Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Whole-Mount Fluorescentie In Situ Hybridisatie om Spermatogenese in de Anopheles-mug te bestuderen

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65356
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1
1Department of Life Sciences, Sir Alexander Fleming Building, Imperial College London, 2Department of Entomology, Virginia Tech
* These authors contributed equally

Summary

Gezien hun eenvoudige anatomie bieden Anopheles-testikels een goed cytologisch model voor het bestuderen van spermatogenese. Dit protocol beschrijft whole-mount fluorescentie in situ hybridisatie, een techniek die wordt gebruikt om dit biologische proces te onderzoeken, evenals het fenotype van transgene stammen die mutaties herbergen in de genen die betrokken zijn bij de productie van sperma.

Abstract

Spermatogenese is een complex biologisch proces waarbij diploïde cellen opeenvolgende mitotische en meiotische deling ondergaan, gevolgd door grote structurele veranderingen om haploïde spermatozoa te vormen. Naast het biologische aspect is het bestuderen van spermatogenese van het grootste belang voor het begrijpen en ontwikkelen van genetische technologieën zoals gene drive en synthetische geslachtsverhoudingsverstoorders, die, door respectievelijk de Mendeliaanse overerving en de geslachtsverhouding van het sperma te veranderen, kunnen worden gebruikt om plaaginsectenpopulaties te bestrijden. Deze technologieën zijn veelbelovend gebleken in laboratoriumomgevingen en kunnen mogelijk worden gebruikt om wilde populaties van Anopheles-muggen , die vectoren van malaria zijn, onder controle te houden. Vanwege de eenvoud van de anatomie van de testis en hun medisch belang, vertegenwoordigt Anopheles gambiae, een belangrijke malariavector in Afrika bezuiden de Sahara, een goed cytologisch model voor het bestuderen van spermatogenese. Dit protocol beschrijft hoe whole-mount fluorescentie in situ hybridisatie (WFISH) kan worden gebruikt om de dramatische veranderingen in de celkernstructuur door middel van spermatogenese te bestuderen met behulp van fluorescerende sondes die specifiek de X- en Y-chromosomen kleuren. FISH vereist meestal de verstoring van de voortplantingsorganen om mitotische of meiotische chromosomen bloot te leggen en de kleuring van specifieke genomische regio's met fluorescerende sondes mogelijk te maken. WFISH maakt het behoud van de oorspronkelijke cytologische structuur van de testis mogelijk, in combinatie met een goed niveau van signaaldetectie van fluorescerende sondes die zich richten op repetitieve DNA-sequenties. Hierdoor kunnen onderzoekers veranderingen in het chromosomale gedrag van cellen die meiose ondergaan volgen langs de structuur van het orgaan, waarbij elke fase van het proces duidelijk kan worden onderscheiden. Deze techniek zou met name nuttig kunnen zijn voor het bestuderen van chromosoom-meiotische paren en het onderzoeken van de cytologische fenotypes geassocieerd met bijvoorbeeld synthetische geslachtsverhoudingsverstoorders, hybride mannelijke steriliteit en de knock-out van genen die betrokken zijn bij spermatogenese.

Introduction

Malaria legt een enorme last op de gezondheid en het welzijn van de wereldbevolking. In 2021 schatte de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) dat malaria 619.000 doden veroorzaakte, waarvan 96% in Sub-Sahara Afrika1. De ziekte wordt overgedragen door muggen die behoren tot het geslacht Anopheles, en in Sub-Sahara Afrika hebben drie soorten, namelijk Anopheles gambiae (An. gambiae), Anopheles coluzzi (An, coluzzi) en Anopheles arabiensis (An. Arabiensis) een onevenredig grote rol bij de overdracht van malaria, goed voor 95% van de malariagevallen wereldwijd. Bestrijdingsprogramma's die afhankelijk zijn van traditionele methoden zoals insecticiden en antimalariamiddelen hebben miljoenen levens gered; In de afgelopen jaren heeft de toenemende weerstand tegen deze bestrijdingsmethoden echter hun werkzaamheid op de proef gesteld 1,2. Bovendien hebben de beperkingen die zijn opgelegd door de COVID-19-pandemie invloed gehad op de beschikbaarheid van belangrijke malariabestrijdingsinterventies, wat volgens het WHO World Malaria Report 2022 de incidentie van malaria heeft verhoogd1. In de afgelopen twee decennia zijn in laboratoriumomgevingen nieuwe genetische bestrijdingsmethoden ontwikkeld om Anopheles-muggen aan te pakken 3,4,5,6,7,8,9,10. Van deze strategieën lijken die op basis van gene drive-systemen (GDS'en) en synthetische geslachtsverhoudingsverstoorders (SD's) veelbelovend. GDS'en zijn afhankelijk van de mogelijkheid om met een zeer hoge frequentie een genetische modificatie over te dragen die de vrouwelijke vruchtbaarheid beïnvloedt of de levenscyclus van de parasiet in de mug schaadt 5,11,12. SD's handelen in plaats daarvan door de geslachtsverhouding van een muggennageslacht naar mannetjes te verschuiven, wat na verloop van tijd leidt tot de ineenstorting van een doelpopulatie als gevolg van een gebrek aan vrouwtjes 4,6,13. De belangrijkste componenten van deze genetische systemen werken voornamelijk in op de voortplantingsorganen van de muggen, waar de gameten, eieren en sperma worden geproduceerd na meiotische deling14.

