Summary
Kombinationen af laserporation og mikroelektrodearrays (MEA) tillader handlingspotentialelignende optagelser af dyrkede primære og stamcelleafledte kardiomyocytter. Bølgeformformen giver overlegen indsigt i testforbindelsers virkemåde end standardoptagelser. Det forbinder patch-clamp og MEA-udlæsning for yderligere at optimere cardio-sikkerhedsforskning i fremtiden.
Abstract
Livstruende lægemiddelinduceret hjertearytmi er ofte forud for langvarige hjertehandlingspotentialer (AP), almindeligvis ledsaget af små proarytmiske membranpotentialeudsving. Formen og tidsforløbet af den repolariserende fraktion af AP kan være afgørende for tilstedeværelsen eller fraværet af arytmi.
Microelectrode arrays (MEA) giver nem adgang til kardiotoksiske sammensatte effekter via ekstracellulære feltpotentialer (FP). Selvom det er et kraftfuldt og veletableret værktøj inden for forskning og hjertesikkerhedsfarmakologi, tillader FP-bølgeformen ikke at udlede den originale AP-form på grund af det ekstracellulære optagelsesprincip og den resulterende iboende vekselstrømsfiltrering (AC).
En ny enhed, der er beskrevet her, kan gentagne gange åbne membranen af kardiomyocytter dyrket oven på MEA-elektroderne på flere dyrkningstidspunkter ved hjælp af en meget fokuseret nanosekundlaserstråle. Laserporationen resulterer i transformation af det elektrofysiologiske signal fra FP til intracellulære lignende AP'er (laserinduceret AP, liAP) og muliggør optagelse af transcellulære spændingsafbøjninger. Denne intracellulære adgang giver en bedre beskrivelse af AP-formen og en bedre og mere følsom klassificering af proarytmiske potentialer end almindelige MEA-optagelser. Dette system er en revolutionerende udvidelse af de eksisterende elektrofysiologiske metoder, der muliggør nøjagtig evaluering af kardiotoksisk virkning med alle fordele ved MEA-baserede optagelser (lette, akutte og kroniske eksperimenter, signaludbredelsesanalyse osv.).
Introduction
Det elektriske bidrag fra et hjerteslag skyldes et komplekst og præcist timet samspil mellem mange hjertekanaler og transportører samt den præcist indstillede udbredelse af elektriske signaler gennem myokardiet1. Ændring af disse tæt koordinerede mekanismer (f.eks. brug af lægemidler) kan resultere i alvorlige konsekvenser for hjertets funktion (dvs. livstruende arytmi)2,3. Arytmier er defineret som uregelmæssige hjerteslag, der ændrer hjertets normale rytme, hvilket kan have livstruende konsekvenser. De kan være forårsaget enten af nedsat initiering af en bølge af hjerte-excitation eller ved unormal udbredelse af hjerte-excitation4, hvilket igen resulterer i en dysfunktion af hjertets pumpemekanisme.
Mange meget potente lægemiddelkandidater skal udelukkes fra yderligere undersøgelser i den tidlige lægemiddeludviklingsfase på grund af deres (pro-) arytmiske potentiale 2,3. De modulerer vigtige hjertekanaler (f.eks. den humane ether-a-go-go-relaterede genkanal [hERG]), der er ansvarlige for normal dannelse og afslutning af hjertevirkningspotentiale samt efterfølgende signaludbredelse5.
Farmaceutiske virksomheder bruger rutinemæssigt patch-clamp-målinger eller mikroelektrodearrays (MEA) til at undersøge potentielle kardiotoksiske off-target-effekter induceret af lægemiddelkandidater. Patch-clamp-optagelser gør det muligt at dechiffrere stoffernes indvirkning på hjerteionkanaler og analysere det transcellulære hjertehandlingspotentiale med høj spatio-temporal opløsning 6,7. Ulemperne ved denne teknik inkluderer imidlertid lav gennemstrømning med manuel patch-clamp og begrænset anvendelighed af automatisering på grund af afhængigheden af denne metode på celler i suspension. Desuden kan kroniske virkninger ikke undersøges på grund af metodens invasivitet. Endelig studeres typisk kun enkeltceller samtidigt i stedet for hele hjertesynkytium, hvilket gør det umuligt at adressere information om signaludbredelse.
Spændingsfølsomme farvestoffer er værdifulde til ikke-invasiv undersøgelse af hjerteaktionspotentialer og lægemiddelinducerede arytmier8. De tillader undersøgelse af både enkeltcelle- og syncytiumaktivitet. Ulemper ved denne metode er cytotoksiske virkninger af enten farvestofferne i sig selv eller af reaktionsproduktet under belysning. De bruges til akutte eksperimenter og er næppe anvendelige til langtidsundersøgelser 9,10,11. Spændingsfølsomme proteiner som alternativer har gjort betydelige fremskridt i løbet af de sidste par år med hensyn til anvendelighed og følsomhed, men kræver genetisk modifikation af cellerne af interesse og mangler høj tidsmæssig opløsning sammenlignet med elektrofysiologiske teknikker12.
