Summary

Xenograft-Hautmodell zur Manipulation menschlicher Immunantworten in vivo

Published: June 29, 2022
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Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie menschliche Haut auf nicht-adipöse diabetische (NOD)-scid-Interleukin-2-Gamma-Kettenrezeptor-Mäuse (NSG) transplantiert werden kann. Eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung der menschlichen Haut für die Transplantation, der Vorbereitung von Mäusen für die Transplantation, der Transplantation der Split-Thickness der menschlichen Haut und des Wiederherstellungsverfahrens nach der Transplantation sind in dem Bericht enthalten.

Abstract

Das Xenograft-Modell der menschlichen Haut, bei dem menschliche Spenderhaut auf einen immundefizienten Mauswirt transplantiert wird, ist eine wichtige Option für die translationale Forschung in der Hautimmunologie. Murine und menschliche Haut unterscheiden sich wesentlich in der Anatomie und der Zusammensetzung der Immunzellen. Daher haben traditionelle Mausmodelle Einschränkungen für die dermatologische Forschung und Arzneimittelforschung. Erfolgreiche Xenotransplantationen sind jedoch technisch anspruchsvoll und erfordern eine optimale Vorbereitung der Proben- und Maustransplantatstelle für das Überleben des Transplantats und des Wirts. Das vorliegende Protokoll bietet eine optimierte Technik zur Transplantation menschlicher Haut auf Mäuse und diskutiert notwendige Überlegungen für nachgeschaltete experimentelle Ziele. Dieser Bericht beschreibt die geeignete Vorbereitung einer menschlichen Spenderhautprobe, die Zusammenstellung eines chirurgischen Aufbaus, die Vorbereitung von Mäusen und Operationsstellen, die Hauttransplantation und die postoperative Überwachung. Die Einhaltung dieser Methoden ermöglicht die Aufrechterhaltung von Xenotransplantaten für mehr als 6 Wochen nach der Operation. Die unten beschriebenen Techniken ermöglichen eine maximale Transplantationseffizienz aufgrund der Entwicklung von technischen Kontrollen, steriler Technik und prä- und postoperativer Konditionierung. Eine angemessene Leistung des Xenograft-Modells führt zu langlebigen menschlichen Hauttransplantatproben für die experimentelle Charakterisierung der menschlichen Haut und die präklinische Prüfung von Verbindungen in vivo.

Introduction

Mausmodelle werden häufig verwendet, um Rückschlüsse auf die menschliche Biologie und Krankheiten zu ziehen, teilweise aufgrund ihrer experimentellen Reproduzierbarkeit und Fähigkeit zur genetischen Manipulation. Die Physiologie der Maus rekapituliert jedoch menschliche Organsysteme, insbesondere die Haut, nicht vollständig und hat daher Einschränkungen für die Verwendung als präklinisches Modell in der Arzneimittelentwicklung1. Anatomische Unterschiede zwischen Maus- und menschlicher Haut umfassen Unterschiede in der Epitheldicke und -architektur, das Fehlen von ekkrinen Schweißdrüsen der Maus und Variationen im Haarzyklus2. Darüber hinaus unterscheiden sich sowohl die angeborenen als auch die adaptiven Arme des Immunsystems zwischen den beiden Spezies3. Maushaut enthält eine einzigartige Immunpopulation von dendritischen epidermalen T-Zellen (DETCs), hat eine höhere Häufigkeit von dermalen γδ-T-Zellen und variiert in der Lokalisierung von Immunzellen im Vergleich zu menschlichem Gewebe4. Daher profitieren experimentelle Erkenntnisse zur menschlichen Hautbiologie und Entzündung von der Validierung mit menschlichem Gewebe. Während In-vitro – und Organoid-Kultursysteme weit verbreitete Werkzeuge zur Untersuchung von menschlichem Gewebe sind, sind diese Systeme durch fehlende oder unvollständige Immunrekonstitution und eine fehlende Verbindung zum peripheren Gefäßsystem begrenzt5. Das humanisierte Xenograft-Hauttransplantationsmodell zielt darauf ab, die therapeutische oder biologische Manipulation von Immun- und Nicht-Immunwegen in menschlichem Gewebe in vivo zu ermöglichen.