In dit protocol wordt vooruitgang in cytogenetische technieken gebruikt om spermatogenese in An. gambiae te onderzoeken, waarbij de nadruk ligt op het gedrag van de chromosomen in situ. De structuur van de testikels van de mug en de biologische processen die daarin plaatsvinden, zijn eerder onderzocht met behulp van een aantal cytologische methoden, zoals immunofluorescentie, fluorescerende reportertransgenen en DNA- en RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)15,16,17,18,19,20; De organen vertonen een spoelachtige vorm, waarbij de onderste pool is bevestigd aan een deferent kanaal dat is verbonden met de mannelijke accessoireklieren. In de bovenste pool prolifereert de niche van de kiembaanstamcellen en differentieert zich tot spermatogonia cellen die zijn ingebed in spermatocysten gevormd door somatische cellen. Na meerdere rondes van mitotische deling differentiëren de spermatogonia zich in spermatocyten, die meiose ingaan. In de profase paren autosoom- en geslachtschromosomen met hun homologen en vindt cross-over plaats. Na de meiotische delingen worden ronde haploïde spermatiden gegenereerd en gaan ze de spermiogenese in, en dit proces leidt tot de vorming van volwassen haploïde spermatozoa waarin het cytoplasma is verwijderd, het nucleaire chromatine wordt gecondenseerd en flagellen verschijnen in het basale deel van de kernen21,22 (Figuur 1 en Figuur 2).

Over het algemeen begint de spermiogenese rond het midden van het popstadium en kunnen rijpe spermatozoa worden gedetecteerd in het late popstadium in het spermareservoir23. Het rijpingsproces van de spermatocysten gaat door tijdens het volwassen leven23,24,25. In Anopheles-testikels kan elke stap van de spermatogenese gemakkelijk worden geïdentificeerd door te kijken naar de nucleaire morfologie van de cellen in elke spermatocyst (Figuur 2). Whole-mount fluorescentie in situ hybridisatie (WFISH), beschreven in dit protocol, stelt onderzoekers in staat om specifiek een chromosomaal gebied te labelen en te volgen tijdens spermatogenese met behoud van de oorspronkelijke structuur van de orgaan- en celkernpositie; dit is een voordeel in vergelijking met het standaard DNA FISH-protocol waarbij het orgaan meestal wordt platgedrukt, wat leidt tot weefselbeschadiging19. In het huidige protocol worden fluorescerende sondes gebruikt om repetitieve sequenties op de geslachtschromosomen te kleuren en zo hun gedrag tijdens de spermatogenese te volgen, van diploïde delende cellen tot volwassen haploïde spermatozoa. WFISH kan met name nuttig zijn voor het bestuderen van meiotische paren van geslachtschromosomen en het onderzoeken van de cytologische fenotypes die verband houden met bijvoorbeeld synthetische geslachtsverhoudingsverstoorders, hybride mannelijke steriliteit en de knock-out van genen die betrokken zijn bij spermatogenese 4,19,26,27.

Gezien hun rol als malariavectoren zijn Anopheles-muggen het doelwit van een toenemend aantal genetische vectorcontrolestrategieën, die vaak werken in de voortplantingsorganen van deze organismen. Er zijn verschillende muggenmutanten en cytologische fenotypes gegenereerd waarvoor nieuwe cytologische technieken moeten worden onderzocht26,27,28,29. De methode die in deze studie wordt beschreven, werpt licht op het begrip van spermatogenese, evenals de cytologische mechanismen achter genetische strategieën die het potentieel hebben om malaria-overdragende muggen te bestrijden.

Protocol

1. Etikettering van DNA-sondes

OPMERKING: Hieronder staan de technische stappen om fluorescerende DNA-sondes te genereren die specifiek de geslachtschromosomen van An. gambiae-muggen labelen.

  1. Etikettering van sondes met behulp van PCR
    1. Genoom-DNA extraheren van poppen of volwassen mannetjes om de X- of Y-chromosomen te labelen met behulp van een in de handel verkrijgbare genomische DNA-extractiekit (zie Materiaaltabel).
    2. Bereid het PCR-reactiemengsel: 200 ng genomisch DNA, 0,05 mM niet-gelabeld nucleotide (dATP, dCTP, dGTP), 0,015 mM dTTP en 1 uL fluorescerend gelabeld dUTP (Cy3, Cy5 of een ander fluorochroom), 50 pmol voorwaartse en achterwaartse primer (tabel 1), 5 μL 10x PCR-buffer en 10 U Taq-DNA-polymerase (zie materiaaltabel).
    3. Om 18S rDNA en satelliet AgY53B te labelen (tabel 1), voert u een PCR-reactie uit met behulp van de volgende PCR-parameters: één cyclus van 95 °C gedurende 10 minuten; 35 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 52 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 45 s; één cyclus van 72 °C gedurende 5 min; en een laatste greep bij 4 °C.
      OPMERKING: Om een goede sondeconcentratie te verkrijgen met de PCR-etiketteringsmethode (~1 μg in 5 μL), wat van cruciaal belang is voor een succesvolle WFISH, moet de PCR-reactie zeer efficiënt zijn. Om deze reden wordt sterk aangeraden om, voordat de sonde wordt geëtiketteerd, de werkzaamheid te testen van de primers die voor de versterking zijn geselecteerd. Bovendien zal het opnemen van een positieve controle in de PCR-reactie (zonder de fluorescerende dUTP) helpen om de werkzaamheid van de etiketteringsreactie te verifiëren.
    4. Bewaar de sonde bij -20 °C op een donkere plaats.
  2. Het verkrijgen van 3' uiteinde fluorescerende oligonucleotide sondes
    1. Verkrijg in de handel verkrijgbare fluorescerende oligonucleotidesondes als gemodificeerde oligo's door Cy3- of Cy5-fluorochromen (of een ander fluorochroom) toe te voegen aan het 3'-uiteinde van de nucleotidesequentie (zie Materiaaltabel). Zie primers/oligonucleotide in tabel 1 voor de referentiesequenties die worden gebruikt om het Y-gekoppelde satelliet AgY477-AgY53B-junctiegebied en de X-gekoppelde satelliet van Contig_240 te labelen.
      OPMERKING: Er zijn geen technische belemmeringen met betrekking tot de concentratie van 3' eindgelabelde oligonucleotiden, aangezien de gebruiker dit meestal vóór aankoop kan kiezen. We raden aan om ~800 ng oligo-sonde-oplossing in de hybridisatiebuffer te verdunnen voor efficiënte etikettering met behulp van de oligo-sonde. X- en Y-specifieke oligo-sondes zijn eerder gebruikt voor WFISH door Liang en Sharakhov19, en de referentiesequentie is te vinden in tabel 1.

