alle Drähte ordnungsgemäß angeschlossen sind.
8. Entfernen Sie nach Abschluss der Polydopaminabscheidung das AgCl-gemahlene Pellet und die Spitze des Platindrahts aus dem Behälter und achten Sie darauf, die Spitze der Platindrahtelektrode nicht zu stören. Legen Sie die Spitze des Drahtes für 2-5 Minuten in ein Mikroröhrchen, das PBS (pH 7,4) enthält, während die Antikörperlösung hergestellt wird; Stellen Sie sicher, dass die Drahtspitze die Seiten oder den Boden des Mikroröhrchens nicht berührt.
   HINWEIS: Antikörperlösung kann während der Polydopaminabscheidung hergestellt werden; Der Transfer des Platindrahtes aus dem dopaminhaltigen Gefäß in das Mikroröhrchen von PBS nach Polydopaminabscheidung sollte jedoch nicht übersprungen werden.
9. Bereiten Sie die Antikörperlösung vor. Kombinieren Sie den interessierenden Antikörper mit PBS (pH 7,4) im Verhältnis 1:20 in einem Gefäß geeigneter Größe (z. B. einem Mikroröhrchen).
   HINWEIS: Der hier verwendete monoklonale Anti-NPY-Antikörper (siehe Materialtabelle) wurde mit 1 mg/ml alizitiert; Ein Beispiel für eine Antikörperpräparation wäre hier 4 μL Antikörper gegen 76 μL PBS.
10. Die Polydopamin-abgeschiedene Spitze der Platinelektrode in Antikörperlösung für mindestens 2 h bei Raumtemperatur einweichen, um sicherzustellen, dass die Platindrahtspitze in Lösung suspendiert ist und nicht auf der Innenseite des Mikroröhrchens ruht.
    HINWEIS: Bei der jüngsten Implementierung dieser Technik wurde die Verwendung der Platindrahtelektrode unmittelbar nach diesem Schritt anstelle einer nassen oder trockenen Lagerung für die spätere Verwendung bevorzugt.
11. Nach dem Einweichen in der Antikörperlösung die neu funktionalisierte kapazitive Immunsondenspitze (CI-Sonde) kurz in PBS (pH 7,4) abspülen. Die Sonde ist nun einsatzbereit.

2. Versuchsaufbau zum In-vitro-Nachweis und zur Messung von Peptiden

1. Legen Sie die Funktionsspitze der CI-Sonde in die Durchflusskammer und achten Sie darauf, die Spitze der Elektrode in keiner Weise zu stören, da dies die sensorische Spitze der Sonde beschädigen kann.
   HINWEIS: Die Durchflusskammer wurde durch Gießen von Silikonelastomer (siehe Materialtabelle) in eine 35-mm-Kulturschale mit einem länglichen eiförmigen Raumfüller in der Mitte der Schale erzeugt. Nach dem Aushärten wird die eiförmige Form aus dem Elastomer entfernt. Die Kammer wird dann mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) aufgefüllt und ermöglicht eine Durchflussrate von 3 ml / min. Stellen Sie sicher, dass der Zu- und Abfluss den Flüssigkeitsstand in der Kammer so aufrechterhält, dass keine Gezeitenwirkung des Superfusats beobachtet wird. Der Durchfluss muss so lange an Ort und Stelle bleiben, wie die CI-Sonde verwendet wird.
2. Führen Sie vor dem ersten experimentellen Test einen TBS-Standardlauf durch, um die CI-Sonde zu konditionieren. Richten Sie das folgende Befehlsspannungsprotokoll ein: positives Schrittpotential = +100 mV; negatives Schrittpotential = −5 mV; Schrittdauer = 20 ms; Anschaffungsdauer = 600 s.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Gleichgewichtung der Sonde während der Anfangsphase des zyklischen Befehlspotentials vor der Datenerfassung zu berücksichtigen.
3. Erstellen Sie eine Lösung des interessierenden Peptids unter Verwendung derselben TBS, um die Zusammensetzung des Superfusats aufrechtzuerhalten. Richten Sie ein Verteilersystem ein, bei dem das Superfusat zwischen TBS und peptidergänztem TBS umgeschaltet werden kann, ohne Blasen in das Schlauchsystem oder die Durchflusskammer einzuführen.
   HINWEIS: Synthetisches porcines NPY-Peptid (siehe Materialtabelle) wurde in der vorliegenden Studie verwendet.
4. Richten Sie das Peptid-Sensing-Datenerfassungsprotokoll mit TBS-Standardparametern ein (siehe Schritt 2.2.).
   HINWEIS: In dieser Implementierung betrug die Dauer jedes experimentellen Tests 360 s (120 s TBS, 120 s peptid-supplementierte TBS, 120 s TBS).

