Summary

Einfache kontinuierliche Glukosemessung bei frei beweglichen Mäusen

Published: February 24, 2023
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Summary

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, um Mäusen ein kommerzielles kontinuierliches Glukosemessgerät zu implantieren, das für Patienten entwickelt wurde, und stellen die Skripte zur Analyse der Ergebnisse zur Verfügung.

Abstract

Mäuse sind ein weit verbreiteter Modellorganismus, der zur Untersuchung von Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes mellitus verwendet wird. Der Glukosespiegel wird in der Regel durch Schwanzbluten gemessen, was den Umgang mit den Mäusen erfordert, Stress verursacht und keine Daten über sich frei verhaltende Mäuse während des Dunkelzyklus liefert. Eine hochmoderne kontinuierliche Glukosemessung bei Mäusen erfordert das Einführen einer Sonde in den Aortenbogen der Maus sowie ein spezielles Telemetriesystem. Diese anspruchsvolle und teure Methode wurde von den meisten Laboren nicht übernommen. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll vor, bei dem kommerziell erhältliche kontinuierliche Glukosemessgeräte verwendet werden, die von Millionen von Patienten zur kontinuierlichen Messung der Glukose in Mäusen als Teil der Grundlagenforschung verwendet werden. Die Glukosesensorsonde wird durch einen kleinen Hautschnitt in den Unterhautraum im Rücken der Maus eingeführt und mit ein paar Nähten fest an Ort und Stelle gehalten. Das Gerät wird mit der Maushaut vernäht, um sicherzustellen, dass es an Ort und Stelle bleibt. Das Gerät kann den Glukosespiegel bis zu 2 Wochen lang messen und sendet die Daten an einen Empfänger in der Nähe, ohne dass die Mäuse angefasst werden müssen. Skripte für die grundlegende Datenanalyse der aufgezeichneten Glukosewerte werden zur Verfügung gestellt. Diese Methode, von der Operation bis zur computergestützten Analyse, ist kostengünstig und potenziell sehr nützlich in der Stoffwechselforschung.

Introduction

Diabetes mellitus (DM) ist eine verheerende Krankheit, die durch einen hohen Blutzuckerspiegel gekennzeichnet ist. DM Typ 1 kann die Folge eines Autoimmunangriffs auf die insulinproduzierenden Betazellen in der Bauchspeicheldrüse sein. DM Typ 2 und DM in der Schwangerschaft hingegen sind dadurch gekennzeichnet, dass die Betazellen als Reaktion auf einen Anstieg des Glukosespiegels nicht genügend Insulin ausschüttenkönnen 1. Die Maus ist ein häufiger Modellorganismus, der zur Untersuchung von DM verwendet wird, da sie eine ähnliche Physiologie aufweist und ihre normalen Glukosewerte denen des Menschen nahe kommen. Darüber hinaus können bestimmte Mausstämme aufgrund von Mutationen in wichtigen Signalwegen oder nach der Exposition gegenüber bestimmten Diäten DM entwickeln, was eine Krankheitsmodellierung ermöglicht 2,3,4.

Der Blutzucker wird üblicherweise bei Mäusen mit Blutzuckermessgeräten gemessen, die für Patienten entwickelt wurden, indem ein kleiner Blutstropfen (1-2 μl) aus der Schwanzspitze der Maus entnommen wird. Diese Methode verursacht Stress und erfordert den Umgang mit der Maus, was sich auf den Glukosespiegel auswirkt und die Messung des Blutzuckerspiegels bei sich frei verhaltenden Mäusen oder wenn der Forscher nicht in der Nähe ist, verbietet5. Das Ausbluten der Mäuse kann bei Mäusen in der Nähe Stress verursachen, insbesondere bei Mäusen desselben Käfigs, deren Glykämie noch nicht gemessen wurde, was die Ergebnisse beeinträchtigt. Mäuse reagieren je nach Handler unterschiedlich, und die Person, die Glukose misst, kann den Glukosespiegel der Mäuse beeinflussen. Diese Fallstricke erfordern eine sorgfältige Versuchsplanung und unterliegen einigen Inkonsistenzen zwischen den Experimenten.