2. Bereiding van de hybridisatieoplossing

NOTITIE: De fluorescentiesondes die in stap 1 worden gegenereerd, moeten worden opgenomen in een chemische oplossing die hybridiseert met de doelsequenties.

  1. Sondeprecipitatie voorafgaand aan fluorescentie in situ hybridisatie
    1. Voeg aan een buisje van 1,5 ml 5 μL gelabelde DNA-sonde toe (indien verkregen door de PCR-labelmethode) of 2,2 μL gemodificeerde oligosonde van 3' (~800 ng sonde) uit stap 1 en 5 μL zalmsperma-DNA (zie tabel met materialen). Combineer de sondes die specifiek zijn voor verschillende genomische regio's in dezelfde buis en gebruik ze als een unieke oplossing in de volgende stappen.
    2. Sla de DNA-sonde neer door 0,1 volume 3 M natriumacetaat en 2 volumes 100% ethanol toe te voegen. Bewaren bij −20 °C gedurende ten minste 2,5 uur (verlenging van de incubatietijd bij −20 °C zal de uiteindelijke opbrengst verhogen). In dit stadium kunnen de sondes ook een nacht worden opgeslagen voordat ze worden gecentrifugeerd.
    3. Centrifugeer op 17.000 x g bij 4 °C gedurende 20 minuten, verwijder de ethanol en laat de pellet ~20 minuten aan de lucht drogen bij RT in het donker.
  2. Hybridisatie-oplossing
    1. Voordat u verder gaat met de testisdissectie (stap 3), bereidt u de hybridisatiebuffer voor door de volgende reagentia in een buisje van 1,5 te mengen: 500 μl formamide, 0,2 g dextraansulfaat, 100 μl 20x natriumzoutcitraat (SSC) en 200 μl steriel H20 (zie materiaaltabel). Draai de hybridisatieoplossing gedurende 1 minuut en laat het dextraansulfaat gedurende 30 minuten oplossen bij 37 °C.
    2. Los de pellet uit stap 2.1.3 op in 20-30 μL hybridisatiebuffer (vortex gedurende ongeveer 1 minuut, voer een snelle centrifuge uit en bewaar de buisjes bij 37 °C in het donker) om de hybridisatieoplossing te verkrijgen.

3. Testisdissectie en fixatie

  1. Ontleed bij kamertemperatuur (RT)21 ten minste ~20 testikels van poppen of volwassenen van 1 dag oud in steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en breng ze over naar een schoon microscoopglaasje met een verse druppel 1x PBS-oplossing.
  2. Breng de teelballen over met behulp van een P1,000 gefilterde punt met brede boring of de punt van een dissectienaald van de 1x PBS-druppel in een embryoschaal met 3.7% formaldehyde in 1x PBS met 0.1% Tween-20 (PBST), en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
  3. Was de teelballen in 1x PBST gedurende 5 minuten bij RT. Incubeer de teelballen in 0,1 mg/ml RNAse A (zie Materiaaltabel) verdund in steriel 1x PBS gedurende 30 min bij 37 °C.
  4. Verwijder de RNAse-oplossing, voeg de penetrerende oplossing toe (1% Triton/0,1 M HCl in 1x PBST) en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
    OPMERKING: Proteïnase K kan worden gebruikt als penetrerend middel in een eindconcentratie van 10 μg/ml in 1x PBST om de permeabilisatie van de teelballen te verhogen.
  5. Was de teelballen in 1x PBST twee keer gedurende 5 minuten elk op RT.

4. Hybridisatie

OPMERKING: In dit gedeelte worden de laatste stappen voor de in situ hybridisatie beschreven.