Oplysninger fra det seneste CiPA-initiativ13 siger, at MEA'er i vid udstrækning anvendes i hjertesikkerhedsscreeninger som en alternativ elektrofysiologisk tilgang, da de repræsenterer et kraftfuldt og veletableret værktøj til at undersøge hjertefunktion og sikkerhedsfarmakologi. Kardiomyocytter dyrkes som et syncytium direkte oven på chipsene, og ekstracellulære feltpotentialer (FP'er) registreres ikke-invasivt via substratintegrerede mikroelektroder. Dette optagelsesprincip gør det muligt at udføre øgede gennemstrømningsscreeninger over flere dage, hvilket gør dem velegnede til farmaceutisk forskning i kroniske virkninger. Den resulterende FP-bølgeform er et derivat af den intracellulære AP14. Parametre som slaghastighed, amplituden af den indledende del af FP og FP-varighed er let tilgængelige15. Andre væsentlige kriterier såsom differentieringen mellem forlængelse og triangulering af FP (en vigtig markør for proarytmi16,17) er utilgængelige på grund af teknikkens AC-filtreringseffekt. Desuden overses detektering af andre små proarytmiske begivenheder såsom tidlige og forsinkede efterdepolariseringer (henholdsvis EAD og DAD) ofte let på grund af deres lille amplitude.
Her beskriver vi en metode til at få adgang til det intracellulære membranpotentiale ved at åbne membranen af kardiomyocytter. IntraCell-enheden (i det følgende benævnt intracellulær optageenhed) tillader gentagne membranåbninger af kardiomyocytter dyrket oven på MEA-elektroderne ved hjælp af en meget fokuseret nanosekundlaserstråle via et specifikt fysisk fænomen (overfladeplasmonresonans)18. Som et resultat overgår optagelsen fra en almindelig FP til en intracellulærlignende AP (laserinduceret AP, liAP). Protokollen viser, hvordan dette giver adgang til kinetiske aspekter af bølgeformen, der ikke let kan fanges ved at analysere FP'er. Denne metode repræsenterer en bro mellem traditionelle intracellulære patch-clamp og MEA-optagelser. Teknologien er derfor en stærk forlængelse af de nuværende metoder til vurdering af hjertesikkerhed.
Protocol
1. Induceret pluripotent stamcelleafledt kardiomyocytforberedelse
BEMÆRK: iCell kardiomyocytter2 (kaldet inducerede pluripotente stamceller [iPSC'er]-afledte kardiomyocytter) blev fremstillet i henhold til protokollen fra leverandøren. Protokollen vil kort blive opsummeret i det følgende afsnit.
- Optøning af belægning og vedligeholdelsesmedium ved 4 °C i 24 timer før brug.
- Fibernectinbelægning fremstilles ved at opløse sterilt fibronectin i sterilt vand i en koncentration på 1 mg/ml. Frys opbevar denne bestand i aliquots (f.eks. 25 μL pr. Aliquot). Den aliquoted stockopløsning fortyndes 1:20 i steril Dulbeccos afbalancerede saltopløsning (dPBS).
- Belæg elektrodefelterne i de tidligere autoklaverede MEA'er under den laminære strømningshætte, dråbemæssigt under sterile forhold med fibronectin ved hjælp af en 10 μL pipette. Til dette skal du droppe 5 μL af fibronectinbelægningsopløsningen på elektrodefelterne og observere dannelsen af en dråbe oven på elektrodeområdet. Sørg for ikke at røre ved de følsomme elektroder.
BEMÆRK: For at opretholde sterile forhold skal du overføre MEA-chippen til en steril petriskål, før du fjerner den fra den laminære strømningshætte. - De coatede MEA'er inkuberes helst i 1 time ved 37 °C i en inkubator.
- Optø kryovialen indeholdende kardiomyocytterne i et vandbad ved ca. 37 °C i 2 minutter, indtil der kun er lidt iskrystal tilbage. Overfør celleopløsningen forsigtigt til et 50 ml rør.
- Tilsæt 1 ml pletteringsmedium til den tomme kryoval. Overfør opløsningen dråbevis over en periode på 90 s til 50 ml røret for at reducere det osmotiske chok. Tilsæt forsigtigt yderligere 8 ml belægningsmedium i røret.