Es ist möglich, die Glukose in frei beweglichen Mäusen ohne Blutung zu messen, indem Glukosesensoren mit Hilfe modernster Telemetrie in den Aortenbogen der Mäuse implantiertwerden 6. Die daraus resultierenden Messungen sind sehr gut und können über einen langen Zeitraum aufrechterhalten werden, aber es ist eine Herausforderung, diese Sensoren zu implantieren, und das Telemetriesystem ist teuer, was zu einer moderaten Einführung dieser Methodik und keiner Akzeptanz in nicht spezialisierten Labors führt. In den letzten Jahren wurden subkutane oder andere Glukosesensoren entwickelt, die auf die Abmessungen der Mäuse und ihre Physiologie zugeschnitten sind, aber auch diese erfordern hochqualifizierte Experten und sind in einigen Fällen kostspielig 6,7,8,9,10.

Kommerzielle kontinuierliche Glukosemessgeräte (CGMs), die ursprünglich zur Überwachung des Glukosespiegels von DM-Patienten entwickelt wurden, bieten eine weitere Möglichkeit, die Glukose in frei beweglichen Mäusen zu messen, und zwar mit geringeren Kosten und technischem Know-how als implantierte Sonden. Solche Sonden wurden in der Grundlagenforschung von einigen Laborsverwendet 5,11,12,13,14,15, einschließlich unserer Kollegen, die dieses Protokoll verwendeten 16. Diese Geräte umfassen in der Regel einen Sensor, eine Montagevorrichtung, einen Empfänger und eine Softwareanwendung. Der Sensor verfügt über eine Kanüle, die den enzymatischen Glukosesensor führt, Klebeband, eine Energiequelle, ein Kurzzeitgedächtnis und ein drahtloses Kommunikationsmodul, das die Daten speichert und an den Empfänger sendet. Der Empfänger kann den aktuellen Glukosespiegel anzeigen und sendet die Daten an einen Server. Bei diesem Empfänger kann es sich um ein Mobiltelefon handeln. Die Softwareanwendung liefert dem Patienten und dem medizinischen Versorgungsteam Daten über den Blutzucker des Patienten. Bei Patienten wird der Sensor einfach über die Halterung befestigt. Die Kanüle wird subkutan eingeführt, indem die Halterung gegen die Haut gedrückt wird, und der Sensor bleibt mit Hilfe von Klebeband an Ort und Stelle.

Dabei handelt es sich um ein detailliertes Protokoll zur Anpassung eines kommerziellen CGM-Geräts zur Messung des Glukosespiegels bei Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt, wie der Glukosesensor chirurgisch eingeführt und an der Maus befestigt wird. Skripte für die grundlegende Datenanalyse und Datenvisualisierung werden bereitgestellt. Die potenziellen Fallstricke, die Fehlerbehebung und Beispiele für Standardergebnisse werden bereitgestellt. Das folgende Protokoll ist spezifisch für ein bestimmtes CGM, kann aber leicht an andere Arten von kommerziellen CGMs angepasst werden, sobald diese verfügbar sind.

Protocol

Die Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Hebräischen Universität genehmigt. Anmerkungen: Alle Werkzeuge müssen sterilisiert sein und die Handhabung der Kanüle muss steril erfolgen. Das folgende Protokoll ist auf ein bestimmtes CGM abgestimmt. Das Protokoll kann an andere CGMs angepasst werden. 1. Verabreichung von Analgetika vor dem Eingriff Verabreichen Sie 5 % Dextrose und 0,45 % Kochsalzlös…

Representative Results

Chirurgisches ErgebnisEs werden Ergebnisse von acht HSD:ICR-Mäusen (im Alter von 8 Wochen) gezeigt, die 18 Wochen lang mit einer fettreichen High-Saccharose-Diät (HFHS) gefüttert wurden, und von fünf mageren HSD:ICR-Mäusen (im Alter von 12 Wochen). Das von uns verwendete Gerät speichert Daten bis zu 8 h. Der Zugang zur örtlichen Tieranlage war auf 07:00-19:00 Uhr beschränkt, so dass die Datenerfassung in den späten Nachmittagsstunden, wenn die Mäuse aktiv sind, verboten war. Die Mäuse wurd…

Discussion

Dieses Protokoll bietet eine einfache, kostengünstige Methode zur Überwachung des Glukosespiegels bei Mäusen, die keine herausfordernde Mikrochirurgie erfordert und keine Blutungen oder den Umgang mit den Mäusen beinhaltet. Die Methode ist in jeder Einrichtung einfach anzuwenden und verursacht bei den Mäusen keine Sterblichkeit, Schmerzen oder übermäßige Beschwerden. Der kritischste Schritt des Protokolls ist das Einführen der Kanüle des Glukosesensors unter die Haut der Maus. Durch das Hinzufügen einiger Näh…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dvir Mintz DVM und dem Veterinär- und Haltungspersonal in der Tierhaltung sowie den Mitgliedern unserer Gruppe für die fruchtbaren Gespräche. Diese Studie wurde durch ein Stipendium der Israel Science Foundation 1541/21 unterstützt, das an D.B.Z. D.B.Z. ist eine Zuckerman-MINT-Fakultät.

