Summary

In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

Published: June 16, 2022
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Summary

Das Küken ist ein kostengünstiger, zugänglicher und weit verbreiteter Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien. Hier wird eine Reihe von Protokollen detailliert beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Regeneration des Vogelinnenohrs zugrunde liegen.

Abstract

Das Innenohr nimmt Geräusche wahr und hält das Gleichgewicht über die Cochlea und den Vorraum aufrecht. Dies geschieht durch die Verwendung eines dedizierten mechanosensorischen Zelltyps, der als Haarzelle bekannt ist. Die Grundlagenforschung im Innenohr hat zu einem tiefen Verständnis geführt, wie die Haarzellen funktionieren und wie Dysregulation zu Hörverlust und Schwindel führen kann. Für diese Forschung war die Maus das herausragende Modellsystem. Mäuse haben jedoch, wie alle Säugetiere, die Fähigkeit verloren, Haarzellen zu ersetzen. Wenn man also versucht, zelluläre Therapien zur Wiederherstellung der Innenohrfunktion zu verstehen, könnten ergänzende Studien an anderen Wirbeltierarten weitere Erkenntnisse liefern. Das auditorische Epithel von Vögeln, die Basilarpapille (BP), ist eine Epithelschicht, die aus mechanosensorischen Haarzellen (HCs) besteht, die von Stützzellen (SCs) interkaliert werden. Obwohl sich die anatomische Architektur der Basilarpapille und der Säugetier-Cochlea unterscheidet, sind die molekularen Mechanismen der Innenohrentwicklung und des Hörens ähnlich. Dies macht die Basilarpapille zu einem nützlichen System nicht nur für vergleichende Studien, sondern auch für das Verständnis der Regeneration. Hier beschreiben wir Sezier- und Manipulationstechniken für das Hühnerinnenohr. Die Technik zeigt genetische und niedermolekulare Hemmungsmethoden, die ein potentes Werkzeug zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der Innenohrentwicklung bieten. In diesem Artikel diskutieren wir in Ovo-Elektroporationstechniken, um die Basilarpapille unter Verwendung von CRIPSR-Cas9-Deletionen genetisch zu stören, gefolgt von der Dissektion der Basilarpapille. Wir demonstrieren auch die BP-Organkultur und die optimale Verwendung von Kulturmatrices, um die Entwicklung des Epithels und der Haarzellen zu beobachten.

Introduction

Das Innenohr aller Wirbeltiere leitet sich von einem einfachen Epithel ab, das als otische Placode 1,2 bekannt ist. Dadurch entstehen alle strukturellen Elemente und Zelltypen, die notwendig sind, um die mechanosensorischen Informationen zu übertragen, die mit dem Hören und der Gleichgewichtswahrnehmung verbunden sind. Haarzellen (HCs), der Flimmersensor des Innenohrs, sind von Stützzellen (SCs) umgeben. HCs leiten Informationen über die Neuronen des achten Hirnnervs an das auditorische Hinterhirn weiter. Diese werden ebenfalls aus dem otischen Placode3 generiert. Die primäre Schalltransduktion wird an der apikalen Oberfläche des auditorischen HC durch ein mechanisch empfindliches Haarbündel4 erreicht. Dies wird durch modifizierte Aktin-basierte Vorsprünge, sogenannte Stereozilien, vermittelt, die in einem abgestuften Treppenmusterangeordnet sind 5. Darüber hinaus organisiert ein modifiziertes primäres Zilium, das sogenannte Kinocilium, die Haarbündelbildung und grenzt an die höchste Reihe von Stereozilien 6,7,8. Die Architektur der Stereozilien ist entscheidend für diese Rolle bei der Umwandlung mechanischer Reize, die von akustischer Energie in elektrische neuronale Signale abgeleitet werden9. Eine Schädigung des auditiven HC durch Alterung, Infektion, otoakustisches Trauma oder ototoxischer Schock kann zu einem teilweisen oder vollständigen Hörverlust führen, der bei Säugetieren irreversibel ist10.