- Bland cellesuspensionen forsigtigt ved hjælp af en 10 ml pipette. Beregn det samlede antal levedygtige celler ved hjælp af automatiseret fluorescenscytometri. Nummeret skal være tæt på nummeret i det datablad, som fabrikanten har angivet.
- Drej celleopløsningen ned i 3 minutter ved 200 x g ved stuetemperatur. Fjern supernatanten ved aspiration ved hjælp af en glaspipette, der er fastgjort til et pumpesystem. Juster celletallet mellem 6.000 og 15.000 levedygtige celler/μL.
BEMÆRK: Antallet af celler er normalt inden for ovennævnte område, men kan variere afhængigt af den respektive leverandør. - Fjern overfladebehandlingsopløsningen, der blev påført i trin 1.3, fra MEA-elektrodeområdet ved hjælp af en 10 μL pipette direkte før cellesåning. Frø cellerne umiddelbart efter fjernelsen for at undgå tørring af belægningen. Til dette sås cellerne dråbevis ved 4 μL for både 6-brønds MEA'er og 1-brønds MEA'er på elektrodefelterne på samme måde som gjort med belægningen.
- Cellerne klæbes i 1 time i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 , inden brøndene fyldes med det sterile belægningsmedium opvarmet til ca. 37 °C ved 200 μL for 6-brønds MEA og 1 ml for enkeltbrønds MEA under den laminære strømningshætte.
- Udfør en komplet medium ændring 48 timer efter plettering under den laminære strømningshætte. Til dette fjernes pletteringsmediet ved aspiration ved hjælp af en glaspipette fastgjort til et pumpesystem. Derefter tilsættes 200 μL sterilt vedligeholdelsesmedium opvarmet til 37 °C til brøndene.
- Udfør komplette medieændringer hver anden dag.
- Begynd at måle cellerne 5-8 dage efter optøning. Udfør en komplet mellemændring 2 timer før eksperimenterne startes.
2. MEA-optagelser
BEMÆRK: Enheden, der bruges til at omdanne FP-signalet til liAP, består af et opretstående mikroskop og en 1064 nm laser.
- Placer MEA-systemet oven på enheden med MEA-chipholderen centreret over målhullet. Placer MEA-opsætningen, så målet er direkte under hullet i MEA-systemet, så laseren kan fokusere på elektroderne.
- Overfør MEA-chippen med de dyrkede celler fra inkubatoren til MEA-opsætningen 15 minutter før optagelse, så cellerne kan komme sig efter den mekaniske forstyrrelse.
- Rengør kontaktpuder og stifter omhyggeligt ved hjælp af isopropanol og en vatpind for at reducere støjniveauet. Placer MEA omhyggeligt i MEA-opsætningen. Placer MEA-chippen med logoet nederst øverst til venstre (6-brønds MEA) eller med referenceelektroden til venstre (enkeltbrønds MEA).
- Indstil den systemintegrerede opvarmning til 38 °C. Placer et lille kammer oven på MEA-chippen for konstant at perfusere cellerne med befugtet karbogen (5% CO2 og 95% O2) for at genskabe inkubatorforhold og forhindre fordampning.
- Luk låget på enheden. Den integrerede sikkerhedsafbryder gør det kun muligt at aktivere laseren, hvis låget er lukket over MEA-chippen. Indstil MEA-systemfilteret ved hjælp af MEA-konfigurationsprogrammet til 0,1 Hz eller mindre højpas og 3,500 Hz lavpas.
- Brug MC_Rack-softwaren (optagelsessoftware) eller enhver alternativ software til optagelse. Juster indgangsområdet efter dine behov, så du sikrer, at signalet ikke mætter forstærkeren og samplingshastigheden (f.eks. 20 kHz). Brug softwarens langsigtede displayfunktion til at kontrollere optagelsen.
3. Laserinduceret celleporation
- Når du har indsat MEA-chippen i MEA-opsætningen og konfigureret softwaren, initialiseres lasermekanikken ved hjælp af FB Alps-softwaren (initialiseringssoftware).
- Klik først på initialiseringsknappen . I slutningen af initialiseringen vil det virtuelle laserpunkt være i godt D for henholdsvis en 6-brønds MEA og nederst til venstre for en enkeltbrønd MEA.
- Flyt det virtuelle laserpunkt med Ctrl + museklik ind i midten af elektrode D5, og juster fokus. Juster fokus ved at Ctrl + rulle med musehjulet.
- Tryk på knappen Indstil P1. Det virtuelle laserpunkt bevæger sig automatisk ind i brønden F. Gentag processen med elektroden F5, og vælg Indstil P2.
- Efter denne procedure bevæger laserpunktet sig ind i brønd B. Gentag den samme proces med elektrode B5, og tryk på Set P3 i softwaren. Systemet er nu justeret.
