Summary

Embryonenrettungsprotokoll für interspezifische Hybridisierung in Kürbis

Published: September 12, 2022
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Summary

Der Artikel beschreibt ein Embryonenrettungsprotokoll zur Regeneration unreifer Embryonen, die aus der interspezifischen Hybridisierung von Cucurbita pepo und Cucurbita moschata stammen. Das Protokoll kann leicht repliziert werden und wird eine wichtige Ressource für Kürbiszuchtprogramme sein.

Abstract

Interspezifische Hybridisierung in Cucurbita-Kulturen (Kürbis) ist wünschenswert, um die genetische Variation zu erweitern und nützliche Allele zu introgressivieren. Unreife Embryonen, die aus diesen breiten Kreuzungen erzeugt werden, müssen mit geeigneten Embryonenrettungstechniken regeneriert werden. Obwohl diese Technik für viele Kulturen gut etabliert ist, fehlt eine detaillierte Beschreibung der geeigneten Methodik für Kürbis, die ihre routinemäßige Anwendung ermöglichen würde. Hier beschreiben wir ein Embryonenrettungsprotokoll, das für die interspezifische Hybridisierung von C. pepo und C . moschata nützlich ist. Um praktikable Kombinationen für die Embryonenrettung zu identifizieren, wurden 24 interspezifische Kreuzungen durchgeführt. Der Fruchtsatz wurde aus zweiundzwanzig Kreuzungen gewonnen, was auf eine Erfolgsquote von 92% hinweist. Die meisten der erhaltenen Früchte waren jedoch parthenocarpisch, mit Samen ohne Embryonen (leere Samen). Nur eine Kreuzung enthielt unreife Embryonen, die mit basalen Pflanzenwachstumsmedien regeneriert werden konnten. Insgesamt wurden 10 Embryonen aus der interspezifischen F1-Frucht gerettet, und die Erfolgsrate der Embryonenrettung betrug 80%. Das hier entwickelte Embryonenrettungsprotokoll wird für die interspezifische Hybridisierung in Kürbiszuchtprogrammen nützlich sein.

Introduction

Cucurbita (2n = 40) ist eine sehr vielfältige Gattung in der Familie der Kürbisgewächse (Cucurbitaceae), die 27 verschiedene Arten umfasst, von denen fünf domestiziert sind1. Unter diesen sind Cucurbita moschata, C. pepo und C. maxima die wirtschaftlich wichtigsten weltweit. In den USA sind C. moschata und C. pepo die beiden wichtigsten Arten in der landwirtschaftlichen Produktion. C. pepo besteht aus vier Unterarten (Ovifera, Pepo, Bruderschaft und Gumala), die sowohl Sommer- als auch Winterkürbis-Sortengruppen von Krummhals, Straightneck, Eichel, Jakobsmuschel, Kokosnuss, Gemüsemark, Zucchini und Kürbis 2,3,4,5 enthalten. C. moschata besteht hauptsächlich aus Winterkürbismarkttypen wie Butternut, Dickinson und Käsegruppe1. Die beiden Arten sind morphologisch und phänotypisch vielfältig, wobei C. pepo für seinen Ertrag, seine Frühigkeit, seine Buschwachstumsform und verschiedene Fruchtmerkmale wie Fruchtform, Fruchtgröße, Fleischfarbe und Rindenmuster angesehen wird. Auf der anderen Seite wird C. moschata für seine Anpassung an Hitze und Feuchtigkeit sowie für seine Krankheits- und Schädlingsresistenz geschätzt 6,7. Die interspezifische Hybridisierung zwischen C. moschata und C. pepo ist nicht nur eine wichtige Strategie zur Introgression wünschenswerter Eigenschaften zwischen den beiden Arten, sondern ermöglicht auch die Erweiterung der genetischen Basis in Zuchtprogrammen 7,8.