  1. Breng de teelballen na de wasstap (stap 3.5) over in een buisje van 1,5 ml met 20-30 μl hybridisatieoplossing met de eerder bereide sonde (stap 2.2.2). Gebruik de punt van de pipet om de oplossing voorzichtig te mengen. Beweeg de buis voorzichtig vijf keer voordat u doorgaat naar de volgende stappen.
  2. Incubeer gedurende 5 minuten bij 75 °C voor DNA-denaturatie.
  3. Incubeer 's nachts bij 37 °C (indien mogelijk met schommelen bij minder dan 100 tpm) voor DNA-DNA-hybridisatie.
  4. Breng de teelballen terug in een embryoschaal met behulp van een P1.000 gefilterde tip met brede boring en was ze in 2x SSC voorverwarmd tot 50 °C gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Na de hybridisatiestap is een laatste wasstap met 2x SSC vereist; Dit speelt een belangrijke rol bij het verwijderen van elk achtergrondsignaal dat wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van niet-gehybridiseerde sondes in het orgaanweefsel. Als er een sterk achtergrondsignaal aanwezig is, wordt aanbevolen om de laatste wasstap te herhalen.
  5. Verwijder de 2x SSC en monteer de teelballen met behulp van een in de handel verkrijgbaar montagemedium met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (zie Materiaaltabel) op een matglasplaatje, sluit af met dekglaasjeskit en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij RT in het donker.
  6. Voer confocale beeldvorming uit. De hele teelballen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van 40x of 63x olie-immersieobjectieven. Als een z-stack wordt uitgevoerd, raden we aan om een z-stap van 1,25 μm te gebruiken.

Representative Results

In dit werk werd WFISH gebruikt om het chromosoomgedrag tijdens de spermatogenese in An. gambiae te onderzoeken. De eerste cruciale stap voor het toepassen van dit protocol is het verkrijgen van testikels die na dissectie een laag niveau van morfologische verandering vertonen. Basiskennis van de anatomie van de mug is vereist om een succesvolle testisdissectie uit te voeren, en hieronder worden enkele richtlijnen voor deze procedure gegeven. Bij de Anopheles-mug zijn volwassen teelballen te vinden in het zesde abdominale segment van de pop en volwassen stadia21. Zoals te zien is in figuur 1, verbindt de zaadleider de teelballen met de mannelijke accessoireklieren (MAG's), die zich in het laatste segment van de buik bevinden. De MAG's zijn verbonden met een uniek ejaculatiekanaal dat het sperma en de zaadvloeistoffen aflevert aan het copulatieorgaan en het uitwendige deel van het mannelijke genitale apparaat21. Het volledige inwendige mannelijke genitale apparaat kan worden ontleed met behulp van verschillende benaderingen, afhankelijk van de levensfase van de mug. Tijdens het popstadium kunnen de teelballen gemakkelijk worden geïdentificeerd met behulp van een stereomicroscoop in de hele lichte cuticula door te kijken naar de ventrale zijde van de buik in de buurt van het zesde segment (Figuur 1). Om de teelballen te ontleden, kan het onderste deel van de buik, inclusief het zesde segment, worden geïsoleerd van de rest van het lichaam met behulp van een paar naalden en worden overgebracht in een schone druppel van 1x PBS. Na het verwijderen van het laatste segment kan het hele apparaat uit de buik worden geplet door lichte druk uit te oefenen met de ontleednaalden. Om de teelballen van volwassen mannetjes te ontleden, bestaat de eerste stap uit het isoleren van de hele buik in een verse druppel van 1x PBS en vervolgens het uittrekken van het laatste segment met de gespen, de mannelijke copulatiestructuren (Figuur 1). Op dit punt zou het onderste deel van de MAG's tevoorschijn moeten komen en gemakkelijk herkenbaar moeten zijn vanwege hun gele kleur. Het hele mannelijke apparaat kan dan langzaam worden uitgetrokken met behulp van een naald of pincet in een druppel van 1x PBS totdat het paar teelballen dat aan de zaadleider is bevestigd, zichtbaar is. Alvorens verder te gaan met de fixatie, is het belangrijk om de teelballen te isoleren van de andere delen van het mannelijke apparaat door in de buurt van het onderste deel van de zaadleider te snijden (Figuur 1).

De leeftijd van de poppen of volwassen mannetjes is een belangrijke factor om rekening mee te houden, afhankelijk van het onderzochte spermatogenesestadium. Bij An. gambiae begint de spermatogenese in het vroege/middenpopstadium en gaat door gedurende het hele leven van het individu24. Tussen 3 uur en 10 uur na de verpopping zijn de premeiotische en meiotische stadia meer vertegenwoordigd in de testis (meiotische profase, meiotische delingen), is het spermatide-DNA relatief ongecondenseerd en zijn er nog geen rijpe zaadcellen gevormd. Late poppen en volwassen poppen van 1 dag oud bieden een goede balans tussen de premeiotische, meiotische en post-meiotische stadia (Figuur 2 en Figuur 3). Bij volwassenen die meer dan 4 dagen oud zijn, zijn de premeiotische stadia en spermatocysten minder vertegenwoordigd en worden de teelballen voornamelijk bezet door rijpe spermacellen in het spermareservoir.

Om het gedrag van de geslachtschromosomen tijdens verschillende stadia van spermatogenese te onderzoeken, werd WFISH uitgevoerd op testikels die in het late popstadium waren ontleed om een goede weergave van het hele proces te garanderen. Om het gedrag van deze chromosomen te volgen, werden fluorescerende sondes gebruikt die specifiek zijn voor repetitieve sequenties die zich uitsluitend op het X- of Y-chromosoom bevinden. De fluorescerende sondes kunnen worden gegenereerd met behulp van PCR of commercieel worden verkregen als 3'-eindgelabelde oligonucleotiden. Het gebruik van een oligo met een lengte van >40 bps wordt aanbevolen om een goede signaaldetectie van de fluorescerende oligo-sonde mogelijk te maken. Onze ervaring is dat 3'-eindgelabelde oligo's beter presteren dan PCR-gelabelde sondes op het gebied van signaaldetectie. Bovendien is het kopienummer van de doelsequentie een factor die de werkzaamheid van WFISH kan beïnvloeden. Als etikettering niet succesvol is, wordt voorgesteld de PCR-etiketteringsmethode op een langer fragment te gebruiken of verschillende oligo's te ontwerpen die specifiek zijn voor het doelgebied.