- Juster lasereffekten og procestiden i henhold til dine cellers behov. Her blev der brugt 40% effekt og 25% procestid.
- For at aktivere laseren skal du klikke på knappen Laser Off , som derefter vises som laser tændt. Skift til optagelsessoftwaren, vælg et filnavn, og klik på Rød optagelse knappen efterfulgt af Leg knappen øverst i vinduet for at optage målingen.
- Optag en basislinje på 60 s, før cellerne åbnes med laseren. Skift tilbage til initialiseringssoftwaren.
- Deaktiver elektroder, der skal udelukkes af laseren på det virtuelle kort i højre side ved hjælp af Ctrl + museklik. Vælg de elektroder af interesse ved at aktivere dem på arrayrepræsentationen i højre side af softwarevinduet.
- For at starte laseren skal du bruge Alt + museklik og vælge centerelektroden i denne brønd. Dette initierer laseren til automatisk at åbne cellerne på hver elektrode i denne brønd. Gentag for hver brønd. Laseren åbner derefter automatisk alle de tidligere aktiverede elektroder i den valgte brønd.
4. Håndtering og anvendelse af lægemidler
- Forbered alle stoffer, der skal bruges til lægemiddeltest frisk på dagen for målingerne. Sørg for, at koncentrationen af den endelige påføring er 10 gange højere i medium for at foretage en fortynding på 1:10 i brøndene.
- Nifedipin opløses E4031 og Dofetilid først i DMSO i mM-koncentration og derefter yderligere i medium til 10x af den ønskede koncentration. Overskrid aldrig en endelig DMSO-koncentration på 0,1% i brønden.
- Registrer den oprindelige aktivitet for 60 s. Start den laserinducerede poration som beskrevet i trin 3 i protokollen, hvilket resulterer i en omdannelse af FP til liAP-form.
- Påfør alle lægemidlerne som enkeltkoncentration-per-brønd. Fjern henholdsvis 20 μL medium pr. brønd for 6-brønds MEA'er og 100 μL for enkeltbrønds-MEA'er. Tilsæt 20 μL eller 100 μL, afhængigt af MEA-typen, af stamopløsningen af lægemidlet, der skal måles, til brønden og pipetterer forsigtigt op og ned 2-3 gange. Udfør mindst tre replikationer af hvert lægemiddel og koncentration for at opnå statistisk relevans.
- Lad forbindelserne vaske ind i 300 s. I løbet af denne tid kan liAP-formen omdannes tilbage til FP-form. Igen induceres laserinduceret poration og registreres mulige sammensatte inducerede virkninger på liAP i yderligere 60 s.
5. Eksport af data
- Vælg relevante elektroder ved at afspille optagelsen igen i optagelsessoftwaren. Brug MC_DataTool til at konvertere MC_Rack filer til ASCII .txt filer.
- Klik på File > Åbn MCD > Vælg en MC_Rack fil. Klik på txt-knappen (blå tekst).
- Vælg en elektrode. Den valgte elektrode vises på listen i højre side.
- Klik på Gennemse for at vælge mappen og ændre navnet på den nye .txt-fil. Klik på Gem.
- Fjern markeringen af den eksporterede elektrode, og vælg den næste elektrode, der skal eksporteres. Gentag proceduren for alle elektroder af interesse.
6. Datahåndtering og statistisk analyse
- Importer konverterede binære spor til R19. Visualiser/analyser dataene ved hjælp af skræddersyede scripts, der indeholder følgende pakker: dplyr, tidyr og ggplot220,21,22.
Representative Results
Registreringssystemet, der blev brugt til at registrere elektrisk aktivitet fra dyrkede kardiomyocytter, bestod af et standard MEA-system udstyret med en varmelegeme og et kammer til carbogen fastgjort til en computer. Systemet blev sat oven på den intracellulære optageenhed, som igen blev monteret oven på en lille antivibrationsenhed (figur 1A-B).
iPSC-afledte kardiomyocytter 2 begyndte at slå spontant inden for 2-3 dage efter optøning (dage in vitro, DIV) og var synlige under et mikroskop. Fra DIV 4 og fremefter blev slagfrekvensen regelmæssig, og ekstracellulære feltpotentialer (FP) med peak-to-peak amplituder af den depolariserende komponent mellem 1 og 5 mV kunne detekteres på de fleste elektroder inden for de respektive brønde i MEA-chipsene. Den elektriske aktivitet kunne påvises i mere end 95% af de undersøgte brønde. Fra DIV 7 og fremefter steg sandsynligheden for celleløsning, hvilket gjorde yderligere brug af disse brønde umulig.
