Summary

Gelatine-Methacryloyl-Hydrogel-Gerüste: Hochdurchsatz-Mikrogelherstellung, Gefriertrocknung, chemische Assemblierung und 3D-Bioprinting

Published: December 09, 2022
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Summary

Dieser Artikel beschreibt Protokolle für die Herstellung von Gelatine-Methacryloyl-Mikrogelen mit hohem Durchsatz unter Verwendung mikrofluidischer Geräte, die Umwandlung von Mikrogelen in resuspendierbares Pulver (Mikroaerogele), die chemische Anordnung von Mikrogelen zu körnigen Hydrogelgerüsten und die Entwicklung von körnigen Hydrogel-Biotinten mit erhaltener Mikroporosität für den 3D-Biodruck.

Abstract

Das Aufkommen von granularen Hydrogelgerüsten (GHS), die durch die Assemblierung von Hydrogel-Mikropartikeln (HMPs) hergestellt werden, hat die Bildung von mikroporösen Gerüsten in situ ermöglicht. Im Gegensatz zu herkömmlichen Bulk-Hydrogelen erleichtern miteinander verbundene mikroskalige Poren in GHS die abbauunabhängige Zellinfiltration sowie den Transfer von Sauerstoff, Nährstoffen und zellulären Nebenprodukten. Methacryloyl-modifizierte Gelatine (GelMA), ein (photo)chemisch vernetzbares, proteinbasiertes Biopolymer, das Zellklebstoff und biologisch abbaubare Einheiten enthält, wird häufig als zellresponsives/instruktives Biomaterial verwendet. Die Umwandlung von GelMA in GHS kann eine Fülle von Möglichkeiten für das Tissue Engineering und die Regeneration eröffnen. In diesem Artikel demonstrieren wir die Verfahren der Hochdurchsatz-GelMA-Mikrogelherstellung, der Umwandlung in resuspendierbare trockene Mikrogele (Mikro-Aerogele), der GHS-Bildung durch die chemische Assemblierung von Mikrogelen und der granularen Biotintenherstellung für das Extrusions-Bioprinting. Wir zeigen, wie eine sequentielle physikalisch-chemische Behandlung durch Kühlung und Photovernetzung die Bildung von mechanisch robustem GHS ermöglicht. Wenn Licht nicht zugänglich ist (z. B. während der Tiefengewebsinjektion), können individuell vernetzte GelMA-HMPs durch enzymatische Vernetzung unter Verwendung von Transglutaminasen bioorthogonal zusammengesetzt werden. Schließlich wird das dreidimensionale (3D) Bioprinting von mikroporösem GHS bei niedriger HMP-Packungsdichte über die Grenzflächen-Selbstorganisation heterogen geladener Nanopartikel demonstriert.

Introduction

Der Zusammenbau von HMP-Bausteinen zu Tissue-Engineering-Gerüsten hat in den letzten Jahren enorme Aufmerksamkeit erregt1. GHS, die durch HMP-Assemblierung hergestellt werden, haben im Vergleich zu ihren Gegenstücken einzigartige Eigenschaften, einschließlich der Mikroporosität im Zellmaßstab, die von den Hohlräumen zwischen den diskreten Bausteinen herrührt. Zusätzliche Eigenschaften wie Injektionsfähigkeit, Modularität und entkoppelte Steifigkeit von Porosität machen GHS zu einer vielversprechenden Plattform zur Verbesserung der Gewebereparatur und -regeneration2. Für die GHS-Herstellung wurden verschiedene Biomaterialien verwendet, darunter synthetische Polymere auf PEG-Basis3,4 und Polysaccharide wie Alginat5 und Hyaluronsäure 6,7. Unter den natürlich gewonnenen Polymeren ist GelMA 8,9,10,11 das gebräuchlichste proteinbasierte Biopolymer für die GHS-Herstellung, ein vernetzbares, biokompatibles, bioadhäsives und biologisch abbaubares Biomaterial 12,13.

