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Methodenartikel

Zeitaufgelöste In vivo Messung der Neuropeptiddynamik mittels kapazitiver Immunsonde im Schweineherzen

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DOI:

10.3791/63926

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19. Mai 2022

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1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2University of California Los Angeles (UCLA) Cardiac Arrhythmia Center, David Geffen School of Medicine, 3UCLA Neurocardiology Research Program of Excellence, UCLA

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Etablierte immunchemische Methoden zur Messung von Peptidtransmittern in vivo beruhen auf Mikrodialyse oder Bulk-Fluid-Draw, um die Probe für die Offline-Analyse zu erhalten. Diese leiden jedoch unter raumzeitlichen Einschränkungen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung und Anwendung eines kapazitiven Immunsonden-Biosensors, der die Grenzen der bestehenden Techniken überwindet.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, Biomarker in vivo zu messen, die für die Beurteilung des Krankheitsverlaufs relevant sind, ist für die wissenschaftliche und medizinische Gemeinschaft von großem Interesse. Die Auflösung der Ergebnisse, die mit den derzeitigen Methoden zur Messung bestimmter Biomarker erzielt werden, kann mehrere Tage oder Wochen dauern, da sie sowohl räumlich als auch zeitlich in ihrer Auflösung begrenzt sein können (z. B. Flüssigkeitskompartimentmikrodialyse der interstitiellen Flüssigkeit, die durch enzymgebundenen Immunsorbensassay [ELISA], Hochleistungsflüssigkeitschromatographie [HPLC] oder Massenspektrometrie analysiert wird); Daher ist ihre Anleitung zur rechtzeitigen Diagnose und Behandlung gestört. In der vorliegenden Studie wird über eine einzigartige Technik zum Nachweis und zur Messung von Peptidtransmittern in vivo durch den Einsatz eines kapazitiven Immunsonden-Biosensors (CI-Sonde) berichtet. Das Herstellungsprotokoll und die In-vitro-Charakterisierung dieser Sonden werden beschrieben. Es werden Messungen der sympathischen Stimulations-evozierten Neuropeptid-Y-Freisetzung (NPY) in vivo durchgeführt. Die NPY-Freisetzung korreliert mit der sympathischen Freisetzung von Noradrenalin als Referenz. Die Daten zeigen einen Ansatz zur schnellen und lokalisierten Messung von Neuropeptiden in vivo. Zukünftige Anwendungen umfassen die intraoperative Echtzeitbewertung des Krankheitsverlaufs und den minimalinvasiven katheterbasierten Einsatz dieser Sonden.

Einleitung

Mehrere chemische Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von Biomarkern werden routinemäßig sowohl in der Proteinchemie als auch in der klinischen Diagnostik eingesetzt, insbesondere bei der Krebsdiagnose und der Beurteilung des Fortschreitens von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Derzeit beruhen Methoden wie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), der enzymgebundene Immunsorbentien-Assay (ELISA) und die Massenspektrometrie auf der Probenentnahme aus dem Gefäßkompartiment 1,2,3 durch Bulk-Flüssigkeitsentnahme oder dem interstitiellen Kompartiment durch Mikrodialyse. Die Mikrodialyse verwendet einen semipermeablen Membranschlauch bekannter Länge, der in einer Region von Interesse platziert wird. Die Sammelflüssigkeit wird über mehrere Minuten4 durch das Röhrchen geleitet, um die Probe für die Analyse5 zu sammeln, wodurch die zeitliche Auflösung begrenzt wird. Auf diese Weise liefern die entnommenen Proben nur einen gemittelten Wert über die Zeit der lokalen Mikroumgebung und sind durch die Perfusionsrate und die Sammlung eines ausreichenden Probenvolumens begrenzt. Darüber hinaus erfordern diese Methoden die Bündelung experimenteller Daten und die Mittelung von Signalen; Daher können sie die Variabilität zwischen den Subjekten nicht berücksichtigen. Wichtig ist, dass die Zeit zwischen der Probenentnahme und der anschließenden Offline-Analyse ein sofortiges klinisches Eingreifen und Therapeutika ausschließt.