De huidige methoden, gebaseerd op het gebruik van een penetrerende oplossing (1% Triton/0,1 M HCl in 1x PBST), maken een goed niveau van testispermeabilisatie en penetratie van de sondes mogelijk, wat resulteert in een succesvolle hybridisatiereactie. Oligo-sondes die specifiek zijn voor repetitieve sequenties van geslachtschromosomen kunnen worden ontworpen op basis van de uitgebreide karakterisering van repetitieve elementen uitgevoerd door Hall et al.20. Bovendien kunnen consensussequenties die specifiek zijn voor X- of Y-gebonden repetitieve elementen worden verkregen met behulp van een bio-informaticaplatform zoals de RedKmer-pijplijn30. Het is belangrijk op te merken dat geslachtschromosoomsondes zich kunnen richten op repetitieve elementen zoals satellieten en retrotransposons, en dat ze een ander niveau van hybridisatie kunnen hebben met de X- of Y-chromosomen, afhankelijk van de onderzochte soort 20,31,32. Zoals te zien is in figuur 3, maakte een goed niveau van hybridisatie van de sondes en een lage achtergrond de visualisatie van de beoogde chromosomen tijdens de spermatogenese mogelijk. De koppeling van gelabelde geslachtschromosomen kon worden gezien in de premeiotische en meiotische stadia. Dit werd gevolgd door het detecteren van de X- of de Y-chromosomen in haploïde celkernchromosomen die het resultaat waren van meiotische delingen. Vervolgens konden X- of Y-dragende spermatiden worden gevolgd tijdens de spermiogenese, gekenmerkt door verschillende niveaus van DNA-condensatie, tot de laatste stap van pijlvormige rijpe spermatozoa. In de huidige experimentele opstelling werden confocale Z-stacks gebruikt om informatie te verkrijgen over de 3D ruimtelijke organisatie van de cellen tijdens dit proces (Video 1).

Figure 1
Figuur 1: Testikels ontleed van poppen en 1 dag oude volwassen Anopheles gambiae mannetjes. (A) Een buik die in het late popstadium wordt ontleed en de positie van de teelballen in de nabijheid van het zesde abdominale segment laat zien. De teelballen zijn overal in de cuticula te herkennen en verschijnen als bruinachtige structuren aan beide zijden van de buik (met pijlen). (B) Testikels ontleed in het popstadium, met de rijpe teelballen (1), zaadleider (2), MAG's (3) en het ejaculatiekanaal (4). (C) Een buik ontleed van een volwassen mannetje van 1 dag oud na het verwijderen van het basale gespsegment. De MAG's kunnen uit de buik worden geplet door lichte druk uit te oefenen (witte pijl). (D) Mannelijk inwendig voortplantingsapparaat ontleed van een volwassen mannetje van 1 dag oud. De witte pijl geeft de positie aan die wordt ingenomen door rijpe zaadcellen, die verschijnen als een wit aggregaat aan de basale pool van de testis. Schaalstaven: (A,C) 200 μm; (B,D) 100 μm. De Romeinse cijfers van I tot VIII geven de abdominale segmenten aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Weergave van spermatogenese in Anopheles gambiae. De afbeelding aan de linkerkant toont een testis van een late pop van An. gambiae na DAPI-kleuring in het hele montuur. Aan de rechterkant is een schematische versie voor een betere visualisatie. Door de nucleaire vorm en het condensatieniveau te observeren, is het relatief eenvoudig om alle stadia van de spermatogenese te volgen, van diploïde cellen tot haploïde spermatozoa. De stamcelnis bevindt zich in de bovenste pool van het orgaan, waar de differentiatie tot spermatogonia begint. De spermatogonia-cellen nemen in aantal toe na mitotische deling (groene cellen) en de spermatocysten nemen in omvang toe (gele cellen). De spermatogonia-cellen differentiëren zich tot spermatocyten na meerdere rondes van mitotische delingen (blauwe bloedcellen). De spermatocyten, die worden gekenmerkt door relatief grotere kernen dan de cellen van de andere stadia van het proces, zijn de cellen die een meiotische deling zullen ondergaan. Cellen die meiose ondergaan, kunnen worden gedetecteerd door te kijken naar de aanwezigheid van chromosomen in verschillende meiotische stadia; Chiasmata en metafase chromosomen kunnen zelfs bij lage vergroting worden gedetecteerd. De premeiotische stadia zijn oververtegenwoordigd in teelballen die in het vroege popstadium worden ontleed. Na de eerste en tweede meiotische deling worden spermatiden geproduceerd en liggen ze meestal in het midden van de testis. De kernen van spermatiden vertonen een zekere mate van variatie in hun vorm, van een ronde tot een pijlachtige vorm. De spermatiden gaan het spermiogeneseproces in, waarbij de kernen beginnen te condenseren en hun structuur verandert in pijlachtige stippen. Wanneer muggen seksueel volwassen worden nadat ze zijn opgekomen, kunnen spermatocysten die rijpe spermacellen bevatten, het grootste deel van het testisvolume innemen ten koste van spermatocysten in een ander ontwikkelingsstadium. Schaalbalk: 20 μm. Het sterretje (*) geeft het apicale deel van de testis aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: WFISH op een An. gambiae testis ontleed vanaf het late popstadium. WFISH werd uitgevoerd met behulp van sondes die specifiek zijn voor de X(Contig_240) en Y-chromosomen (oligosonde specifiek voor AgY53B). (A) WFISH maakt het mogelijk om het gedrag van het geslachtschromosoom tijdens de spermatogenese te volgen van diploïde cellen tot haploïde spermatozoa. In deze afbeelding is het mogelijk om de dramatische veranderingen te waarderen die de kernen ondergaan tijdens de spermatogenese. Het labelen van de geslachtschromosomen maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen diploïde en haploïde cellen. In diploïde cellen is het signaal van de geslachtschromosomen gekoppeld aan dezelfde kernen. In haploïde cellen (spermatiden en spermatozoa) is het signaal van de geslachtschromosomen ontkoppeld vanwege de meiotische reductiedeling. (B,C) Een afbeelding met een hogere vergroting (63x) van de test wordt weergegeven in (A). Ze werden op verschillende posities langs de Z-as verworven. De witte gestippelde kaders geven het gebied van verwerving aan. (B) Het overgangsstadium tussen spermatocyten en spermatiden, met de vorming van haploïde cellen en de scheiding van de signalen van de geslachtschromosomen in afzonderlijke kernen. (C) Het overgangsstadium tussen haploïde spermatiden en rijpe spermatozoa. Deze fase toont de veranderingen in het nucleaire condensatieniveau; Rijpe spermatozoa vertonen een meer gecondenseerde en langwerpige vorm dan spermatiden. Schaalbalken: (A), 30 μm; (B,C), 10 μm; Grijs: DAPI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Doelvolgorde Primersequentie en Oligo-sonde consensus Referentie
Contig_240 (X) 5'-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3'-[Fluorochroom]		 19
AgY53B (Y) 5'AGAAGAATAGAATCAGAATAGTCGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3'-[Fluorochaat]		 Deze studie
AgY477-
AgY53B
aansluiting
regio (Y)		 5'-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT
GAAGAAACCGACTATTC-3'-[Fluorochaat]		 19
18S rDNA (X) F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		 19
AgY53B (Y) F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		 19