HMPs können durch Batch-Emulgierung8, Flow-Focusing 14,15 oder Stufen-Emulgierung9,11 Mikrofluidik-Vorrichtungen, Mischen 16 oder komplexe Koazervation17,18 hergestellt werden. In der Regel gibt es einen Kompromiss zwischen dem Herstellungsdurchsatz und der HMP-Monodispersität. Zum Beispiel liefert die Mischtechnik unregelmäßig geformte und stark polydispergierte HMPs. Die Batch-Emulgierung oder komplexe Koazervation ermöglicht die Herstellung großer Mengen von polydispergierten sphärischen HMPs. Strömungsfokussierende mikrofluidische Geräte wurden verwendet, um hochgradig monodisperse Tröpfchen mit einem Variationskoeffizienten von <5% herzustellen, der Durchsatz ist jedoch signifikant gering. In mikrofluidischen Bauelementen zur Stufenemulgierung ermöglichen die hochparallelisierten Schritte die Hochdurchsatzfertigung von monodispersen HMPs19.

HMP-Bausteine aus Methacryloyl-modifizierter Gelatine (GelMA) sind thermoresponsive und (photo-)chemisch vernetzbar, was eine einfache GHS-Herstellung ermöglicht20. Beim Abkühlen unter die obere kritische Lösungstemperatur (UCST)21 (z. B. bei 4 °C) werden Tröpfchen, die eine GelMA-Lösung enthalten, in physikalisch vernetzte HMPs umgewandelt. Diese HMP-Bausteine werden dann mit äußeren Kräften (z. B. durch Zentrifugation) gepackt, um gestaute Mikrogelsuspensionen zu erhalten. Interpartikuläre Bindungen werden zwischen benachbarten HMPs durch (photo-)chemische Vernetzung hergestellt, um mechanisch robustes GHS14 zu bilden. Eine der wichtigsten Eigenschaften von GHS ist die Mikroporosität, die eine einfache Zellpenetration in vitroermöglicht 11 und ein verstärktes Einwachsen von Gewebe in vivo22. Das dreidimensionale (3D) Bioprinting von HMPs wird herkömmlicherweise unter Verwendung dicht gepackter Mikrogelsuspensionen durchgeführt, wodurch die Mikroporosität beeinträchtigtwird 23.

Wir haben kürzlich eine neuartige Klasse von granularen Biotinten entwickelt, die auf dem Grenzflächen-Nanoengineering von GelMA-Mikrogelen über die Adsorption von heterogen geladenen Nanopartikeln basiert, gefolgt von einer reversiblen Selbstorganisation von Nanopartikeln. Diese Strategie macht lose verpackte Mikrogele scherfähig und extrusionsfähig 3D-biodruckbar, wodurch die mikroskalige Porosität von additiv hergestelltem GHS11 erhalten bleibt. In diesem Artikel werden die Methoden für die Herstellung von GelMA-Tröpfchen mit hohem Durchsatz, die Umwandlung dieser Tröpfchen in physikalisch vernetzte HMPs, die Herstellung von GelMA-HMPs unter Verwendung von resuspendierbarem Pulver, die GelMA GHS-Bildung, die Herstellung von GelMA-Nano-Granulat-Biotinte (NGB) und das 3D-Bioprinting vorgestellt.

Protocol

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden. 1. GelMA-Synthese HINWEIS: Die GelMA-Synthese sollte in einem chemischen Abzug durchgeführt werden, und es sollte ständig geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) verwendet werden. 200 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 1x) von Dulbecco werden in einen Erlenm…

Representative Results

GelMA wurde durch die Reaktion von Gelatine mit MA synthetisiert, wie in Abbildung 1A dargestellt. Durch Anpassung der Reaktionsbedingungen, wie z.B. der MA-Konzentration, wurden unterschiedliche Grade der MA-Substitution erhalten. Um den Grad der MA-Substitution zu quantifizieren, wurde GelMA mittels 1-H-NMR-Spektroskopie bewertet (Abbildung 1B). Vinylfunktionelle Gruppen mit repräsentativen Peaks bei den chemischen Verschiebungen von ~5-6 …