Es wurden zelluläre Ersatztherapien vorgeschlagen, die solche Schäden reparieren könnten11,12. Der Ansatz dieser Forschung bestand darin, die normale Entwicklung der Haarzelle von Säugetieren zu verstehen und zu fragen, ob Entwicklungsprogramme in vorläuferähnlichen Zellen, die im Innenohr existieren können, wieder aufgenommen werden können13. Ein zweiter Ansatz bestand darin, außerhalb von Säugetieren auf Nicht-Säugetier-Wirbeltiere zu schauen, bei denen eine robuste Regeneration von Gehörhaarzellen stattfindet, wie z.B. Vögel14,15. Bei Vögeln erfolgt die Haarzellregeneration überwiegend durch die Dedifferenzierung einer Stützzelle in einen vorläuferähnlichen Zustand, gefolgt von einer asymmetrischen mitotischen Teilung zur Erzeugung einer Haarzelle und einer Stützzelle16. Darüber hinaus wurde auch eine direkte Differenzierung einer Stützzelle zur Erzeugung einer Haarzelle beobachtet17.

Während die Mechanismen der auditiven Entwicklung von Vögeln signifikante Ähnlichkeiten mit denen von Säugetieren aufweisen, gibt es Unterschiede18. Die HC- und SC-Differenzierung beim Küken-BP ist ab dem embryonalen Tag (E) 7 erkennbar und wird im Laufe der Zeit deutlicher. Durch E12 kann eine gut strukturierte und gut polarisierte Basilarpapille (BP) sichtbar gemacht werden, und durch E17 können gut entwickelte Haarzellen gesehen werden19. Diese Zeitpunkte bieten Fenster in die Mechanismen der Differenzierung, Strukturierung und Polarität sowie in die Reifung der Haarzellen. Es ist wichtig zu verstehen, ob solche Mechanismen konserviert oder divergent sind, da sie Einblicke in die tiefe Homologie der Ursprünge mechanosensorischer Haarzellen geben.

Hier demonstrieren wir eine Reihe von Techniken, die in frühen und späten embryonalen Stadien durchgeführt werden, um zelluläre Prozesse wie Proliferation, Schicksalsspezifikation, Differenzierung, Musterung und Aufrechterhaltung während der gesamten Entwicklung des Innenohrorgans zu untersuchen. Dies ergänzt andere Protokolle zum Verständnis der Innenohrentwicklung in der Explantatkultur20,21,22. Wir diskutieren zunächst die Einführung von exogener DNA oder RNA in BP-Vorläufer innerhalb der E3.5-Otozyste unter Verwendung der In-Ovo-Elektroporation. Obwohl genetische Manipulationen wertvolle Erkenntnisse liefern können, können die so erzeugten Phänotypen pleiotrop und folglich verwirrend sein. Dies gilt insbesondere für die spätere Innenohrentwicklung, wo grundlegende Prozesse wie der Umbau des Zytoskeletts vielfältige Rollen bei der Zellteilung, der Gewebemorphogenese und der zellulären Spezialisierung spielen. Wir präsentieren Protokolle zur pharmakologischen Hemmung in kultivierten Explantaten, die Vorteile bei der Kontrolle von Dosierung und Behandlungszeitpunkt und -dauer bieten und eine präzise raumzeitliche Manipulation von Entwicklungsmechanismen ermöglichen.

Je nach Behandlungsdauer kleiner Inhibitoren können unterschiedliche Organkulturmethoden eingesetzt werden. Hier zeigen wir zwei Methoden der Organkultur, die Einblicke in die epitheliale Morphogenese und zelluläre Spezialisierung ermöglichen. Eine Methode zur 3D-Kultur mit Kollagen als Matrix zur Kultur des Cochlea-Gangs ermöglicht eine robuste Kultivierung und Live-Visualisierung des sich entwickelnden BP. Um die Bildung von Stereozilien zu verstehen, stellen wir eine Membrankulturmethode vor, bei der Epithelgewebe auf einer steifen Matrix kultiviert wird, so dass Aktinvorsprünge frei wachsen können. Beide Methoden ermöglichen die Weiterverarbeitung wie Lebendzellbildgebung, Immunhistochemie, Rasterelektronenmikroskopie (REM), Zellaufzeichnung usw. Diese Techniken bieten eine Roadmap für die effektive Nutzung des Kükens als Modellsystem, um die Entwicklung, Reifung und Regeneration des aviären Gehörepithels zu verstehen und zu manipulieren.