Tabel 1: Lijst van oligo-sondes die specifiek zijn voor het X- of Y-chromosoom in An. gambiae.

Video 1: Een 3D-stack op WFISH uitgevoerd op een An. gambiae testis ontleed vanaf het late popstadium. Om een 3D-weergave van het spermatogeneseproces te verkrijgen, kan een confocale 3D-stapeling worden uitgevoerd op testikels die een laag aantal structurele veranderingen vertonen. In deze studie werden de stacks uitgevoerd met een interval van 1,25 μm tussen twee optische secties onder een 63x of 40x olielens om geen informatie over de 3D ruimtelijke organisatie van de cellen te verliezen. Grijs: DAPI, geel: Contig_240 (X), magenta: AgY53B (Y). Klik hier om deze video te downloaden.

Discussion

Gewoonlijk vereisen FISH-protocollen het pletten van het orgaan van belang om chromosoomkleuring mogelijk te maken. Dit veroorzaakt een verlies van informatie over de ruimtelijke rangschikking van de cellen in dat orgaan33. Dit protocol beschrijft hoe biologische processen, zoals spermatogenese, in situ kunnen worden bestudeerd met behoud van de intacte natuurlijke structuur van de testis en de interne cytologische organisatie. Sondes die zich richten op verschillende DNA-repetitieve elementen, die bijzonder verrijkt zijn met geslachtschromosomen20, kunnen tegelijkertijd worden gebruikt om de dynamiek van de rijping van sperma te onthullen. Afhankelijk van de timing van de testisdissectie biedt WFISH de mogelijkheid om verschillende stadia van spermatogenese te bestuderen door middel van de ontwikkeling van muggen. WFISH is nuttig voor het bestuderen van specifieke fenomenen zoals hybride incompatibiliteit, die bij Anopheles-muggen te wijten is aan de aanwezigheid van meiotische defecten zoals premeiotisch falen en niet-disjunctie van geslachtschromosomen 19,34,35. Naast het biologische aspect is spermatogenese het doelwit van een aantal genetische strategieën die zijn ontwikkeld om plaaginsecten zoals Anopheles-muggen te bestrijden. In deze context is de X-gebonden rDNA-locus van An. gambiae gebruikt als doelwit om een synthetische geslachtsverhoudingsverstoorder te ontwikkelen, die, door X-dragende spermacellen te beschadigen, het nageslacht naar mannen neigt 4,8,13.

Deze technologie weerspiegelt de werking van meiotische driften van de natuurlijke geslachtsverhouding die zijn geïdentificeerd in verschillende taxa, waaronder muggen, maar die nog steeds slecht worden begrepen 28,36,37,38,39,40,41. WFISH biedt de mogelijkheid om dit fenomeen te onderzoeken en maakt de weg vrij voor het verfijnen of verbeteren van genetische strategieën op basis van geslachtsvervorming door bijvoorbeeld informatie te verstrekken over hoe de cytologie van de spermaproductie wordt beïnvloed door de keuze van de doellocaties die worden gebruikt voor het versnipperen van geslachtschromosomen. Hoewel onze ervaring is dat WFISH een grote kans op succes heeft, kan er nog steeds een mislukking optreden. Dit kan te wijten zijn aan een inefficiënt niveau van weefselpermeabilisatie, dat kan worden overwonnen door de incubatietijd van de penetrerende oplossing te verlengen. Als alternatief kan proteïnase K worden gebruikt tijdens de permeabilisatiestap. In sommige gevallen merkten we een niet-uniform niveau van sondepenetratie op, met een hoger signaal in spermatocytenkernen en een lager of afwezig signaal in de meiotische en spermiogenesestadia. Dit kan te wijten zijn aan een verschil in het permeabilisatieniveau, afhankelijk van het celstadium. Bovendien bleek WFISH waardevol te zijn bij het gebruik van fluorescerende sondes die zijn ontworpen om DNA-sequenties te targeten die in hoge aantallen kopieën aanwezig zijn. Bij het richten op genen met één kopie is de signaaldetectie mogelijk niet voldoende. In dit geval moeten methoden voor signaalversterking, zoals tyramidesignaalversterking (TSA), worden geïntegreerd42.

