Summary

Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

Das vorgeschlagene Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxin während der Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen vermieden und richtig bewertet werden kann.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind eine heterogene Population von Membranvesikeln, die von Zellen in vitro und in vivo freigesetzt werden. Ihre Allgegenwart und ihre bedeutende Rolle als Träger biologischer Informationen machen sie zu faszinierenden Studienobjekten, die zuverlässige und sich wiederholende Protokolle für ihre Isolierung erfordern. Es ist jedoch schwierig, ihr volles Potenzial auszuschöpfen, da es immer noch viele technische Hindernisse im Zusammenhang mit ihrer Forschung gibt (wie z.B. die richtige Beschaffung). Diese Studie stellt ein Protokoll für die Isolierung kleiner EVs (gemäß der MISEV 2018-Nomenklatur) aus dem Kulturüberstand von Tumorzelllinien vor, das auf differentieller Zentrifugation basiert. Das Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxinen während der Isolierung von Elektrofahrzeugen vermieden und richtig bewertet werden kann. Eine Endotoxin-Kontamination von EVs kann nachfolgende Experimente erheblich behindern oder sogar ihre wahren biologischen Auswirkungen verschleiern. Andererseits kann das übersehene Vorhandensein von Endotoxinen zu falschen Schlussfolgerungen führen. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn es um Zellen des Immunsystems, einschließlich Monozyten, geht, da Monozyten eine Population darstellen, die besonders empfindlich auf Endotoxinrückstände reagiert. Daher wird dringend empfohlen, EVs auf Endotoxinkontamination zu untersuchen, insbesondere wenn mit endotoxinempfindlichen Zellen wie Monozyten, Makrophagen, myeloischen Suppressorzellen oder dendritischen Zellen gearbeitet wird.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nach der Nomenklatur MISEV 2018 ein Sammelbegriff, der verschiedene Subtypen von zellsezernierten membranösen Vesikeln beschreibt, die bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen 1,2. Darüber hinaus sind Elektrofahrzeuge als neuartige Biomarker für verschiedene Krankheiten sowie als Therapeutika und Vehikel für die Verabreichung von Medikamenten vielversprechend. Es ist jedoch schwierig, ihr volles Potenzial auszuschöpfen, da es immer noch viele technische Hindernisse im Zusammenhang mit ihrer Anschaffunggibt 3. Eine solche Herausforderung ist die Isolierung von endotoxinfreien Elektrofahrzeugen, die in vielen Fällen vernachlässigt wurde. Eines der häufigsten Endotoxine ist das Lipopolysaccharid (LPS), das ein Hauptbestandteil gramnegativer bakterieller Zellwände ist und aufgrund der Freisetzung einer großen Anzahl von entzündlichen Zytokinen durch verschiedene Zellen eine akute Entzündungsreaktion hervorrufen kann 4,5. LPS induziert eine Reaktion durch Bindung an das LPS-bindende Protein, gefolgt von einer Interaktion mit dem CD14/TLR4/MD2-Komplex auf myeloischen Zellen. Diese Wechselwirkung führt zur Aktivierung von MyD88- und TRIF-abhängigen Signalwegen, was wiederum den Kernfaktor Kappa B (NFkB) auslöst. Die Translokation von NFkB in den Zellkern initiiert die Produktion von Zytokinen6. Monozyten und Makrophagen reagieren sehr empfindlich auf LPS, und ihre Exposition gegenüber LPS führt zu einer Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen (z. B. IL-6, IL-12, CXCL8 und TNF-α)7,8. Die CD14-Struktur ermöglicht die Bindung verschiedener LPS-Spezies mit ähnlicher Affinität und dient als Co-Rezeptor für andere Toll-like-Rezeptoren (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 und 9)6. Die Zahl der Studien, die zu den Auswirkungen von EVs auf Monozyten/Makrophagen durchgeführt werden, nimmt immer noch zu 9,10,11. Insbesondere im Hinblick auf die Untersuchung der Funktionen von Monozyten, ihren Subpopulationen und anderen Immunzellen ist das Vorhandensein von Endotoxin und sogar ihre maskierte Anwesenheit in EVs von großer Bedeutung12. Die übersehene Kontamination von Elektrofahrzeugen mit Endotoxinen kann zu irreführenden Schlussfolgerungen führen und ihre wahre biologische Aktivität verschleiern. Mit anderen Worten, die Arbeit mit monozytären Zellen erfordert Vertrauen in die Abwesenheit einer Endotoxinkontamination13. Mögliche Quellen für Endotoxine können Wasser, kommerziell erhältliche Medien und Seren, Medienkomponenten und -additive, Laborglaswaren und Kunststoffwaren 5,14,15 sein.