Materials

2%  Chlorhexidine Gluconate and 70%  Isopropyl Alcohol 3M ID 7000136290
5% Dextrose and 0.45% Sodium Chloride Injection, USP Braun L6120
Castroviejo needle holder FST 12061-02
Extra Fine Bonn scissors FST 14084-08
FreeStyle Libre 1 reader Abbott ART27543 
FreeStyle Libre sensor Abbott ART36687
FreeStyle Libre sensor applicator Abbott ART36787
Gauze pads Sion medical PC912017
Graefe Forceps FST 11052-10
Hair Removal Cream Veet 3116523
High-fat high-sucrose diet Envigo Teklad diets TD.08811
Isoflurane, USP Terrell Piramal 26675-46-7
Meloxicam 5 mg/mL Chanelle Pharma 08749/5024
MiniARCO Clipper kit Moser CL8787-KIT
PROLENE Polypropylene Suture 5-0 Ethicon 8725H
Puralube Opthalmic Ointment Perrigo 574402511
Q-tips  B.H.W 271676
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific SOMNO

Referenzen

  1. Polonsky, K. S. The past 200 years in diabetes. New England Journal of Medicine. 367 (14), 1332-1340 (2012).
  2. Rees, D. A., Alcolado, J. C. Animal models of diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 22 (4), 359-370 (2005).
  3. Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the non-obese diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
  4. Heydemann, A. An overview of murine high fat diet as a model for Type 2 diabetes mellitus. Journal of Diabetes Research. 2016, 2902351 (2016).
  5. Kennard, M. R., et al. The use of mice in diabetes research: The impact of experimental protocols. Diabetic Medicine. 38 (12), 14705 (2021).
  6. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technology and Therapeutics. 8 (3), 402-412 (2006).
  7. Wuyts, C., Simoens, C., Pinto, S., Philippaert, K., Vennekens, R. Continuous glucose monitoring during pregnancy in healthy mice. Scientific Reports. 11, 4450 (2021).
  8. Korstanje, R., et al. Continuous glucose monitoring in female NOD mice reveals daily rhythms and a negative correlation with body temperature. Endocrinology. 158 (9), 2707-2712 (2017).
  9. Han, B. G., et al. Markers of glycemic control in the mouse: Comparisons of 6-h-and overnight-fasted blood glucoses to Hb A1c. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 295 (4), 981-986 (2008).
  10. Xie, X., et al. Reduction of measurement noise in a continuous glucose monitor by coating the sensor with a zwitterionic polymer. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 894-906 (2018).
  11. Van Der Meulen, T., et al. Urocortin3 mediates somatostatin-dependent negative feedback control of insulin secretion. Nature Medicine. 21 (7), 769-776 (2015).
  12. Peterson, Q. P., et al. A method for the generation of human stem cell-derived alpha cells. Nature Communications. 11, 2241 (2020).
  13. Klueh, U., Liu, Z., Feldman, B., Kreutzer, D. Interstitial fluid physiology as it relates to glucose monitoring technologies: Importance of Interleukin-1 and Interleukin-1 receptor antagonist in short-term glucose sensor function in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 4 (5), 1073 (2010).
  14. Klueh, U., Antar, O., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Role of interleukin-1/interleukin-1 receptor antagonist family of cytokines in long-term continuous glucose monitoring in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 7 (6), 1538 (2013).
  15. Klueh, U., Kaur, M., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Critical role of tissue mast cells in controlling long-term glucose sensor function in vivo. Biomaterials. 31 (16), 4540-4551 (2010).
  16. Kogot-Levin, A., et al. Mapping the metabolic reprogramming induced by sodium-glucose cotransporter 2 inhibition. JCI Insight. , 164296 (2023).

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Diesen Artikel zitieren
Kleiman, D., Littor, M., Nawas, M., Ben-Haroush Schyr, R., Ben-Zvi, D. Simple Continuous Glucose Monitoring in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (192), e64743, doi:10.3791/64743 (2023).

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