Softwaren til styring af den laserinducerede membranåbning gør det muligt at justere både effekten og procestiden for laseren, der kun formidler åbningen af cellemembranen på den undersøgte elektrode (figur 1C), mens andre elektroder i den respektive brønd er upåvirket. Mens for konservative indstillinger ikke ændrede bølgeformen af FP, resulterede for høje indstillinger i den formodede skade på kardiomyocytterne, indikeret ved kraftig, men forbigående slag eller tab af signalet. Når den blev justeret til en indstilling på 40% effekt og 25% procestid, der tolereres godt af cellerne, resulterede udløsning af laserpulsen i flere ændringer i den registrerede bølgeform (se figur 1D for en eksemplarisk optagelse). Under disse forhold blev der ikke observeret nogen ændring af elektrodematerialet. Den optagede signalamplitude steg massivt med 4,1 ± 0,41 (n = 20, interval 1,34-8,83) gange, analyseret fra en tilfældigt udvalgt delmængde af optagelser, hvilket resulterede i amplituder mellem 7 og 22 mV. Desuden transformerede bølgeformen fra en standard FP-form med hurtig, bifasisk og forbigående spændingsafbøjning i begyndelsen efterfulgt af en plateaufase tilbage ved baseline og en lille afbøjning, der angiver slutningen af FP til en form, der var tættere på en intracellulært registreret AP med en hurtig stigning, udvidet depolariseret plateaufase og en repolariseringsfase med en underskydning under basislinjen (figur 1E ). Vi definerede disse spændingsafbøjninger som laserinduceret AP (liAP). I de fleste tilfælde var overgangen forbigående og i det mindste delvist omvendt inden for 5 minutter. Signaludbredelsen i hjertesynkytium forblev uændret efter liAP-induktion (figur 2), hvilket indikerer, at det resterende syncytium ikke blev påvirket af potentiel skade fra laserpulsen.
Ligheder med intracellulært registrerede AP'er tillod udtrækning af parametre for liAP, der ikke er tilgængelige for FP'er (for eksemplariske parametre se f.eks. figur 3A), mest fremtrædende måling af varigheden af liAP på bestemte tidspunkter (f.eks. ved 20%, 50% og 90%) (figur 3B), analog med APD20/50/90, der almindeligvis anvendes til beskrivelse af AP'er.
Vi testede derefter responsen fra de laseråbnede kardiomyocytter på almindeligt anvendte kardioaktive farmakologiske værktøjsforbindelser. Et eksemplarisk protokoldesign findes i figur 3C. Da transformationen af liAP ikke altid varede ved gennem hele eksperimentet, blev den sammensatte applikation udført som en enkelt koncentration pr. brønd snarere end på en kumulativ måde for at reducere den samlede registreringstid. Ikke desto mindre var det nødvendigt enten at genåbne cellerne eller åbne et andet elektrodeområde inden påføring af testforbindelsen.
Tilføjelsen af den specifikke L-type Ca 2+ kanalblokker, Nifedipin23,24, reducerede plateaufasen af liAP på en koncentrationsafhængig måde og forkortede derved hele liAP (figur 4A,B). Denne forkortelse var sammenlignelig med analysen opnået fra FP'er af kardiomyocytter fra umanipulerede elektroder (figur 4C), hvilket indikerer, at denne optagelsesmetode ikke havde negative virkninger sammenlignet med klassiske FP-optagelser.
E4031 hæmmer repolariseringen af relevant Kv1.11 (hERG) kaliumkanal25 og fører til arytmisk opførsel af kardiomyocytter ved øgede koncentrationer. I lighed med analysen opnået fra FP-optagelser øgede E4031 liAP-varigheden på en koncentrationsafhængig måde (figur 5). Derudover var små positive spændingsafbøjninger i slutningen af liAP synlige ved koncentrationer på 0,01 μM og højere. Disse afbøjninger blev mere fremtrædende med højere koncentrationer, hvilket indikerer en forbigående ny depolarisering, i modsætning til i FP'erne, hvor disse afbøjninger var næsten usynlige (se figur 5B-C, øvre (FP) vs nedre (liAP) spor). Denne adfærd er kendt som tidlig efterdepolarisering (EAD). Ved den højeste koncentration på 0,1 μM eskalerede disse EAD'er over tid til ektopiske slag, som er for tidlige handlingspotentialer (figur 5C). Både EAD og ektopiske beats er nøgleindikatorer for proarytmisk aktivitet. I slutningen af eksemplet vist i figur 5D resulterede den elektriske aktivitet i arytmisk slag. Også koncentrations-respons-relationer, der blev vist mellem FP- og liAP-optagelser, matchede (figur 5E). Der er imidlertid større variation i FP-dataene som følge af den svage repolariseringskomponent i FP'erne ved højere koncentrationer af testforbindelsen. Det ser ud til at være den karakteristiske karakter af iPSC-afledte kardiomyocytter2 at have tendens til at generere ufysiologisk lange AP'er også under kontrolforhold (AP-varigheder > 700 ms). MEA-systemet anvendte en iboende 0,1 Hz AC-filtrering, hvilket igen resulterede i en delvist filtreret form af liAP, dog uden at okkludere de kvalitative oplysninger om begyndelsen og afslutningen af den underliggende AP.