Das Xenograft-Modell der menschlichen Haut wurde verwendet, um die Hautphysiologie und Pharmakologie zu untersuchen, Immunabstoßung und -reaktionen zu analysieren, menschliche Hautkrebsmechanismen zu analysieren und Hautkrankheiten und Wundheilung zu verstehen6. Obwohl das Xenograft-Modell auf mehrere Bereiche der Hautforschung anwendbar ist, hat es einen geringeren Durchsatz als In-vitro-Studien und verfügt nicht über die Leichtigkeit der genetischen Manipulation, die in Mausmodellen verwendet wird. Die Zeitpunkte innerhalb dieses Modells können von Wochen bis Monaten reichen, und eine erfolgreiche Transplantation erfordert geeignete Einrichtungen und Geräte, um diese Operationen durchzuführen. Das Xenograft-Modell liefert jedoch biologischen und physiologischen Kontext für Experimente, während organoide Kultursysteme wie Gewebeexplantate oft die Replikation einer Vielzahl von beweglichen Teilen, wie z. B. exogenen Signalen, in bestimmten Zeitintervallen erfordern7. Daher wird dieses Modell am besten verwendet, um Befunde, die in vitro und in Mausmodellen beobachtet wurden, weiter zu validieren oder für Arbeiten, die ansonsten biologisch nicht machbar sind. Die angemessene Verwendung des Xenograft-Modells bietet eine einzigartige Gelegenheit, intaktes menschliches Gewebe in vivo zu untersuchen und zu manipulieren.

Die Optimierung des Xenograft-Hauttransplantationsmodells stützt sich auf jahrzehntelange Forschung, um die Integrität des Transplantats im Laufe der Zeit zu erhalten. Entscheidend für diesen Prozess ist die Verwendung der nicht-adipösen diabetischen (NOD)-scid-Interleukin-2-Gamma-Kettenrezeptor-Maus (NSG), der B- und T-adaptive Immunzellen, funktionelle NK-Zellen fehlen und die Mängel an Makrophagen und dendritischen Zellen aufweist8. Die immundefiziente Natur dieser NSG-Wirte ermöglicht die Transplantation von menschlichen hämatopoetischen Zellen, von Patienten abgeleiteten Krebserkrankungen und Haut 8,9,10. Trotz dieser immunsuppressiven Wirtsumgebung ist eine zusätzliche Unterdrückung der neutrophilen Immunantwort der Maus durch Anti-GR1-Verabreichung für den Transplantaterfolg erforderlich10. Die Haupthindernisse bei der Transplantation von intaktem Gewebe sind Infektionen, Abstoßungsreaktionen und Schwierigkeiten bei der Wiederherstellung des Blutflusses zum Transplantat, was manchmal zum Verlust der dermalen und epidermalen Integrität führt11. Techniken wie die Verabreichung von Anti-FR1 und die Verwendung einer geeigneten Transplantattiefe verbessern das Überleben des Transplantats10. Eine sorgfältige Optimierung ermöglicht es, menschliche Xenograft-Hauttransplantationen an NSG-Mäusen mit hoher Effizienz und Überlebensraten von 90% bis 100% durchzuführen.

Protocol

Die vorliegende Studie wurde in Übereinstimmung mit den Protokollen UCSF IACUC (AN191105-01H) und IRB (13-11307) genehmigt und durchgeführt. Hautproben, die im Rahmen routinemäßiger elektiver chirurgischer Eingriffe wie Hernienreparatur verworfen wurden, wurden für die vorliegende Forschung verwendet. Die Hautproben werden entweder anonymisiert und als Not Human Subjects Research zertifiziert oder, wenn klinisch identifizierende Informationen für nachgeschaltete Analysen erforderlich sind, haben die Patienten eine …