Frühe Kreuzungen zwischen C. moschata und C. pepo wurden gemacht, um ihre Kompatibilität und/oder taxonomischen Barrieren zu bestimmen 9,10,11, während spätere Studien sich hauptsächlich auf die Übertragung wünschenswerter Merkmalekonzentrierten 12,13,14. Die interspezifische Hybridisierung zwischen den beiden Arten hat auf die Übertragung neuer Merkmale wie eine Busch- oder Halbbuschwachstumsgewohnheit und einen verbesserten Ertrag von C. pepo zusammen mit Krankheitsresistenz, Anpassungsfähigkeit an abiotischen Stress und erhöhter Vitalität von C. moschata abzielt 14,15,16. Zum Beispiel haben spezifische Kreuzungen zwischen C. pepo (P5) und C. moschata (MO3) zu einem höheren Fruchtertrag geführt 13, während C. moschata-Akzessionen (Nigerian Local und Menina) häufig als primäre Quelle der Resistenz gegen Potyviren in kultivierten C. pepo-Sorten verwendet wurden17,18.

Frühere Studien zeigten, dass eine Hybridisierung zwischen C. moschata und C. pepo möglich, aber schwierig ist 8,15. Die interspezifischen Kreuzungen könnten dazu führen, dass keine Früchte angesetzt werden (Abort), parthenocarpische Früchte ohne lebensfähige Samen (leere Samen), kernlose Früchte, bei denen sich die unreifen Embryonen nicht entwickeln (Stenospermocarpy), oder Früchte mit wenigen unreifen Embryonen, die durch Embryonenrettung in reife Pflanzen gerettet werden können15,16. Zum Beispiel wurden keine lebensfähigen Samen durch Kreuzung von C. pepo (Tischkönigin, mütterlich) mit C. moschata (großer Käse, väterlicherseits) erhalten, aber die wechselseitige Kreuzung ergab 57 lebensfähige Samen aus 134 Bestäubungen9. Hayase erhielt lebensfähige Samen von C. moschata und C. pepo Kreuzungen nur, wenn Kreuzungen um 04:00 Uhr mit Pollen gemacht wurden, die über Nacht bei 10 °C gelagert wurden19. Baggett kreuzte acht verschiedene C. moschata-Sorten mit C. pepo (delicata) und berichtete, dass von insgesamt 103 Bestäubungen 83 Früchte erhalten wurden, die normal erschienen, aber keine von ihnen lebensfähige Samen enthielt8. In einer Kreuzung zwischen C. pepo (S179) und C. moschata (NK) erhielten Zhang et al. 15 Früchte mit 2.994 Samen, aber nur 12 dieser Samen waren lebensfähig, während die restlichen nur rudimentäre Entwicklung zeigten. Diese Studien deuten darauf hin, dass, obwohl die interspezifische Kreuzung zwischen C. moschata und C. pepo sehr vorteilhaft ist, die Gewinnung von Früchten mit lebensfähigen Samen aus den Kreuzungen anspruchsvoll ist16.

Die Embryonenrettung wurde als geeignete Methode zur Überwindung von Problemen vorgeschlagen, die sich aus einem frühen Abbruch oder schlecht entwickelten Embryonen ergeben, und ist eine der frühesten und erfolgreichsten In-vitro-Kulturtechniken zur Regeneration unreifer Embryonen16,20. Die Embryonenrettung umfasst die In-vitro-Kultur von unterentwickelten/unreifen Embryonen, gefolgt von der Überführung auf ein steriles Nährmedium, um die Gewinnung von Sämlingen und schließlich reifen Pflanzen zu erleichtern21. Obwohl die Embryonenrettung häufig in der Kürbiszucht verwendet wird, fehlt eine detaillierte Beschreibung der geeigneten Methodik, die ihre routinemäßige Anwendung ermöglichen würde. Die Verwendung von Embryonenrettungstechniken zur Überwindung interspezifischer Hybridisierungsbarrieren bei Cucurbita-Arten wurde bereits 1954 berichtet22. Der Erfolg der Embryonenrettung in den frühen Studien war jedoch entweder nicht oder sehr gering. Metwally et al. berichteten über eine Erfolgsrate von 10% (Regeneration zu reifen Pflanzen) unter 100 interspezifischen Hybridembryonen, die aus einer Kreuzung zwischen C. pepo und C. martinezii gerettet wurden 23. Sisko et al. berichteten über eine variable Erfolgsrate der Embryonenregeneration zwischen Embryonen, die aus verschiedenen Kreuzkombinationen gewonnen wurden: Die Regenerationsrate von Hybriden, die durch Kreuzung von C. maxima (Bos. Max) und C. pepo (Goldrausch) erhalten wurden, betrug 15,5%, für C. pepo (Zucchini) und C. moschata (Hokaido) 20%, während sie für C. pepo (Goldrausch) und C. moschata (Dolga) 37,5% betrug24. Neben dem Genotyp sind Medien und In-vitro-Kulturbedingungen wichtige Faktoren für den Erfolg der Technik25,26. In der aktuellen Studie wurden verschiedene Kreuzungskombinationen zwischen C. moschata und C. pepo getestet und eine einfache Methodik zur Anwendung der Embryonenrettungstechnik im Kürbis entwickelt. Die Entwicklung einer einfachen und leicht reproduzierbaren Embryonenrettungstechnik wird die interspezifische Hybridisierung und Keimplasmaverstärkung in Kürbiszuchtprogrammen erleichtern.

Protocol

1. Anpflanzung und Bestäubung HINWEIS: Es ist wichtig, kompatible Genotypen zu identifizieren, deren Hybridisierung zum Fruchtansatz und zur Produktion lebensfähiger Embryonen führen würde. Pflanzbedingungen und WartungSamen von Kürbis-Genotypen (Sorten / Akzessionen) für die Hybridisierung erhalten (Tabelle 1). Füllen Sie 50 Zellenausgangsflächen (25 cm Breite x 50 cm Länge) mit Topfmedium, das mit vollständigem NPK-Dün…

Representative Results

Fruchtansatz und Lebensfähigkeit des SaatgutsEin erster Test wurde durchgeführt, um den Fruchtansatz und die Lebensfähigkeit von Samen in einer Vielzahl von Kreuzkombinationen zu bestimmen. Insgesamt wurden 15 Kürbis-Genotypen, vier C. pepo und 11 C. moschata, ausgewählt (Tabelle 1). Von den 24 versuchten interspezifischen Kreuzkombinationen wurde für 22 ein Fruchtansatz erhalten (Tabelle 2), was einem Gesamterfolg von >92% im Fruchtsatz entsp…

Discussion

Es gibt zwei Hauptengpässe für eine erfolgreiche interspezifische Hybridisierung zwischen C. moschata und C. pepo: die Kreuzkompatibilitätsbarriere, die durch die Reaktionsfähigkeit des Genotyps bestimmt wird, um Hybridembryonen zu produzieren, und die Barrieren nach der Befruchtung, die die Entwicklung von Hybridembryonen zu normalen Samen behindern. Wie bereits für Kürbis berichtet, ergab der Kreuzkompatibilitätstest in der aktuellen Studie, dass sich die meisten Früchte parthenocarpisch entwi…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Project No. FLA-TRC-006176 und dem Institute of Food and Agricultural Sciences der University of Florida.

Materials

ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
autoclave Steris AMSCO LAB 250
balance
cefotaxime Sigma Alfrich C 7039
centrifuge tubes (1.5 ml) Sigma Alfrich T9661
detergent
ethanol, 95% Decon Labs 2805HC
forceps VWR 82027-408
gellan gum Caisson Laboratories G024
growth chamber or illuminated shelf
laminar hood / biosafety cabinet The Baker Company, Inc Edgegard
masking tape Uline S-11735
media bottle
Murashige & Skoog Medium Research Products International M10200
NPK fertilizer (20-20-20) BWI Companies, Inc  PR200
Osmocote Plus fertilizer BWI Companie,s Inc OS90590
Parafilm M Sigma Alfrich P7793
Petri dish (60 x 15 mm) USA Scientific, Inc 8609-0160
plant pots BWI Companies, Inc NP4000BXL
plastic food containers, reused Oscar Mayer 4470003330
plastic hang tags Amazon B07QTZRY6T
potting mix Jolly Gardener Pro-Line C/B
seedling starter trays BWI Companies Inc GPPF128S4
syringe filter (0.22 um ) ExtraGene B25CA022-S
trellis support The Home Depot  2A060006
water bath

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Diesen Artikel zitieren
Fu, Y., Shrestha, S., Moon, P., Meru, G. Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash. J. Vis. Exp. (187), e64071, doi:10.3791/64071 (2022).

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