In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht des Kohlweißlings unter kontrollierten Laborbedingungen mit einer künstlichen Ernährung vorgestellt, die eine präzise Manipulation der Ernährung in jungen Jahren und der Toxinexposition ermöglicht. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, wie die Schwermetalltoxizität mit diesem Protokoll untersucht werden kann.
Der Kohlweißling (Pieris rapae) ist ein wichtiges System für die angewandte Schädlingsbekämpfungsforschung und die Grundlagenforschung in der Verhaltens- und Ernährungsökologie. Kohlweißling kann leicht unter kontrollierten Bedingungen mit einer künstlichen Ernährung aufgezogen werden, was ihn zu einem Modellorganismus der Schmetterlingswelt macht. In dieser Arbeit wird eine Manipulation der Schwermetallexposition verwendet, um grundlegende Methoden zur Aufzucht dieser Art zu veranschaulichen. Das allgemeine Protokoll veranschaulicht, wie Schmetterlinge im Freiland gefangen, dazu gebracht werden können, Eier in Gewächshauskäfige zu legen, und als Larven in künstliche Ernährung überführt werden können. Die Methoden zeigen, wie Schmetterlinge für eine Vielzahl von Forschungsfragen markiert, vermessen und untersucht werden können. Die repräsentativen Ergebnisse geben eine Vorstellung davon, wie künstliche Diäten, die in ihren Bestandteilen variieren, verwendet werden können, um die Leistung von Schmetterlingen im Vergleich zu einer Kontrolldiät zu bewerten. Genauer gesagt waren Schmetterlinge am tolerantesten gegenüber Nickel und am wenigsten tolerant gegenüber Kupfer, mit einer Toleranz von Zink irgendwo in der Mitte. Mögliche Erklärungen für diese Ergebnisse werden diskutiert, darunter die Hyperakkumulation von Nickel in einigen Senfwirtspflanzen und jüngste Hinweise bei Insekten, dass Kupfer giftiger sein könnte als bisher angenommen. Schließlich werden in der Diskussion zunächst Variationen des Protokolls und Anweisungen zur Fehlerbehebung dieser Methoden besprochen, bevor erörtert wird, wie zukünftige Forschung die in dieser Studie verwendete künstliche Ernährung weiter optimieren könnte. Insgesamt bietet dieses Protokoll einen detaillierten Videoüberblick über die Aufzucht und Messung von Kohlweißling mit künstlicher Ernährung und bietet eine Ressource für den Einsatz dieses Systems in einer Vielzahl von Studien.
Der Kleine Kohlweißling (Pieris rapae, im Folgenden “Kohlweißling”) ist eine kosmopolitische Schädlingsart von Senfkulturen wie Kohl, Brokkoli und Raps 1,2,3. Gleichzeitig ist der Kohlweißling ein leistungsfähiges System für die Forschung in der Biologie und ein häufig verwendetes Schmetterlingsmodell, da er in kontrollierten Laborexperimenten leicht aufgezogen und manipuliert werden kann 4,5. Die Forschung an Kohlweißlingen hat wichtige Erkenntnisse in Bezug auf die Wirtssuche 6,7,8, die Nutzung von Nektarressourcen9,10,11, die Partnerwahl und sexuelle Selektion 12,13,14, die Entwicklung und Evolution von Flügelmustern15,16,17 und die Reaktionen auf neue und sich verändernde Umgebungen18,19. Viele dieser Erkenntnisse beruhen auf der Tatsache, dass Kohlweißling mit künstlichem Futter 4,20,21 gezüchtet werden kann, das präzise manipuliert werden kann, um schlechte Ernährungsbedingungen 22,23, ökologisch relevante Schadstoffwerte 24,25,26,27 oder Übergänge zu neuartigen Wirtspflanzen28,29 widerzuspiegeln . In der vorliegenden Arbeit werden anhand eines Experiments zur Schwermetallexposition grundlegende Methoden zur Aufzucht von Kohlweißlingen mit künstlicher Diät im Labor sowie wichtige Leistungsmaße von Larven und adulten Tieren veranschaulicht. Viele Aspekte dieser Methoden gelten auch für andere Schmetterlinge 30,31 und Motten32,33,34, die mit künstlicher Nahrung aufgezogen werden können.