Im vorliegenden Protokoll wird die Verwendung eines kapazitiven Immunsonden-Biosensors (CI-Sonde) zur zeitaufgelösten elektrischen Detektion spezifischer bioaktiver Peptide skizziert. Neuropeptid Y (NPY), das aus postganglionären sympathischen Neuronen freigesetzt wird, die das Gefäßsystem, das Endokard, die Kardiomyozyten und die intrakardialen Ganglien innervieren, ist ein wichtiger neuromodulatorischer Peptidtransmitter im Herz-Kreislauf-System 6,7,8,9. Die hier vorgestellte Methode wurde entwickelt, um NPY zu messen, und die experimentelle Machbarkeit wird in einem Schweineherzmodell demonstriert. Dieser Ansatz gilt jedoch für jedes bioaktive Peptid, für das ein selektiver Antikörper verfügbar ist10. Diese Methode beruht auf dem kapazitiven Übergang zwischen einer Platindrahtsonde und der leitfähigen Flüssigkeit an der funktionalisierten Spitze11,12. In dieser Anwendung wurde die Wechselwirkung durch einen Antikörper gegen das Zielneuropeptid (NPY) vermittelt, das an die Elektrodenspitze gebunden war und die leitfähige Flüssigkeitsumgebung anschloss. Diese Funktionalisierung wurde durch die galvanische Abscheidung von reaktivem Polydopamin auf die Spitze der Platindrahtsonde10,13 erreicht.

Wenn die antikörperfunktionalisierte Sonde in einer Region von Interesse in vivo platziert wird, führt die evozierte endogene NPY-Freisetzung zu einer Bindung an die einfangenden Antikörper auf der Sondenspitze, und die leitfähige Flüssigkeit an der Elektrodenoberfläche wird durch das NPY-Protein verdrängt. Lokale Veränderungen in der elektrischen Umgebung führen zur Verdrängung von hochbeweglichen, hochdielektrischen Flüssigkeiten mit einem unbeweglichen, statisch geladenen Molekül. Dies verändert die Elektroden-Fluid-Grenzfläche und damit ihre Kapazität, die als Änderung des Ladungsstroms als Reaktion auf ein Schritt-Funktions-Befehlspotential gemessen wird. Ein negatives "Reset"-Potential wird unmittelbar nach jedem einzelnen Messzyklus eingesetzt, um gebundenen NPY durch elektrostatische Wechselwirkung aus dem Antikörper abzustoßen und so die Antikörperbindungsstellen für nachfolgende Messrundenzu räumen 10. Dies ermöglicht effektiv die zeitaufgelöste Messung von NPY. Die einzigartige CI-Technik überwindet die oben beschriebenen Einschränkungen der mikrodialysebasierten immunchemischen Methoden, um dynamische Biomarkerspiegel aus einem einzigen Experiment ohne Datenpooling oder Signalmittelung über mehrere Experimente zu messen9 und liefert Daten in nahezu Echtzeit. Darüber hinaus bietet die Fähigkeit, diese Methode an jeden Biomarker von Interesse anzupassen, für den ein geeigneter Antikörper auf einer zeitaufgelösten und lokalisierten Skala existiert, einen großen technischen Fortschritt in der immunchemischen Messung zur Bewertung des Krankheitsverlaufs und zur Anleitung therapeutischer Interventionen.

Die Software zur Datenerfassung und -analyse wurde in IGOR Pro (einer vollständig interaktiven Softwareumgebung) speziell geschrieben. Ein Analog-Digital-Wandlersystem (A/D) gab eine Befehlsspannung unter Computersteuerung aus und erfasste Daten von einem benutzerdefinierten Verstärker. Der Verstärker besaß bestimmte einzigartige Eigenschaften. Dazu gehörte ein Rückkopplungswiderstand (umschaltbar) für jeden der vier Erfassungskanäle, so dass 1 MOhm oder 10 MOhm Rückkopplungsspannungsklemmschaltungen gewählt werden konnten, um die Variabilität der Elektrode zu integrieren. Eine Bühneneinheit mit einem einzigen Kopf und einer gegenseitigen Masse / Referenzschaltung für alle vier Erfassungskanäle wurde ebenfalls gebaut, um das Gerät in der Nähe der Truhe in einem einzigen physischen Modul zu platzieren. Eine 1 MOhm Feedback-Widerstandseinstellung wurde verwendet, um alle gemeldeten Daten zu sammeln.