Det viste sig, at den oprindelige forekomst af proarytmiske spændingsafbøjninger kunne detekteres ved lavere koncentrationer i liAP'er sammenlignet med FP-optagelser. Vist i figur 6 er registreringen af elektrisk aktivitet under påføring af dofetilid i en koncentration på 3 μM. Optagelsen blev opnået i samme brønd. Selvom både FP og liAP viste varigheder på ca. 2 s, var FP-bølgeformen diskret og præsenterede regelmæssige repolariserende afbøjninger. Samtidig blev EAD'er i forskellige størrelser synlige i slutningen af liAP'er. Denne stigning i relevant sikkerhedsfarmakologisk følsomhed understøtter yderligere konstateringen af, at liAP'er induceret af overfladeplasmonresonans muliggør forbedret kvalificering af den repolariserende fase og derved hjælper med at lære mere om virkningsmåden for de testforbindelser, der undersøges.
Figur 1: Den intracellulære optagelsesopsætning og eksemplariske optagelser . (A) Oversigt over opsætning. (B) Øverste visning af optagesystemet med åben MEA-optageforstærker. (C) Initialiseringssoftware med det virtuelle MEA-kort på højre side. 1: antivibrationstabel, 2: intracellulært optagesystem, 3: laserbeskyttelseslåg, 4: befugtet karbogskammer, 5: MEA-varmesystem, 6: MEA-interfacekort, 7: 1-brønds MEA-chip inde i optageforstærkeren. (D) Registrering af eksempler fra en elektrode før og efter induktion af liAP'er. Øverst: optagelse på ca. 6 min. Stiplede linjer markerer de udvidede områder, der vises nederst. (E) Forstørret FP (øverst) og liAP (nederst). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Signaludbredelsesmønsteret forbliver bevaret efter liAP-induktion. Falsk farvekodning af signaludbredelsen af excitationsbølgen i syncytium. Blå angiver tidligt (starter ved -4 ms); rød angiver sene tidspunkter (+3 ms) fra signalet opnået ved referenceelektrode E54 som angivet med farvebjælken. Signalet bevæger sig fra øverst til højre til nederst til venstre for elektrodearrayet. (A) Før liAP-induktion, (B) 1 minut efter liAP-induktion. (C) 4 minutter efter liAP-induktion. Flash-symbolet angiver laserinduktionspunktet ved elektrode 64. Bemærk, at der ikke er nogen forskel i den samlede udbredelsesretning. Sorte rektangler angiver ugyldige data. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: FP/liAP-parameterdefinition og registreringsprotokol . (A) Parametre, der kan udvindes fra den klassiske FP. (B) Yderligere parametre, der kan fås fra liAP'er. (C) Tidslinje for lægemiddelmåling. Fra venstre mod højre: kontroloptagelse for 60 s, induktion af liAP, optagelse af liAP for 60 s, lægemiddelapplikation, indvaskningstid 300 s, geninduktion af liAP, optagelse af liAP for 60 s. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Nifedipin forkorter hjerte-liAP på en koncentrationsafhængig måde. (A) Øverst: FP-spor ved kontrol (blå) og i nærværelse af 0,3 μM Nifedipin (rød). Spor vises med en y-akseforskydning for bedre visualisering. Nederst: liAP-spor fra den samme MEA-optagelse, hvilket resulterer i en forkortelse af liAP kombineret med en stigning i beathastigheden. (B) Superposition af enkelte liAP'er under kontrol (blå) og anvendelse af forskellige koncentrationer af nifedipin (rød). a: 0,01 μM, b: 0,1 μM og c: 0,3 μM. Bemærk forkortelsen af liAP-varigheden med stigende koncentrationer. (C) Koncentrations-respons-forholdet mellem signalbredde opnået fra FP (sort) og liAP (rød) optagelser. Data er fra n = 3 eksperimenter og normaliseret til kontrol. Fejllinjer angiver standardfejlen for middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: E4031 inducerer (pro-) arytmisk adfærd. (A) FP (øverst) og liAP (nederst) ved kontrolforhold. (B-C) FP'er og liAP'er blev registreret på forskellige tidspunkter efter anvendelse af E4031 (0,1 μM). Efter 80 s er de første EAD'er synlige i slutningen af liAP (B; markeret med en rød pil). EAD'er konverteres til ektopiske slag efter 320 s i nærværelse af testforbindelsen (C). (D) Efter 530 s går hjertesynkytium ind i en takykardisk tilstand. Spor afbildet fra liAP-optagelse. (E) Koncentrations-respons-forholdet mellem FP (sort) og liAP (rød) bredde. Data fra n = 4 eksperimenter, normaliseret til kontrol. Fejllinjer angiver standardfejlen for middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Påvisning af proarytmiske hændelser er mere følsom i liAP'er end FP'er . (A) FP-optagelse og (B) liAP-optagelse inden for samme brønd under anvendelse af 3 μM Dofetilid. Mens EAD'er i slutningen af nogle liAP'er kan påvises, forbliver de uopdagelige i FP-optagelser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne innovative metode demonstrerer en ny måde at undersøge in vitro den farmakologiske modulering af hjertevirkningspotentialet under anvendelsen af kardioaktive farmakologiske værktøjsforbindelser.