Representative Results

Xenotransplantate mit menschlicher Haut wurden an NSG-Mäusen in einer Superbarriere-Tiereinrichtung durchgeführt. Der Erfolg wurde durch das verlängerte Transplantat- und Mausüberleben und die Verhaltensgesundheit von Mäusen nach der Transplantation definiert. Ein schlechtes Überleben in der Woche nach der Operation wurde zunächst als größtes Hindernis für den experimentellen Erfolg beobachtet, wobei bis zu 50% der Mäuse Euthanasie benötigten. Die Verbesserung der sterilen Technik und eine bessere Unterstütz…

Discussion

Das Maus-Xenograft-Hauttransplantationsmodell ist eine Schlüsseltechnik zur mechanistischen Analyse menschlicher Hautimmunantworten in einer In-vivo-Umgebung 14. Erfolgreiche Xenograft-Hauttransplantationen beruhen auf der geeigneten Vorbereitung von Mäusen und Hautproben und Mäusen und der Einhaltung aseptischer Nagetierchirurgiemethoden15. Eine schnelle Abkühlung und ordnungsgemäße Lagerung von Hautproben bei kalten Temperaturen in Medien (z. B. sterile Koc…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde zum Teil durch gesponserte Forschungsvereinbarungen von TRex Bio und Zuschüsse des NIH finanziert (1R01AR075864-01A1). JMM wird von der Cancer Research Society unterstützt (Grant 26005). Wir erkennen den Parnassus Flow Cytometry Core an, der teilweise durch die Zuschüsse NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 und S10 1S10OD018040-01 unterstützt wird.

Materials

10% Neutral Buffered Formalin Fisher SF100-20 Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) Thermo Fischer 56-0451-82 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5 BioXcell BE0075 Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3) BD Biosciences 340939 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) eBioscience 47-9956-42 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches VWR  89140-800 For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 Biolegend 317438 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) Biolegend 301042 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) Biolegend 317328 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL Covetrus 059122 Analgesia
Carprofen 50 mg/mL Zoetis NADA # 141-199 Analgesia
Collagenase Type IV Worthington 4188 Skin digestion
D42 Dermatome blade Humeca 5.D42BL10 dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42 Humeca 4.D42 dermatome
Disposable Scalpel Bard-Parker 371610 skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 Cole-Parmer UX-10915-03 To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors medicon 02.04.10 sample preparation and mouse dissection
DNAse Sigma-Aldrich DN25-1G Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent eBioscience 00-5521-00 Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) eBioscience 48-4776-42 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers Kent CL8787-KIT hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin Fisher Scientific 6765040 H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin Fisher Scientific 6765015 H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30) Tonbo Biosciences 35-0459-T100 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps  medicon 07.60.07 sample preparation and mouse dissection
Gauze Fisherbrand 22-362-178 Sample preparation
Heating lamp Morganville Scientific HL0100 Post-surgical care
Heating pads 4" x 10" Pristech 20415 Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes BD 329410 drug administration
Isoflurane United States Pharmacopeia (USP)  NDC 66794-013-25 Anesthesia 
Isoflurane machine VetEquip 911103 Anesthesia
Nair for Men Nair ‎ 10022600588556 hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment Dechra  NDC 17478-235-35 eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 Mice
Paper towels Kleenex 100848 May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12 Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) BD Biosciences 557938 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) BD Biosciences 561283 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) eBioscience 46-1529-42 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x eBioscience 00-8333-56 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm Corning 430597 Sample storage
Plastic Wrap Fisherbrand 22-305-654 Site preparation
Providone-Iodine Swab stick PDI S41350 Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) Se Lab Group Inc NC9066511  For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups Fisher Scientific 22-150-266 sample storage
Sterile alcohol prep pad Fisherbrand 22-363-750 skin preparation
Sterile PBS Gibco 14190-144 Media for sample storage
Sterile saline Hospira NDC 0409-4888-02 For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”  3M 1626 transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”  Kendall 414600 wound dressing
Violet 510 Ghost Dye  Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Flow cytometry analysis: Viability dye

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Moss, M. I., Pauli, M., Moreau, J. M., Cohen, J. N., Rosenblum, M. D., Lowe, M. M. Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo. J. Vis. Exp. (184), e64040, doi:10.3791/64040 (2022).

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