Daher zielte diese Studie darauf ab, ein Protokoll für die Isolierung von niedrig endotoxinhaltigen EVs zu entwickeln. Das Protokoll enthält einfache Hinweise, wie eine Endotoxinkontamination während der Isolierung von Elektrofahrzeugen vermieden werden kann, anstatt Endotoxine aus Elektrofahrzeugen zu entfernen. Zuvor wurden viele Protokolle vorgestellt, wie Endotoxine beispielsweise aus technisch hergestellten Nanopartikeln entfernt werden können, die in der Nanomedizin verwendet werden. Keiner von ihnen ist jedoch für biologische Strukturen wie EVs nützlich. Die effektive Depyrogenisierung von Nanopartikeln kann durch Ethanol- oder Essigsäurespülen, Erhitzen auf 175 °C für 3 h, γ Bestrahlung oder Triton-X-100-Behandlung erfolgen; Diese Verfahren führen jedoch zur Zerstörung von Elektrofahrzeugen16,17.

Das vorgestellte Protokoll ist eine bahnbrechende Studie, die sich auf die Vermeidung von Endotoxinverunreinigungen in EVs konzentriert, im Gegensatz zu früheren Studien zur Wirkung von EVs auf Monozyten9. Die Anwendung der vorgeschlagenen Prinzipien auf die Laborpraxis kann dazu beitragen, zuverlässige Forschungsergebnisse zu erhalten, was entscheidend sein kann, wenn die mögliche Verwendung von EVs als Therapeutika in der Klinik in Betracht gezogen wird12.

Protocol

1. Vorbereitung von Ultrazentrifugenröhrchen Verwenden Sie sterile Einwegröhrchen. Wenn dies nicht möglich ist, verwenden Sie die Ultrazentrifugenröhrchen wieder, nachdem Sie sie mit einem Reinigungsmittel mit einer sterilen Pasteurpipette oder anderen Einwegapplikatoren gewaschen haben. Denken Sie daran, dass Ultrazentrifugenröhrchen für eine Art von zentrifugiertem Material (Zellkulturüberstand/Serum/Plasma) und Spezies (Mensch/Maus/etc.) bestimmt sein sollten. Spülen Sie di…

Representative Results

Voraussetzung oder obligatorischer Schritt für dieses Protokoll ist der Ausschluss einer möglichen Endotoxinkontamination aus Reagenzien. Alle verwendeten Reagenzien wie FBS, DMEM, RPMI, PBS und sogar Ultrazentrifugenröhrchen müssen endotoxinfrei sein (<0,005 EU/ml). Es ist nicht einfach, das Regime ohne Endotoxinkontamination aufrechtzuerhalten, da z. B. das Normal-/Standardserum für die Zellkultur eine reichhaltige Quelle sein kann (0,364 EU/ml; siehe Tabelle 1). Obwohl…

Discussion

In den letzten Jahren haben Methoden zur ordnungsgemäßen Isolierung von Elektrofahrzeugen zunehmend an Bedeutung gewonnen, um weitere zuverlässige Analysen zu ermöglichen, z. B. im Zusammenhang mit der Gewinnung zuverlässiger Omics- und Funktionsdaten24. Basierend auf früheren Forschungserfahrungen scheint es, dass nicht nur die Art der Isolationsmethode, sondern auch andere Bedingungen während dieses Verfahrens wichtig sein können. Die Verwendung von EV-abgereichertem FBS wird weithin als…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Nationalen Wissenschaftszentrum, Polen, unter der Fördernummer 2019/33/B/NZ5/00647 unterstützt. Wir danken Professor Tomasz Gosiewski und Agnieszka Krawczyk von der Abteilung für Molekulare Medizinische Mikrobiologie des Medizinischen Kollegs der Jagiellonen-Universität für ihre unschätzbare Hilfe beim Nachweis von bakterieller DNA in Elektrofahrzeugen.

Materials

 Alix (3A9) Mouse mAb  Cell Signaling Technology 2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic GoogLab Scientific GBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow Cytometr BD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II BD Biosciences 551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 13174
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad Laboratories, Inc.  17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)  Corning 10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate Reader BIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine Serum Gibco 16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin  Biowest  S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL  PAN – Biotech P06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005
Immun-Blot PVDF Membrane Bio-Rad Laboratories, Inc.  1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)  Enzo Life Sciences, Inc. ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad Laboratories, Inc.  1703930
Nanoparticle Tracking Analysis  Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)  Invitrogen  NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)  Invitrogen NP0004
Parafilm Sigma Aldrich P7793 transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA Ladder EURx E3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit Thermo Scientific A39552
PP Oak Ridge Tube with sealing caps Thermo Scientific 3929, 03613
RPMI 1640 RPMI-1640 (Gibco) 11875093
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystem A24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor Thermo Scientific 75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System Bio-Rad Laboratories, Inc.  1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34577
SW480 cell line American Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell line American Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 um TPP 99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad Laboratories, Inc.  1703940 Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mL SARSTEDT 86.1171.001

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Diesen Artikel zitieren
Babula, A., Siemińska, I., Baj-Krzyworzeka, M. Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (192), e65062, doi:10.3791/65062 (2023).

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