3. Anpassung der CI-Sonde für den In-vivo-Einsatz

1. Vor der Polydopaminabscheidung (Schritt 1.7) fädeln Sie die freiliegende Spitze der Platindrahtelektrode durch eine 22 G Injektionsnadel, wobei etwa 2 mm über die Nadelspitze hinaus verbleiben. Biegen Sie mit einer Pinzette die Spitze der Platindrahtelektrode vorsichtig zurück, wodurch ein "Widerhaken" entsteht, der am Ende der Injektionsnadel hängt.
   1. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig von der Stachelspitze ab, und lassen Sie genügend Draht übrig, um ihn in den Behälter zu legen, ohne dass die Nadel die Flüssigkeit berührt. Fahren Sie mit den Schritten 1.4.-1.11 fort.
      HINWEIS: Je nach In-vivo-Setup kann es notwendig sein, eine Länge des Platindrahtes länger als 25 cm zu schneiden.
2. Bevor Sie die CI-Sonde an die Kopfstufe anschließen, stellen Sie sicher, dass die gesamte elektrische Einrichtung ordnungsgemäß geerdet ist. Andernfalls kann es zu unerwünschten elektrischen Störungen während der experimentellen Aufnahmen kommen.
3. Anästhesieren Sie die Tiere nach einem zuvor veröffentlichten Bericht¹⁰.
4. Führen Sie eine Operation durch, um die Region von Interesse freizulegen.
   HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde eine mediane Sternotomie durchgeführt, um das Herz freizulegen. Bitte lesen Sie Kluge et ^al.10 für Details zur Tierchirurgie.
5. Entfernen Sie vorsichtig die funktionalisierte Spitze von der PBS-Spülung (Schritt 1.11), leiten Sie die hydodermische Nadel zur mit Widerhaken versehenen C.I.-Sonde und implantieren Sie sie vorsichtig in den interessierenden Bereich, bevor Sie den goldenen Steckerstift in die Kopfstufe stecken. Ziehen Sie nach der Implantation die Injektionsnadel zurück und lassen Sie die Elektrode an Ort und Stelle.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde die Sonde in der mittleren Seitenwand des linksventrikulären Myokards¹⁰ platziert.
6. Nachdem Sie eine ordnungsgemäße elektrische Einrichtung sichergestellt haben, fahren Sie mit Standard- und experimentellen Testprotokollen fort (Schritt 2.2. und Schritt 2.4.).
7. Nach Abschluss der Experimente euthanasieren Sie das Tier nach institutionell zugelassenen Techniken.
   HINWEIS: In der vorliegenden Studie werden die Tiere unter Tiefenbetäubung durch Induktion von Kammerflimmern eingeschläfert¹⁰.