Dit protocol zou kunnen worden gekoppeld aan immunokleuring of aan transgene reporterstammen die kiembaanspecifieke fluorescerende markers herbergen16,18, omdat dit informatie zou toevoegen over eiwitlokalisatie en genexpressie in situ. In dit werk wordt WFISH beschreven als een techniek om spermatogenese in Anopheles-muggen te onderzoeken; Gezien de gedeelde anatomie van mannelijke voortplantingsorganen, zou dit protocol echter kunnen worden toegepast op andere muggensoorten die een rol spelen bij de overdracht van ziekten. Op dezelfde manier zou met deze techniek de vrouwelijke gametogenese kunnen worden onderzocht. Bovendien kunnen cytologische studies in organen of weefsels van belang, zoals de middendarm van de mug, die een doelwit is voor parasitaire invasie, of atypische genetische achtergronden, zoals die bij hybride muggen, worden onderzocht43. Bovendien kan deze techniek mogelijk worden overgedragen op andere organismen binnen de Diptera-orde.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Bill & Melinda Gates Foundation en Open Philanthropy. We danken de Facility for Imaging by Light Microscopy (FILM) van het Imperial College London voor de microscopie-analyse. Figuur 2 is gemaakt met Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP Cytiva PA53022
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP Cytiva PA55022
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips ThermoFisher Scientific 2079GPK
CytoBond Removable Coverslip Sealant SciGene 2020-00-1
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich D8906-5G
DNeasy Blood & Tissue Kits  Qiagen 69504
Embryo Dishes VWR 70543-30
Ethanol, molecular grade Sigma-Aldrich 51976
Formamide ThermoFisher Scientific 17899
GoTaq G2 DNA Polymerase Promega M7841
Hydrochloric acid, 37% Sigma-Aldrich 320331
Microscope slides, SuperFrost VWR  631-0114
PBS (10x), pH 7.4 ThermoFisher Scientific 70011044
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free ThermoFisher Scientific 28906
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36941
RNase A/T1 Mix ThermoFisher Scientific EN0551
Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U1330
Sodium Acetate Solution ThermoFisher Scientific R1181
SP8 inverted confocal microscope Leica
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379
UltraPure Salmon Sperm DNA Solution ThermoFisher Scientific 15632011
UltraPure SSC 20x ThermoFisher Scientific 15557044
Primer sequences
5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics Contig_240 (X)
5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT
CGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics AgY53B (Y)
5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA
T
GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome]		 Eurofins Genomics AgY477-
AgY53B
junction
region (Y)
F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		 Eurofins Genomics 18S rDNA (X)
F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		 Eurofins Genomics AgY53B (Y)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2022 (2022).
  2. Bhatt, S., et al. The effect of malaria control on Plasmodium falciparum in Africa between 2000 and 2015. Nature. 526 (7572), 207-211 (2015).
  3. Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
  4. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5 (1), 3977 (2014).
  5. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  6. Simoni, A., et al. A male-biased sex-distorter gene drive for the human malaria vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 38 (9), 1054-1060 (2020).
  7. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), E6736-E6743 (2015).
  8. Bernardini, F., Kriezis, A., Galizi, R., Nolan, T., Crisanti, A. Introgression of a synthetic sex ratio distortion system from Anopheles gambiae into Anopheles arabiensis. Scientific Reports. 9 (1), 5158 (2019).
  9. Hammond, A. M., Galizi, R. Gene drives to fight malaria: Current state and future directions. Pathogens and Global Health. 111 (8), 412-423 (2017).
  10. Garrood, W. T., et al. Driving down malaria transmission with engineered gene drives. Frontiers in Genetics. 13, 891218 (2022).
  11. Hoermann, A., et al. Gene drive mosquitoes can aid malaria elimination by retarding Plasmodium sporogonic development. Science Advances. 8 (38), (2022).
  12. Nash, A., et al. Integral gene drives for population replacement. Biology Open. 8 (1), (2019).
  13. Galizi, R., et al. A CRISPR-Cas9 sex-ratio distortion system for genetic control. Scientific Reports. 6 (1), 31139 (2016).
  14. Terradas, G., Hermann, A., James, A. A., McGinnis, W., Bier, E. High-resolution in situ analysis of Cas9 germline transcript distributions in gene-drive Anopheles mosquitoes. G3: Genes, Genomes, Genetics. 12 (1), (2022).
  15. Durant, A. C., Donini, A. Ammonium transporter expression in sperm of the disease vector Aedes aegypti mosquito influences male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (47), 29712-29719 (2020).
  16. Taxiarchi, C., et al. High-resolution transcriptional profiling of Anopheles gambiae spermatogenesis reveals mechanisms of sex chromosome regulation. Scientific Reports. 9 (1), 14841 (2019).