Protocol

Protokolle, die die Beschaffung, Kultur und Verwendung von befruchteten Hühnereiern und nicht geschlüpften Embryonen beinhalten, wurden von der Institutional Animal Ethics Committee des National Centre for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka, genehmigt. 1. Bei der Elektroporation von Gehörvorläufern von Küken sgRNA-Design und Klonierung für CRISPR/Cas9-Gen-KnockoutUm Gen-Knockouts zu erzeugen, entwerfen Sie RNAs, um die Exon-Regionen des …

Representative Results

Im Elektroporationsaufbau kann die Elektrodenpositionierung eine Rolle im Bereich der Transfektion spielen. Die positive Elektrode wird unter das Eigelb und die negative über dem Embryo platziert (Abbildung 1A). Dies führt zu einer höheren GFP-Expression in einem Großteil des Innenohrs und beider vestibulären Organe (Abbildung 1B) und der auditorischen Basilarpapille (Abbildung 1C,D), was die Transfektion best?…

Discussion

Das Küken ist eine kostengünstige und bequeme Ergänzung zu den Modellorganismen, mit denen ein Labor das Innenohr erforschen kann. Die hier beschriebenen Methoden werden routinemäßig in unserem Labor eingesetzt und ergänzen die laufende Forschung im Innenohr von Säugetieren. In der Ovo wird Elektroporation verwendet, um genetische Manipulationen in das Kükengenom einzuführen. Die Elektroporation kann auch verwendet werden, um Konstrukte einzuführen, die fluoreszierende Proteine kodieren, die auf bestim…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Ihnen für die Unterstützung von NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB und dem Royal National Institute for the Deaf. Wir möchten uns bei der Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru, bedanken. Wir danken dem CIFF und der EM-Einrichtung und der Laborunterstützung bei NCBS. Wir danken Yoshiko Takahashi und Koichi Kawakami für die Tol2-eGFP- und T2TP-Konstrukte und Guy Richardson für HCA und G19 Pcdh15-Antikörper. Wir danken den Earlab-Mitgliedern für ihre ständige Unterstützung und ihr wertvolles Feedback zum Protokoll.

Materials

Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 Integrated DNA Technologies 1081061 High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibody Abcam ab290 Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Calcium Chloride Dihydrate Thermo Fisher Scientific Q12135
Collagen I, rat tail Thermo Fisher Scientific A1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 Leica
CUY-21 Electroporator Nepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
DM5000B Widefield Microscope Leica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569010
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252
Fluoroshield Sigma-Aldrich F6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope Olympus
Glutaraldehyde (25 %) Sigma-Aldrich 340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
Goat Serum Sterile filtered HiMedia RM10701 Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14025092
LSM980 Airyscan Microscope Zeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm Sigma-Aldrich PICM03050
MVX10 Stereo Microscope Olympus
MYO7A antibody DSHB 138-1 Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscope Leica
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'') World Precision Instruments 501237
Osmium tetroxide (4%) Sigma-Aldrich 75632
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PC-10 Puller Narishige
pcU6_1sgRNA Addgene 92395 Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
SMZ1500 Dissecting microscope Nikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M Electron Microscopy Sciences 11652
Sodium chloride HiMedia GRM853
Sputtre Coater K550X Emitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament World Precision Instruments 1B100-3
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
The MERLIN Compact VP Zeiss
Thiocarbohydrazide Alfa Aesar L01205
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379

Referenzen

  1. Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
  2. Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
  3. Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
  4. Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
  5. Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
  6. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
  7. Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
  8. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
  9. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
  10. Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
  11. Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
  12. Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
  13. Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
  14. Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
  15. Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
  16. Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
  17. Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
  18. Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
  19. Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Entwicklungsbiologie. 116 (1), 119-129 (1986).
  20. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
  21. Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O’Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
  22. Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
  23. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  24. Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Entwicklungsbiologie. 432 (1), 86-97 (2017).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
  26. Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Entwicklungsbiologie. 305 (2), 616-624 (2007).
  27. Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
  28. Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
  29. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  30. Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
  31. Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
  32. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  33. Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
  34. Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
  35. Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
  36. Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
  37. Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
  38. Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
  39. Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).

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Diesen Artikel zitieren
Singh, N., Prakash, A., Chakravarthy, S. R., Kaushik, R., Ladher, R. K. In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development. J. Vis. Exp. (184), e64172, doi:10.3791/64172 (2022).

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