Die Filter- und Verstärkungseinstellungen wurden vom Verstärker telegrafiert und in der Datendatei aufgezeichnet. Die Daten wurden mit 1 kHz über einen 2-poligen analogen Bessel-Filter gefiltert, der mit 10 kHz digitalisiert wurde. Durch die Potentialdifferenz zwischen der Sonde und der umgebenden leitfähigen Lösung entsteht eine kapazitive Helmholtz-Schicht an der Sondenspitze. Die Ligandenbindung an den Antikörper an der Sondenspitze führt zu einer veränderten lokalen Ladung und damit zu einer Änderung der Helmholtz-Kapazität. Diese Änderung der kapazitiven Komponente der Schaltung führt zu einer Verschiebung der Größenordnung der eingespeisten Ladung, die erforderlich ist, um die Sonde auf das Potential im Stufenfunktionsspannungsprotokoll zu bringen. Somit führt die Bindung eines bestimmten Liganden an die funktionalisierte Sonde zu einer Veränderung der Elektrodenkapazitätsmessung als Änderung des kapazitiven Spitzenstroms.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Animal Research Committee der University of California, Los Angeles, genehmigt und gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8. Auflage, 2011) durchgeführt. Erwachsene männliche Yorkshire-Schweine von etwa 75 kg wurden für In-vivo-Studien verwendet 10.

1. Kapazitive Immunsondenherstellung und -funktionalisierung

  1. Schneiden Sie einen 25 cm langen perfluoralkoxybeschichteten (PFA)-beschichteten Platindraht (siehe Materialtabelle) und streifen Sie etwa 5 mm PFA-Beschichtung von einem Ende mit einem Skalpell ab, wobei Sie darauf achten sollten, nicht in den Platindraht zu schneiden.
  2. Setzen Sie das abisolierte Ende des Platindrahtes in einen vergoldeten 1-mm-Steckerstift ein und crimpen Sie die Anschlussstiftzähne mit einer Nadelzange um das abisolierte Ende des Platindrahtes (siehe Materialtabelle).
  3. Löten Sie den Platindraht an den vergoldeten Anschlussstift. Achten Sie darauf, keine übermäßige Menge an Lot zu verwenden.
  4. Dopaminlösung herstellen, indem 50 mg Dopamin HCl in 50 ml 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 6,0) durch Rühren gelöst werden.
  5. Sobald das Dopamin vollständig aufgelöst ist, legen Sie die Spitze des Platindrahtes in das Gefäß, das das frisch hergestellte Dopamin-ergänzte PBS enthält. Stecken Sie einen goldenen Steckerstift in einen Kanal der Kopfstufe (siehe Materialtabelle).
  6. Schließen Sie die AgCl-Scheibenelektrode (Masseelektrode, siehe Materialtabelle) an den Erdungskanal in der Kopfstufe an. Legen Sie die AgCl-Scheibe in das Gefäß, das Dopamin-ergänztes PBS und Platindraht enthält; Achten Sie darauf, nur die Scheibenelektrode und nicht irgendeine Länge des Drahtes oder Löts einzutauchen. Schließen Sie einen Draht-Shunt an die Referenzkanäle der Kopfstufe an, bevor Sie fortfahren.
  7. Öffnen Sie die interaktive Datenerfassungssoftware (siehe Materialverzeichnis). Bereiten Sie ein Sawtooth-Elektrodepositions-Befehlspotentialprotokoll mit den folgenden Parametern vor: Startpotential = −0,6 V; Endpotential = +0,65 V; Abtastrate = 0,04 V∙s-1; Ablagedauer = 420 s. Beginnen Sie mit dem Polydopamin-Abscheidungsprotokoll und stellen Sie sicher, dass alle Drähte ordnungsgemäß angeschlossen sind.
  8. Entfernen Sie nach Abschluss der Polydopaminabscheidung das AgCl-gemahlene Pellet und die Spitze des Platindrahts aus dem Behälter und achten Sie darauf, die Spitze der Platindrahtelektrode nicht zu stören. Legen Sie die Spitze des Drahtes für 2-5 Minuten in ein Mikroröhrchen, das PBS (pH 7,4) enthält, während die Antikörperlösung hergestellt wird; Stellen Sie sicher, dass die Drahtspitze die Seiten oder den Boden des Mikroröhrchens nicht berührt.
    HINWEIS: Antikörperlösung kann während der Polydopaminabscheidung hergestellt werden; Der Transfer des Platindrahtes aus dem dopaminhaltigen Gefäß in das Mikroröhrchen von PBS nach Polydopaminabscheidung sollte jedoch nicht übersprungen werden.
  9. Bereiten Sie die Antikörperlösung vor. Kombinieren Sie den interessierenden Antikörper mit PBS (pH 7,4) im Verhältnis 1:20 in einem Gefäß geeigneter Größe (z. B. einem Mikroröhrchen).
    HINWEIS: Der hier verwendete monoklonale Anti-NPY-Antikörper (siehe Materialtabelle) wurde mit 1 mg/ml alizitiert; Ein Beispiel für eine Antikörperpräparation wäre hier 4 μL Antikörper gegen 76 μL PBS.
  10. Die Polydopamin-abgeschiedene Spitze der Platinelektrode in Antikörperlösung für mindestens 2 h bei Raumtemperatur einweichen, um sicherzustellen, dass die Platindrahtspitze in Lösung suspendiert ist und nicht auf der Innenseite des Mikroröhrchens ruht.
    HINWEIS: Bei der jüngsten Implementierung dieser Technik wurde die Verwendung der Platindrahtelektrode unmittelbar nach diesem Schritt anstelle einer nassen oder trockenen Lagerung für die spätere Verwendung bevorzugt.
  11. Nach dem Einweichen in der Antikörperlösung die neu funktionalisierte kapazitive Immunsondenspitze (CI-Sonde) kurz in PBS (pH 7,4) abspülen. Die Sonde ist nun einsatzbereit.