Discussion

Gelatine und ihre Derivate sind die am häufigsten verwendeten proteinbasierten Biomaterialien für die HMP-Herstellung. Die Herausforderung des Kompromisses zwischen Durchsatz und Partikelgröße kann mit mikrofluidischen Geräten zur Stufenemulgierung überwunden werden. Diese Geräte sind in der Lage, mehr als 40 Millionen Tröpfchen pro Stunde zu bilden, mit einem Variationskoeffizienten von weniger als 5%27. In diesem Artikel haben wir die Mikrofabrikation von Tröpfchen, die GelMA-Lösungen …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei T. Pond, Spezialist für Forschungsunterstützung am Department of Chemical Engineering der Pennsylvania State University (Penn State), den Mitarbeitern des Nanofabrication Lab an der Penn State University und Dr. J. de Rutte von Partillion Bioscience für die Hilfe und Diskussion über Nanofabrikationsprozesse. A. Sheikhi bedankt sich für die Unterstützung des Materials Research Institute (MRI) und des College of Engineering Materials Matter at the Human Level Seed Grants, des Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) und des Exzellenzclusters Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program sowie des Startup-Fonds von Penn State. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde teilweise vom National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) der National Institutes of Health (NIH) unter der Auszeichnungsnummer R56EB032672 unterstützt.

Materials

1H,1H-perfluoro-1-octanol Alfa Aesar, MA, USA B20156-18 98% purity
Biopsy punch Integra Miltex, NY, USA 33-31A-P/25 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System
Blunt needle SANANTS 30-002-25 25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz 400 MHz Bruker NEO, MA, USA NMR device
Centrifuge Eppendorf, Germany 5415 C
Centrifuge tube Celltreat, MA ,USA 229423
Coffee filters BUNN, IL, USA 20104.0006 BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct
Desiccator Thermo Scientific 5311-0250 Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD
Deuterium oxide Sigma, MA, USA 151882
Dialysis membrane (12-14 kDa) Spectrum Laboratories, NJ, USA 08-667E
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) Sigma, MA, USA 56064C-10L dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture
Erlenmeyer flask Corning, NY, USA 4980 Corning PYREX 
Ethanol VWR, PA, USA 89125-188 Koptec 200 proof
External thread cryogenic vials (cryovials) Corning, NY, USA 430659
Freeze dryer Labconco, MO, USA 71042000 Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)
Gelatin powder Sigma, MA, USA G1890-5100G Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom
Glass microscope slides VWR, PA, USA 82027-788
Hotplate FOUR E'S SCIENTIFIC MI0102003 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F 
Kimwipes Fischer scientific, MA, USA 06-666
KMPR 1000 negative photoresist series Kayaku Advanced Materials, MA, USA 121619 KMPR1025 and KMP1035 are included
LAPONITE XLG BYK USA Inc., CT, USA 2344265
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma, MA, USA 900889-1G >95%
Luer-Lok connector BD, NJ, USA BD 302995 
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner SÜSS MicroTeck, German Nanofabrication device
Methacylate anhydride Sigma, MA, USA 276685-100ML contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94%
Milli-Q water Millipore Corporation, MA, USA ZRQSVR5WW electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System
Novec 7500 engineering fluid 3M, MN, USA 3M ID 7100003723
Oven VWR, PA, USA VWR-1410 1410 Vacuum Oven
Parafilm Fischer scientific, MA, USA HS234526C
Pasteur pipette VWR, PA, USA 14673-010
Petri dish VWR, PA, USA 25384-092 polystyrene
Pico-Surf Sphere Fluidics, UK C022 (5% (w/w) in Novec 7500)
Pipette VWR, PA, USA 89079-970
Pipette tips VWR, PA, USA 87006-060
Plasma cleaner chamber Harrick Plasma, NY, USA PDC-001-HP 
Polydimethylsiloxane Dow Corning, MI, USA  2065623 SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
Positive displacement pipette Microman E M100E, Gilson, OH, USA M100E
Silicon wafers UniversityWafer, MA, USA 452/1196 4-inch mechanical grade
Spatula VWR, PA, USA 231-0104 Disposable
SU-8  Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Syringe pump Harvard Apparatus, MA, USA 70-2001 PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Millipore Sigma, MA, USA 448931-10G 97%
Tygon tubings Saint-globain, PA, USA AAD04103 
UV light  QUANS Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W
Vacuum filtration unit VWR, PA, USA 10040-460 0.20 µm
Vortex Fischer scientific, USA 14-955-151 Mini Vortex Mixer

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Diesen Artikel zitieren
Ataie, Z., Jaberi, A., Kheirabadi, S., Risbud, A., Sheikhi, A. Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (190), e64829, doi:10.3791/64829 (2022).

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