Klassiske MEA-optagelser tillader FP-optagelser, som er afledt af hjerte-AP14. Denne indirekte registrering forvirrer tidsforløbet for de- og repolariseringen og eliminerer derved væsentlige egenskaber ved AP. Selvom den transcellulære spændingsændring af en AP typisk når værdier på ca. 100 mV, forbliver den samlede FP-amplitude sammenlignelig lav med spidsamplituder mellem flere 100 μV og lave encifrede mV-værdier. På grund af optagelsesprincippet er den repolariserende fase lille; i mange tilfælde er det blot påviseligt og ofte af uklar form, hvilket gør det vanskeligt at definere afslutningen på rammeprogrammet. Åbningen af cellemembranen giver os mulighed for at få adgang til den intracellulære spænding og derved afdække hjerte-AP's tidsforløb. Der er flere fordele ved denne optagelsesmetode sammenlignet med FP-optagelser. For det første er signalamplituden mere fremtrædende, hvilket giver et overlegent signal-støj-forhold. For det andet resulterer bølgeformen i bedre påvisning af repolariseringen. For det tredje bidrager formen af repolariseringsfasen med indsigt i testforbindelsens virkningsmåde, der tilvejebringes af signalafslapningens stejlhed. Og endelig giver denne metode en forbedret følsomhed til at detektere kritiske bivirkninger, hvilket fremgår af optagelseseksemplet vist i figur 6 for forekomsten af EAD'er i liAP, men ikke i FP.
Indtil videre er der to måder at få adgang til den intracellulære AP. Den første opnås ved elektroporation26,27. Her kan korte og stærke spændingsimpulser, der påføres via optageelektroderne, åbne cellemembranen28. Den anden mulighed er membranåbningen via en laserpuls, der gør brug af et fysisk fænomen ved navn overfladeplasmonresonans, som demonstreret her. En af fordelene i forhold til elektroporation er den øgede sandsynlighed for på hinanden følgende åbninger. På grund af den meget fokuserede laserplet (1-3 μm) er denne effekt meget lokalt begrænset til elektroden af interesse. Interessant nok ændrede indledningen af liAP ikke signaludbredelsen af det dyrkede syncytium. Dette indikerer, at selvom celleintegriteten er beskadiget, synes kardiomyocytterne ikke at depolarisere via hullet i membranen.
Der er begrænsninger for denne metode. Ligesom med elektroporation varer membranåbningen i de fleste tilfælde ikke over hele eksperimentalforløbet. De minimale effekt- og varighedsindstillinger for laserpulsen, der kræves for stabil åbning af den specifikke celletype af interesse, skal defineres uafhængigt inden forsøgene. Vi fandt (ikke vist), at parametrene varierer drastisk mellem forskellige celletyper (i vores tilfælde flere hiPS-afledte og primære kardiomyocytter). Dette undgår unødvendig stress på cellerne under det sammensatte testeksperiment og resulterer i mere pålidelige og reproducerbare data. Det er af afgørende betydning at justere z-aksen for at give et klart fokus på cellerne og elektroderne. Et ufokuseret kamerabillede giver efter i et laserpunkt placeret på et suboptimalt niveau, hvilket potentielt resulterer i manglende evne til at åbne cellemembranen. Selv med de bedst justerede parametre er liAP-effekten forbigående, og amplituden reduceres over tid. Desuden varierer adgangen til cellernes intracellulære rum mellem liAP-induktioner, både inden for på hinanden følgende åbninger ved samme elektrode og mellem elektroder. Dette resulterer i høj variabilitet af liAP-amplituden. Årsagen er endnu ikke fuldt ud forstået. Mulige forklaringer inkluderer mekaniske problemer såsom en drift af laserfokus eller forskellig subcellulær lokalisering af membranåbningen. Dette gør analysen af amplitudeeffekter af testforbindelser kompliceret på dette tidspunkt. Registrering af elektrisk aktivitet af et MEA-system kræver også filtrering med højt pass for at kompensere for uundgåelig baseline-drift. Selvom denne filtrering i det system, der blev brugt her, var indstillet til 0,1 Hz (den laveste filterindstilling, der var tilgængelig for dette system), var filtreringseffekter under plateaufasen stadig synlige, hvilket resulterede i en langsom tendens til spændingsafbøjningen mod basislinjen under plateaufasen af hjerte-AP. Dette er især problematisk med meget lange underliggende AP'er som de iPSC-afledte iCell-kardiomyocytter2 , der anvendes her, som allerede genererer AP >700 ms under kontrolforhold. Brugen af systemer med lavere filtrering kan bedre bevare formen på AP og give endnu bedre adgang til tidsforløbet af repolariseringsfasen.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Foresee Biosystems for at låne IntraCell-systemet under undersøgelserne. De vil også gerne takke Hae In Chang for teknisk assistance. Dette arbejde har modtaget støtte fra EU's Horizon 2020's forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 964518 (ToxFree), fra EU Horizon Europe European Innovation Council Programme, projekt SiMulTox (tilskudsaftale nr. 101057769) og fra statsministeriet i Baden-Württemberg for økonomi, arbejde og turisme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890301 | |