2. Versuchsaufbau zum In-vitro-Nachweis und zur Messung von Peptiden

  1. Legen Sie die Funktionsspitze der CI-Sonde in die Durchflusskammer und achten Sie darauf, die Spitze der Elektrode in keiner Weise zu stören, da dies die sensorische Spitze der Sonde beschädigen kann.
    HINWEIS: Die Durchflusskammer wurde durch Gießen von Silikonelastomer (siehe Materialtabelle) in eine 35-mm-Kulturschale mit einem länglichen eiförmigen Raumfüller in der Mitte der Schale erzeugt. Nach dem Aushärten wird die eiförmige Form aus dem Elastomer entfernt. Die Kammer wird dann mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) aufgefüllt und ermöglicht eine Durchflussrate von 3 ml / min. Stellen Sie sicher, dass der Zu- und Abfluss den Flüssigkeitsstand in der Kammer so aufrechterhält, dass keine Gezeitenwirkung des Superfusats beobachtet wird. Der Durchfluss muss so lange an Ort und Stelle bleiben, wie die CI-Sonde verwendet wird.
  2. Führen Sie vor dem ersten experimentellen Test einen TBS-Standardlauf durch, um die CI-Sonde zu konditionieren. Richten Sie das folgende Befehlsspannungsprotokoll ein: positives Schrittpotential = +100 mV; negatives Schrittpotential = −5 mV; Schrittdauer = 20 ms; Anschaffungsdauer = 600 s.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Gleichgewichtung der Sonde während der Anfangsphase des zyklischen Befehlspotentials vor der Datenerfassung zu berücksichtigen.
  3. Erstellen Sie eine Lösung des interessierenden Peptids unter Verwendung derselben TBS, um die Zusammensetzung des Superfusats aufrechtzuerhalten. Richten Sie ein Verteilersystem ein, bei dem das Superfusat zwischen TBS und peptidergänztem TBS umgeschaltet werden kann, ohne Blasen in das Schlauchsystem oder die Durchflusskammer einzuführen.
    HINWEIS: Synthetisches porcines NPY-Peptid (siehe Materialtabelle) wurde in der vorliegenden Studie verwendet.
  4. Richten Sie das Peptid-Sensing-Datenerfassungsprotokoll mit TBS-Standardparametern ein (siehe Schritt 2.2.).
    HINWEIS: In dieser Implementierung betrug die Dauer jedes experimentellen Tests 360 s (120 s TBS, 120 s peptid-supplementierte TBS, 120 s TBS).