Herstellung und Charakterisierung von Elektroden
Eine flexible kapazitive Immunsonde (CI-Sonden) wurde hergestellt, und ein repräsentatives Bild ist in Abbildung 1A dargestellt. Das Elektrodenpotential wurde durch eine computergesteuerte Spannungsklemmschaltung eingestellt (Abbildung 1B), und die Elektrode wurde in eine Polydopaminlösung aus PBS eingetaucht. Polydopamin wurde zur Funktionalisierung auf die leitfähige Elektrodenspitze13 galvanisch abgeschieden. Das Befehlspotential trieb die Sondenspannung an, und die Klemmstromeinspeisung wurde gemessen. Der gemessene Klemmstrom während eines einzelnen Zyklus der Polydopaminabscheidung ist in Abbildung 1C dargestellt. Unmittelbar nach der Polydopaminabscheidung wurde die beschichtete Elektrodenspitze in einer interessierenden Antikörperlösung getränkt (Abbildung 2A). Alle Elektroden wurden unmittelbar nach diesen Schritten verwendet.

In-vitro-Messung von NPY
Die antikörperfunktionalisierte Sonde wurde in einer Durchflusskammer platziert und von der Spannungsklemmschaltung mit einem Beispielbefehlspotential angetrieben, und der aufgezeichnete Strom ist dargestellt (Abbildung 2B,C). In-vitro-Aufnahmen wurden in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS, pH 7,4) durchgeführt. Die Schrittfunktionswellenform besteht aus einem positiven Schrittpotential (oberer blauer Teil, Abbildung 2B) und einem negativen "Reset"-Potential (unterer roter Teil, Abbildung 2B). Der Bereich dieses Befehlspotentials misst effektiv die Bindung und ruft eine nachfolgende Abstoßung von Peptiden hervor, ohne die Sondenempfindlichkeitzu beeinträchtigen 10. Nach der Herstellung wurde jede Sonde für die anfängliche Konditionierung unter dem Befehlspotentialprotokoll getestet. Es ist zu beachten, dass die Sonden, die das stabilste und reproduzierbarste anfängliche Konditionierungsprofil zurückgaben, definiert als ein kleinerer anfänglicher Zerfall, gefolgt von einer stabilen Baseline (Abbildung 2D), die reproduzierbarsten Messungen in vitro und in vivo ergaben. Daher stellt die Messung der anfänglichen Stabilisierung der CI-Sonden einen wichtigen Qualitätskontrollpunkt zur Bestimmung der Sondeneignung dar.

Beurteilung der Elektrodenempfindlichkeit und -stabilität in vitro
Kapazitive Immunsonden wurden in einer Durchflusskammer platziert und mit TBS superfundiert, ergänzt um bekannte Konzentrationen von Neuropeptid Y (NPY, 5-150 pM). Kapazitive Ströme, gemessen als Spitzenamplitude der +100 mV Depolarisation, wurden gegen die Zeit aufgetragen. Der Durchfluss von NPY in die Durchflusskammer erhöhte die kapazitiven Ströme gegenüber dem Ausgangswert (60 pM NPY, Abbildung 2E). Eine Demonstration des dosisabhängigen Strom-Ansprechens für 5 pM und 75 pM NPY ist in Abbildung 3A dargestellt, und eine Standardkurve, die unter allen getesteten Konzentrationen gemessen wurde, ist in Abbildung 3B dargestellt. Die Datenpunkte in Abbildung 3B wurden zu Kalibrierungszwecken an eine einzelne exponentielle Anpassung angepasst.

In-vivo-Bewertung von Neuropeptid-Freisetzungsprofilen mit CI-Sonde
Diese Methodik wurde auf ein Schweineherzpräparat angewendet, um seine Eignung für die biologische Anwendung zu beurteilen, wie in den vorherigen Publikationen10 beschrieben. Kurz gesagt, eine CI-Elektrode wurde durch eine 22-G-Injektionsnadel gefädelt und leicht nach hinten gebogen, um einen Widerhaken zu erzeugen (Abbildung 4A). Die Nadel und die Widerhakenelektrode wurden in das linksventrikuläre Myokard eines schlagenden Schweineherzens eingeführt. Die hypodermische Leitnadel wurde dann aus der Elektrode zurückgezogen und beließ sie im Myokard. Interstitielle NPY wurde vor und als Reaktion auf 60 s bilaterale stellate Ganglienstimulation gemessen (siehe Kluge et al.10 für eine vollständige Beschreibung der Simulationsschritte). Eine zweite Negativkontrollelektrode ohne Antikörperfunktionalisierung wurde neben der NPY-Sonde platziert. Die erhaltenen kapazitiven Immunosonden-Klemmströme wurden gegen die In-vitro-Kalibrierkurve angepasst, um zeitlich aufgelöste, evozierte Änderungen der NPY-Konzentrationen in der kardialen Mikroumgebung zu erzielen. Erhöhte NPY wurde während der Stimulation des bilateralen stellaten Ganglions beobachtet und mit den negativen Kontroll-C.I-Strömen assoziiert (Abbildung 4B, oberes Diagramm). Parallel dazu wurden auch interstitielle Noradrenalinspiegel (NE) durch schnelle zyklische Voltammetrie (FSCV) gemessen, eine Technik, die zuvor zur Beurteilung der Freisetzung von Katecholamin aus isolierten Zellen 14,15, isolierten Geweben 16,17,18 und in der Schweineherzvorbereitung 19 verwendet wurde. Noradrenalin ist ein sympathischer Neurotransmitter, der unter stellater Stimulation mitfreigesetzt wird (Abbildung 4B, unterer Plot) und zeigt eine synchrone Freisetzung mit NPY, die mit einer evozierten sympathischen Reaktion übereinstimmt. Diese Daten zeigen, dass der CI-Ansatz gleichzeitig mit anderen Biomarker-Detektionsmethoden verwendet werden kann, um interstitielle Mikroumgebungen mit hoher zeitlicher Genauigkeit zu bewerten. Kurz gesagt, eine Sensorelektrode wird in das Myokard neben der CI-Sonde implantiert. Das Elektrodenpotential wird durch die Oxidations-/Reduktionspotentiale des Transmitters durch eine Spannungsklemmschaltung angetrieben. Wenn also das Elektrodenpotential positiv zum Oxidationspotential für NE wird, wird das NE zu einem Chinonderivat oxidiert. Elektronen werden durch die Oxidationsreaktion erzeugt, gemessen als Kompensationsstrom in der spannungsgeklemmten Elektrode, wodurch ein Index der lokalen NE-Freisetzung bereitgestellt wird. Das Zurückschalten des Elektrodenpotentials auf eine negative Polarisation verringert das Chinonprodukt, um das Katecholamin20 zu regenerieren.

Abbildung 1: Herstellung der CI-Sonde aus Platindraht. (A) Zur Herstellung jeder CI-Sonde wurde ein PFA-beschichteter Platindraht (25 cm lang und 127 μm Durchmesser) verwendet. Von einem Ende des Drahtes wurden ca. 5 mm PFA-Beschichtung abisoliert, die dann auf einen vergoldeten Steckerstift (Maßstabsleiste = 3 cm) gelötet wurden. (B) Es wird eine Darstellung der Spannungsklemmschaltung gezeigt, die zum Anlegen des Befehlspotentials verwendet wird. (C, links) Die sensorische Spitze der Elektrode wurde in eine Tube getaucht, die PBS enthielt, ergänzt mit 5 mM Dopamin. (C, rechts) Polydopamin wurde elektrisch auf der Sinnesspitze abgeschieden. Die galvanische Abscheidung erfolgte unter Verwendung einer Sägezahnwellenform mit folgenden Parametern: −0,6 V bis +0,65 V bei einer Abtastrate von 0,04 V∙s-1. Das Befehlspotential (oben) und der resultierende Strom (unten) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: In-vitro-Messung von NPY mit der CI-Sonde. (A) Ein polydopaminfunktionalisierter Draht wurde 2 h lang in PBS eingetaucht, ergänzt mit einem Anti-NPY-Antikörper. Dadurch konnte der Antikörper an der Sondenspitze kovalent an die Polydopaminoberfläche binden. (B) Das Spannungsbefehlspotential wird angezeigt. Ein positiver Schritt im Befehlspotential dient zur Messung des Einspritzstroms, der zur Klemmung der Sondenspannung benötigt wird (blau) und ermöglicht die Messung des kapazitiven Stroms. Der negative Befehlspotentialschritt (Resetpotential) löscht das gebundene Peptid durch elektrostatische Abstoßung (rot) vom Antikörper. (C) Die Schrittfunktionsbefehlswellenform (obere Leiterbahn; +100 mV Messphase auf −5 mV Resetphase, jeweils 20 ms Dauer) ermöglicht eine zeitaufgelöste, iterative Detektion und Quantifizierung des Peptids. Das Befehlspotential und die daraus resultierende Stromaufzeichnung unter Überfusion der Sonde mit TBS wird angezeigt (untere Spur). (D) Es wird das Gleichgewicht einer CI-Sonde über einen Zeitraum von 6 min gezeigt (siehe Schritt 2.2.). (E) Der von der NPY-funktionalisierten C.I.-Sonde gemessene kapazitive Spitzenstrom wird angezeigt. Die CI-Sonde wurde zuerst mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, dann mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, ergänzt mit 60 pM NPY, und dann mit einer NPY-freien Tris-gepufferten Kochsalzwäsche versehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: In-vitro-Kalibrierung der CI-Sonde . (A) Kapazitive Immunsondenströme wurden mit einer NPY-Antikörper-funktionalisierten Sonde gemessen, die mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung überffundiert wurde. Das Superfusat wurde auf 5 pM (rot) und 75 pM (schwarz) NPY umgestellt. Diese Aufzeichnungen stellen ein konzentrationsabhängiges Signal dar, das für einen niedrigen Picomol-NPY empfindlich ist. (B) Kapazitive Immunsonden, die mit dem NPY-Antikörper funktionalisiert wurden, wurden auf Dosis-Wirkungs-Empfindlichkeit getestet. Die Aufnahmen wurden unter Überfusion mit TBS durchgeführt; dann TBS ergänzt mit NPY (in pM): 1, 5, 15, 25, 60, 75 und 150, und dann in einer NPY-freien TBS-Wäsche. Kapazitive Spitzenstromwerte (C.I. Current) wurden in einem stationären Zustand in jeder NPY-Konzentration gemessen und gegen die NPY-Konzentration aufgetragen. Die Dosis-Wirkungs-Daten wurden angepasst, um eine Standardkurve für die Kalibrierung der experimentellen Daten zu liefern (angepasst an Kluge et al.10). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Differentielle Freisetzung von NPY und NE durch bilaterale Sternstimulation. (A) Es wird eine CI-Sonde mit einem Stachelende für den In-vivo-Einsatz gezeigt (Maßstabsleiste = 3 mm). Die Sonde wird durch eine 22 G Injektionsnadel gefädelt und wie in Schritt 1 erwähnt vorbereitet. und Schritt 2. Vor dem Einsetzen des Sensors wird die Sondenspitze gebogen, um einen Widerhaken zu erzeugen, und die Nadel wird beim Einführen in das Myokard zurückgezogen, wodurch eine Stachelsonde in der Myokardwand des linken Ventrikels verankert bleibt. (B) Eine Sonde, die mit einem Anti-NPY-Antikörper funktionalisiert war, wurde in das linksventrikuläre Myokard eingeführt. Eine identische Sonde ohne Antikörperfunktionalisierung (ø mAb) wurde unmittelbar nebenan eingeführt und diente als Negativkontrolle. CI-Ströme wurden als Reaktion auf die bilaterale Sternstimulation bei 10 Hz (BSG, 4 ms Pulsbreite, 2x Schwelle) bestimmt. Die resultierenden Ströme wurden gegen die Standardkurve kalibriert (Abbildung 3B) und aufgetragen (oberes Diagramm). Die Noradrenalinfreisetzung an der gleichen interstitiellen Stelle wurde mittels schnell scannender zyklischer Voltammetrie (unterer Plot) gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte, weder finanziell noch anderweitig.