| 6 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 7600069 | |
| DMSO | Merck KGaA | 20-139 Sigma-Aldrich |
solvent for drugs |
| Dofetilide | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
D-100 | Drug-Measurement |
| dPBS | Fisher Scientific GmbH | 12037539 | Coating |
| E4031 | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
E-500 | Drug-Measurement |
| Falcon | Fisher Scientific GmbH | 10788561 | |
| FB Alps version 0.5.005 | Foresee Biosystems | ||
| Fibronectin | Merck KGaA | 11051407001 | Coating |
| iCell cardiomyocytes | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
C1016 | |
| IntraCell | Foresee Biosystems | ||
| Isopropanol | Carl Roth GmbH + Co. KG | CN09.1 | For cleaning of MEA contact pads |
| Maintenance Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
#M1003 | For cell-culture |
| MC_Data Tool | Multi Channel Systems MCS GmbH | Data export | |
| MC_Rack | Multi Channel Systems MCS GmbH | MEA recording | |
| MEA 2100 - 2x60 - system | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890485 | For MEA-recordings |
| Nifedipine | Merck KGaA | N7634 Sigma-Aldrich |
Drug-Measurement |
| Plating Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
M1001 | For cell-culture |
| Tergazyme | VWR International, LLC | 1304-1 | cleaning of MEAs |
References
- Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. Molecular basis of arrhythmias. Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).
- Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk. Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).
- Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. Role of hERG potassium channel assays in drug development. Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).
- Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. Cardiac arrhythmia. Scholarpedia. 3 (7), 1665 (2008).
- Tisdale, J. E., et al. Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).
- Kramer, J., et al. MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes. Scientific Reports. 3, 2100 (2013).
- Rampe, D., Roy, M. -L., Dennis, A., Brown, A. M. A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG. FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).
- Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).
- Ronzhina, M., et al. Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart. Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).
- Beck, C., Gong, Y. A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity. Scientific Reports. 9 (1), 15878 (2019).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Kovacs, G. T. A. Electronic sensors with living cellular components. Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).
- Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).
- Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes. Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).
- Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).
- Dipalo, M., et al. Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes. Science Advances. 7 (15), (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing: R Foundation for Statistical Computing. , Vienna Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2021).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Springer-Verlag. New York. (2009).
- Wickham, H., Girlich, M. tidyr: Tidy messy data: R package version 1.2.0. , Available from: https://tidyr.tidyverse.org (2022).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A grammar of data manipulation. R package version 1.0.6. , Available from: https://tidyr.tidyverse.org (2021).
- Godfraind, T. Discovery and development of calcium channel blockers. Frontiers in Pharmacology. 8, 286 (2017).
- Vater, W., et al. Pharmacology of 4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester (Nifedipine, BAY a 1040). Arzneimittelforschung. 22 (1), 1-14 (1972).
- Kim, I., Boyle, K. M., Carroll, J. L. Postnatal development of E-4031-sensitive potassium current in rat carotid chemoreceptor cells. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1469-1477 (2005).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Fendyur, A., Spira, M. E. Toward on-chip, in-cell recordings from cultured cardiomyocytes by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Frontiers in Neuroengineering. 5, 21 (2012).
- Hayes, H. B., et al. Novel method for action potential measurements from intact cardiac monolayers with multiwell microelectrode array technology. Scientific Reports. 9 (1), 11893 (2019).