3. Anpassung der CI-Sonde für den In-vivo-Einsatz

  1. Vor der Polydopaminabscheidung (Schritt 1.7) fädeln Sie die freiliegende Spitze der Platindrahtelektrode durch eine 22 G Injektionsnadel, wobei etwa 2 mm über die Nadelspitze hinaus verbleiben. Biegen Sie mit einer Pinzette die Spitze der Platindrahtelektrode vorsichtig zurück, wodurch ein "Widerhaken" entsteht, der am Ende der Injektionsnadel hängt.
    1. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig von der Stachelspitze ab, und lassen Sie genügend Draht übrig, um ihn in den Behälter zu legen, ohne dass die Nadel die Flüssigkeit berührt. Fahren Sie mit den Schritten 1.4.-1.11 fort.
      HINWEIS: Je nach In-vivo-Setup kann es notwendig sein, eine Länge des Platindrahtes länger als 25 cm zu schneiden.
  2. Bevor Sie die CI-Sonde an die Kopfstufe anschließen, stellen Sie sicher, dass die gesamte elektrische Einrichtung ordnungsgemäß geerdet ist. Andernfalls kann es zu unerwünschten elektrischen Störungen während der experimentellen Aufnahmen kommen.
  3. Anästhesieren Sie die Tiere nach einem zuvor veröffentlichten Bericht10.
  4. Führen Sie eine Operation durch, um die Region von Interesse freizulegen.
    HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde eine mediane Sternotomie durchgeführt, um das Herz freizulegen. Bitte lesen Sie Kluge et al.10 für Details zur Tierchirurgie.
  5. Entfernen Sie vorsichtig die funktionalisierte Spitze von der PBS-Spülung (Schritt 1.11), leiten Sie die hydodermische Nadel zur mit Widerhaken versehenen C.I.-Sonde und implantieren Sie sie vorsichtig in den interessierenden Bereich, bevor Sie den goldenen Steckerstift in die Kopfstufe stecken. Ziehen Sie nach der Implantation die Injektionsnadel zurück und lassen Sie die Elektrode an Ort und Stelle.
    HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde die Sonde in der mittleren Seitenwand des linksventrikulären Myokards10 platziert.
  6. Nachdem Sie eine ordnungsgemäße elektrische Einrichtung sichergestellt haben, fahren Sie mit Standard- und experimentellen Testprotokollen fort (Schritt 2.2. und Schritt 2.4.).
  7. Nach Abschluss der Experimente euthanasieren Sie das Tier nach institutionell zugelassenen Techniken.
    HINWEIS: In der vorliegenden Studie werden die Tiere unter Tiefenbetäubung durch Induktion von Kammerflimmern eingeschläfert10.

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Ergebnisse

Herstellung und Charakterisierung von Elektroden
Eine flexible kapazitive Immunsonde (CI-Sonden) wurde hergestellt, und ein repräsentatives Bild ist in Abbildung 1A dargestellt. Das Elektrodenpotential wurde durch eine computergesteuerte Spannungsklemmschaltung eingestellt (Abbildung 1B), und die Elektrode wurde in eine Polydopaminlösung aus PBS eingetaucht. Polydopamin wurde zur Funktionalisierung auf die leitfähige Elektrodenspitze

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Diskussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung und Prüfung einer kapazitiven Immunsonde (CI-Sonde), die in der Lage ist, Biomarker von Interesse sowohl in vitro- als auch in vivo-Umgebungen nachzuweisen und zu messen. Die Detektion erfolgt durch Einfangen des Biomarkers an der Elektrodenspitze. Das Trapping-Ereignis verändert die kapazitive Verbindung zwischen einer kapazitiven Platindraht-Immunsonde und der umgebenden leitfähigen Flüssigkeitsumgebung, gemessen als Änderung des Ladungsstroms als R...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte, weder finanziell noch anderweitig.

Danksagungen

Wir danken Dr. Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) für die fachkundige Unterstützung der In-vivo-Experimente . Diese Arbeit wurde vom NIH U01 EB025138 (JLA, CS) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgCl-ScheibenelektrodeWarner Instruments (Holliston, MA)64-1307
Monoklonaler Anti-NPY-AntikörperAbcam, (Cambridge, MA)ab112473
Kundenspezifischer Mehrkanal-Verstärker / 1 MΩ Rückkopplungswiderstand Mehrkanal-KopfstufeNPI Electronic, (Tamm, Deutschland)NABasierend auf NPI VA-10M Mehrkanal-Verstärker
Dopamin HClSigma Aldrich (St. Louis, MO)H8502-10G
Vergoldeter Stecker PinAMP-TE Connectivity (Amplimite)6-66506-1
HEKA LIH 8+8 Analog-zu-Digital/Digital-zu-Analog-GerätHEKA Elektronik, (Holliston, MA)NA
Igor Pro Datenerfassungssoftware, v. 7.08WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)Software, die das Befehlspotenzial und die Datenerfassung steuert, wurde speziell geschrieben
Masterflex L/S Standard Digitale SchlauchpumpeCole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-beschichteter PlatindrahtA-M Systems, (Sequim, WA)7730000,005" blanker Durchmesser, 0,008" beschichteter Durchmesser
SilikonelastomerWorld Precision Instruments (Sarasota, FL)SYLG184
Synthetisches Schweine-NPY-PeptidBachem (Torrance, CA)
Synthetisches Schweine-NPY-PeptidBachem (Torrance, CA)4011654
4011654

Referenzen

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