  17. Pompon, J., Levashina, E. A. A new role of the mosquito complement-like cascade in male fertility in Anopheles gambiae. PLoS Biology. 13 (9), e1002255 (2015).
  18. Papathanos, P. A., Windbichler, N., Menichelli, M., Burt, A., Crisanti, A. The vasa regulatory region mediates germline expression and maternal transmission of proteins in the malaria mosquito Anopheles gambiae: A versatile tool for genetic control strategies. BMC Molecular Biology. 10 (1), 13 (2009).
  19. Liang, J., Sharakhov, I. V. Premeiotic and meiotic failures lead to hybrid male sterility in the Anopheles gambiae complex. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1906), 20191080 (2019).
  20. Hall, A. B., et al. Radical remodeling of the Y chromosome in a recent radiation of malaria mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), E2114-E2123 (2016).
  21. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. , CABI. Wallingford, Oxfordshire. (1992).
  22. Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 218-227 (2014).
  23. Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G. Radiation biology of mosquitoes. Malaria Journal. 8, S6 (2009).
  24. Huho, B. J., et al. A reliable morphological method to assess the age of male Anopheles gambiae. Malaria Journal. 5 (1), 62 (2006).
  25. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
  26. Li, M., et al. Suppressing mosquito populations with precision guided sterile males. Nature Communications. 12 (1), 5374 (2021).
  27. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13677-13681 (2011).
  28. Haghighat-Khah, R. E., et al. Cellular mechanisms regulating synthetic sex ratio distortion in the Anopheles gambiae germline. Pathogens and Global Health. 114 (7), 370-378 (2020).
  29. Yamamoto, D. S., et al. A synthetic male-specific sterilization system using the mammalian pro-apoptotic factor in a malaria vector mosquito. Scientific Reports. 9 (1), 8160 (2019).
  30. Papathanos, P. A., Windbichler, N. Redkmer: An assembly-free pipeline for the identification of abundant and specific X-chromosome target sequences for X-shredding by CRISPR endonucleases. The CRISPR Journal. 1 (1), 88-98 (2018).
  31. Sharma, A., Kinney, N. A., Timoshevskiy, V. A., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. Structural variation of the X chromosome heterochromatin in the Anopheles gambiae complex. Genes. 11 (3), 327 (2020).
  32. Krzywinski, J., Sangaré, D., Besansky, N. J. Satellite DNA from the Y chromosome of the malaria vector Anopheles gambiae. Genetics. 169 (1), 185-196 (2005).
  33. Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (67), e4215 (2012).
  34. Liang, J., Hodge, J. M., Sharakhov, I. V. Asymmetric phenotypes of sterile hybrid males from reciprocal crosses between species of the Anopheles gambiae complex. Frontiers in Ecology and Evolution. 9, 660207 (2021).
  35. Slotman, M., Torre, A. D., Powell, J. R. The genetics of inviability and male sterility in hybrids between Anopheles gambiae and An. arabiensis. Genetics. 167 (1), 275-287 (2004).
  36. Wood, R. J., Newton, M. E. Sex-ratio distortion caused by meiotic drive in mosquitoes. The American Naturalist. 137 (3), 379-391 (1991).
  37. Cazemajor, M., Joly, D., Montchamp-Moreau, C. Sex-ratio meiotic drive in Drosophila simulans is related to equational nondisjunction of the Y chromosome. Genetics. 154 (1), 229-236 (2000).
  38. Jaenike, J. Sex chromosome meiotic drive. Annual Review of Ecology and Systematics. 32 (1), 25-49 (2001).
  39. Courret, C., Chang, C. H., Wei, K. H., Montchamp-Moreau, C., Larracuente, A. M. Meiotic drive mechanisms: Lessons from Drosophila. Proceedings of the Royal Society B. 286 (1913), 20191430 (2019).
  40. Zanders, S. E., Unckless, R. L. Fertility costs of meiotic drivers. Current Biology. 29 (11), R512-R520 (2019).
  41. Newton, M. E., Wood, R. J., Southern, D. I. A cytogenetic analysis of meiotic drive in the mosquito, Aedes aegypti (L.). Genetica. 46 (3), 297-318 (1976).
  42. Carabajal Paladino, L. Z., Nguyen, P., Šíchová, J., Marec, F. Mapping of single-copy genes by TSA-FISH in the codling moth, Cydia pomonella. BMC Genomic Data. 15, S15 (2014).
  43. Bernardini, F., et al. Cross-species Y chromosome function between malaria vectors of the Anopheles gambiae species complex. Genetics. 207 (2), 729-740 (2017).

Tags

Whole-Mount Fluorescentie In Situ Hybridisatie Spermatogenese Anopheles Mosquito Genetische Technologieën Gene Drive Synthetische Geslachtsverhoudingsverstoorders Ongedierte-insectenpopulaties Mendeliaanse overerving Sperma Geslachtsverhouding Anopheles Gambiae Malaria Vector Cytologisch Model Cel Nucleaire Structuur Fluorescerende Probes VISSEN Voortplantingsorganen Genomische Regio's
Whole-Mount Fluorescentie <em>In Situ</em> Hybridisatie om Spermatogenese in de <em>Anopheles-mug</em> te bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vitale, M., Liang, J., Sharakhov,… More

Vitale, M., Liang, J., Sharakhov, I., Bernardini, F. Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito. J. Vis. Exp. (195), e65356, doi:10.3791/65356 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter