Summary

Primärkultur von Stammzellen der Zahnpulpa

Published: May 05, 2023
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Summary

Dieser Artikel enthält eine schrittweise Anleitung zur Etablierung einer Primärkultur von Zahnpulpa-Stammzellen unter Verwendung der Explantatkulturmethode und zur Charakterisierung dieser Zellen auf der Grundlage der ICSCRT-Richtlinien. Die durch dieses Protokoll isolierten Zellen können als mesenchymale Stammzellen für weitere Anwendungen betrachtet werden.

Abstract

Die humane Zahnpulpa stellt ein vielversprechendes multipotentes Stammzellreservoir mit herausragender regenerativer Kompetenz dar, das aus einem extrahierten Zahn gewonnen werden kann. Der aus der Neuralleiste gewonnene ekto-mesenchymale Ursprung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) verleiht ein hohes Maß an Plastizität, das auf seine vielfältigen Vorteile bei der Gewebereparatur und -regeneration zurückzuführen ist. Es gibt verschiedene praktische Möglichkeiten, adulte Stammzellen zu gewinnen, zu erhalten und zu vermehren, die für ihren Einsatz in der regenerativen Medizin untersucht werden. In dieser Arbeit zeigen wir die Etablierung einer primären mesenchymalen Stammzellkultur aus Zahngewebe mit Hilfe der Explantatkulturmethode. Die isolierten Zellen waren spindelförmig und hafteten an der Kunststoffoberfläche der Kulturplatte. Die phänotypische Charakterisierung dieser Stammzellen zeigte eine positive Expression der von der International Society of Cell Therapy (ISCT) empfohlenen Zelloberflächenmarker für MSC, wie CD90, CD73 und CD105. Darüber hinaus bestätigte die vernachlässigbare Expression von hämatopoetischen (CD45) und endothelialen Markern (CD34) und weniger als 2% der HLA-DR-Marker die Homogenität und Reinheit der DPSC-Kulturen. Des Weiteren haben wir ihre Multipotenz anhand der Differenzierung zu adiogenen, osteogenen und chondrogenen Linien veranschaulicht. Wir haben diese Zellen auch dazu gebracht, sich durch Zugabe entsprechender Stimulationsmedien in leberähnliche und neuronale Zellen zu differenzieren. Dieses optimierte Protokoll wird bei der Kultivierung einer hochgradig erweiterbaren Population von mesenchymalen Stammzellen helfen, die im Labor oder für präklinische Studien verwendet werden sollen. Ähnliche Protokolle können in klinische Setups für die Durchführung von DPSC-basierten Behandlungen integriert werden.

Introduction

Adulte Stammzellen haben sich aufgrund ihrer Plastizität, ihrer parakrinen Mechanismen und immunmodulatorischen Eigenschaften zu einem leistungsfähigen therapeutischen Werkzeug für zellgerichtete Behandlungen und Therapien entwickelt 1,2,3. Die ermutigenden Daten aus stammzellbasierten präklinischen Studien haben Forscher dazu inspiriert, an der Labor-zu-Krankenbett-Translation zu arbeiten. Die Art der Stammzellen, die für die Stammzelltherapie verwendet werden, spielt eine wichtige Rolle für erfolgreiche Ergebnisse. In präklinischen und klinischen Studien ist das Knochenmark nach wie vor die am häufigsten berichtete Quelle für mesenchymale Stammzellen (MSCs) 4,5. Zu den größten Nachteilen bei der Verwendung von Stammzellen (BMSCs) aus dem Knochenmark gehören jedoch ihre seltene Population, hochinvasive Verfahren zur Isolierung und ihre begrenzte Fähigkeit zur Expansion. Daher werden alternative Quellen für MSC untersucht. In dieser Hinsicht wurden Zahngewebe mit ihrer leichten Zugänglichkeit, enormen Plastizität, ihrem hohen Regenerationspotenzial und ihrer hohen Proliferationsfähigkeit nun als reichhaltige und potenzielle alternative Quelle für Stammzellen angesehen 6,7,8,9,10.

Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) waren die erste Art von dentalen Stammzellen, die im Jahr 2000 von Gronthos isoliert und charakterisiert wurden11. DPSCs haben aufgrund ihrer hohen Proliferationsrate, ihres signifikanten Differenzierungspotenzials, ihrer einfachen Zugänglichkeit bei müheloser Kultivierung und vor allem ihrer Fähigkeit, ohne ethische Bedenken aus einem verworfenen Zahn gewonnen zu werden, die Aufmerksamkeit für Tissue-Engineering-Anwendungen auf sich gezogen12. Die Einschränkungen, die andere Stammzellquellen, wie z. B. BMSCs und aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), in ihrer Isolierung und unzureichenden Selbsterneuerungsfähigkeit mit sich bringen, werden durch DPSCsumgangen 13. Humane DPSCs können aus menschlichen Milchzähnen, bleibenden Zähnen, Weisheitszähnen, exfolierten Milchzähnen (SHEDs) und apikalen Papillen gewonnen werden. Darüber hinaus können DPSCs auch aus überzähligen Zähnen isoliert werden, die in der Regel verworfen werden14. DPSCs exprimieren Neuralleisten-assoziierte Marker und haben das Potenzial, sich sowohl in vitro als auch in vivo in neuronale Zellen zu differenzieren 15. Zusätzlich zu ihrem neurogenen Potenzial können sich DPSCs unter bestimmten Differenzierungsbedingungen in andere Zelllinien differenzieren, wie z. B. osteogene, chondrogene, adipogene, hepatische und myogene Zelllinien13. Somit bergen diese multipotenten Zellen ein großes Potenzial für die zellbasierte Therapie und können für die Regeneration verschiedener Gewebe eingesetzt werden. Studien haben auch über die potenzielle Rolle von DPSCs bei der Rekonstruktion der Hornhaut16, die Reparatur des Myokardinfarkts17 und ihre potenzielle therapeutische Rolle bei Krankheiten wie Ischämie der Gliedmaßen18, Alzheimer 19, Parkinson 20 und Alternberichtet 21. Daher können aus Zahngewebe gewonnene Stammzellen nicht nur für die Zahnregeneration verwendet werden, sondern auch für die Reparatur und Regeneration von nicht-zahnärztlichen Organen wie Augen16, Herzen17, Leber22, Knochen23 usw.

Es gibt zwei besondere Methoden für die Isolierung einer MSC-Population aus Pulpagewebe – enzymatischer Verdau und Explantatkultur24,25. Bei beiden Methoden wurde über eine erfolgreiche Etablierung von Primärkulturen ohne signifikante Unterschiede in der Menge und den Eigenschaften von DPSC berichtet26. In dieser Studie haben wir uns auf die Isolierung von DPSCs durch die Explantatmethode27 konzentriert, da diese Methode DPSCs ohne Kontamination von hämatopoetischen und endothelialen Zellen erzeugt, im Vergleich zum enzymatischen Verdau, der zu einer Fibroblastenkontamination führen kann28.

Protocol

Alle in der Studie beschriebenen Verfahren wurden von der Ethikkommission des Instituts (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) von PGIMER, Chandigarh, genehmigt. Alle Experimente im Zusammenhang mit der Zellkultur müssen in einer biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) der Klasse II nach aseptischer Technik durchgeführt werden. Die Zahnpulpa wurde von gesunden Zähnen von drei Patienten (F/14, M/14 und M/20) gewonnen, die sich aus kieferorthopädischen Gründen einer Extraktion des dritten Molaren unterzogen hatten. Vor der Pro…

Representative Results

Hier beschreiben wir, wie Forscher eine Reinkultur von DPSCs mit der Explantatmethode 6,7,8,9,10 etablieren und sie zu mehreren Linien induzieren können, um die Reinheit der Kultur für nachgelagerte Anwendungen zu etablieren. Wir etablierten eine Primärkultur von DPSCs aus dem kleinen Gewebe der Pulpa, das aus dem dritte…

Discussion

Stammzellen haben aufgrund ihrer Plastizität, Robustheit, immunmodulatorischen Eigenschaften, parakrinen Mechanismen und Homing-Effizienz die Hoffnung auf die Heilung zahlreicher Krankheiten geknüpft. Zahnpulpagewebe gilt als die potenteste und wertvollste Quelle für Stammzellen, mit herausragender Plastizität und regenerativer Fähigkeit. Hier demonstrieren wir die Isolierung von DPSCCs unter Verwendung der weit verbreiteten Explantatkulturmethode, bei der die Zellen aus Pulpagewebestücken oder Explantaten migriere…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken für die finanzielle Unterstützung der AK durch das Department of Health Research (DHR), ICMR, Regierung von Indien (DHR-NRI Grant # R.12015/01/2022-HR). SR hat eine Finanzierung von ICMR, Regierung von Indien (Grant # 2020-7593/SCR-BMS) erhalten, und PS hat ein Stipendium von CSIR, Regierung von Indien, erhalten. Wir danken auch Frau Sandhya Tokhi und Frau Bhupinder Kaur für ihre Unterstützung bei der Durchflusszytometrie sowie dem Central Sophisticated Instrumentation Core (CSIC) und PGIMER, Chandigarh, für die Bereitstellung von infrastruktureller Unterstützung.

Materials

6 well cell culture plate Costar 3516 For cell culture
Alcian blue stain EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia CCK029
alizarin red S stain Sigma-Aldrich TMS-008 Osteogenic stain
Antibiotic cocktail Himedia A002-5X50ML To prevent culture contamination
Ascorbic Acid Himedia TC094-25G Chondrogenic induction
B27 supplement Gibco 17504044 For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor) Gibco PHG0024 For neural induction
CD 105 BD-Pharmingen 560839
CD 35 Biolegend 343604
CD 45 Biolegend 304006
CD 73 Biolegend 344016
CD 90 Biolegend 328107 Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC) Sigma-Aldrich 1104006 For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium Sigma-Aldrich D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Himedia TS1006-5L For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor) Gibco PHG0311 For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope Invitrogen For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit Himedia CCK029-1KT Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences For cell characterization
Fetal Bovine Serum Gibco 16000044 For primary culture
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 For cell culture
G5 supplement Gibco 17503012 For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor) Sigma-Aldrich H1404 For hepatic Induction
HLA-DR Biolegend 307605
 Human TGF-β3 Peprotech #100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix Sigma-Aldrich I3146 For hepatic Induction
ITS premix Corning 354350
LDL Uptake Assay kit Abcam ab133127 For hepatic characterization
Low glucose DMEM Gibco 11885-084 For hepatic induction
MAP2 antibody Sigma-Aldrich M4403 For neural characterization
N2 supplement Gibco 17502048 For neural induction
Neural Basal Media Gibco 21103049 For neural induction
NFM antibody Sigma-Aldrich N4142 For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope Nikon For  fluorescence imaging
Oil Red O Sigma-Aldrich 01391-250Ml Adipogenic stain
Oncostatin M R&D Systems 295-OM-010/CF For hepatic Induction
Petridish Tarson 460090-90MM For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 15655-100G Osteogenic induction
Propan-2-ol Thermo Fisher Q13827 For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution Sigma life sciences S8636-100ML
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049 For cell passaging
Whatman filter paper merck WHA1001325 filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM) Sigma-Aldrich M0643-10X 1L Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G9422-50G

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Diesen Artikel zitieren
Kumar, A., Raik, S., Sharma, P., Rattan, V., Bhattacharyya, S. Primary Culture of Dental Pulp Stem Cells. J. Vis. Exp. (195), e65223, doi:10.3791/65223 (2023).

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