In dieser Arbeit wird ein Experiment zur Metalltoleranz verwendet, um die allgemeinen Methoden zur Aufzucht von Kohlweißlingen zu veranschaulichen. Schwermetalle sind ein häufiger anthropogener Schadstoff, der durch den Abbau menschlicher Produkte, industrieller Prozesse und Altlasten durch die historische Verwendung in Pestiziden, Farben und anderen Produkten entsteht35,36,37,38. Viele Schwermetalle, darunter Blei, Kupfer, Zink und Nickel, können aus Boden und Wasser in das Pflanzengewebe gelangen 39,40,41,42, und Metalle im Staub können sich auf Pflanzenblättern ablagern 43,44,45, was zu mehreren Expositionswegen gegenüber phytophagen Insektenlarven führt. Eine frühe Schwermetallexposition kann negative Auswirkungen auf die Entwicklung der Tiere haben, insbesondere auf das Nervengewebe, und hohe Konzentrationen können tödlich sein 35,36,46,47,48. Eine Reihe von Studien hat die negativen Auswirkungen der Metallbelastung auf sich entwickelnde Insekten gezeigt, sowohl auf Schädlinge als auch auf nützliche Insekten 49,50,51. Die große Anzahl von Schwermetallschadstoffen und die Tatsache, dass sie häufig gleichzeitig in der menschlichen Umwelt vorkommen52, bedeutet, dass präzise Labormethoden erforderlich sind, mit denen Forscher sich entwickelnde Insekten unterschiedlichen Konzentrationen und Kombinationen verschiedener Metalle aussetzen können, um ihre Umweltauswirkungen zu verstehen und abzumildern.
Die vorliegende Arbeit vergleicht die Auswirkungen gängiger Metalle auf das Überleben und die Entwicklung von Kohlweißlingen, wobei der Schwerpunkt auf Kupfer (Cu), Zink (Zn) und Nickel (Ni) liegt, drei häufige Schadstoffe in der menschlichen Umwelt. Zum Beispiel enthalten Kräuter von ländlichen Straßenrändern in Minnesota bis zu 71 ppm Zn, 28 ppm Cu und 5 ppm Ni53. Dieses Experiment manipuliert den Gehalt dieser Metalle in der künstlichen Ernährung von Kohlweißfaltern auf Konzentrationen, die den in der Umwelt beobachteten Werten entsprechen und diese übertreffen. Eine künstliche Diät wird verwendet, um die relative Toxizität dieser Metalle zu kontrastieren, indem vorhergesagt wird, dass Kohlweißling empfindlicher auf Metallschadstoffe reagieren würde, die kein integraler Bestandteil ihrer Physiologie sind (Nickel), im Vergleich zu denen, die, wenn auch in geringen Mengen, in Enzymen und Geweben (Kupfer und Zink; Abbildung 1). Durchgehend bietet dieser Text methodische Details und begleitende Videovisualisierungen, um die Aufzucht- und Forschungsmethoden dieses wichtigen Schmetterlingsmodellsystems zu veranschaulichen.
In dieser Studie wurden Kohlweißlinge (Pieris rapae) mit einer künstlichen Diät gezüchtet, um Unterschiede in der Schwermetalltoxizität zu untersuchen. Dabei liefert diese Studie allgemeine Methoden für die Aufzucht und Laboruntersuchungen dieses leicht zu manipulierenden Schmetterlingssystems. In dieser Diskussion werden zunächst allgemeinere Fragen zu den hier vorgestellten Methoden erörtert, dann unsere wissenschaftlichen Erkenntnisse besprochen und abschließend Überlegungen zu den Bestandteilen der künstlichen Ernährung angestellt.
Das hier besprochene Protokoll enthält Schritte einer allgemeinen Aufzuchtmethode für Kohlweißlinge, aber es gibt viele Punkte innerhalb dieses Protokolls, die optimiert werden können. Während beispielsweise in der hier vorgestellten Fallstudie Schwämme zum Fressen verwendet werden, hatten andere Forscher Glück mit Zahndochten und Seidenblumen, die mit Honigwasser gefüllt sind5. Während in der vorliegenden Studie Honigwasser als Lebensmittel verwendet wird, haben andere Forscher Zuckerlösungen und sogar Gatorade verwendet. Wenn Puppen gewogen oder zum Schlüpfen an andere Bedingungen gebracht werden müssen (z. B. Diapause und 1 Monat lang gekühlt lagern), kann der Forscher sie leicht aus den Bechern entfernen, indem er sie mit Wasser besprüht, um ihre Seidenaufsätze zu befeuchten, und sie mit einer Federzange greift und sie dann mit doppelseitigem Klebeband wieder aufhängt. Wenn Forscher mehr Flexibilität benötigen, wann erwachsene Schmetterlinge für erwachsenes Verhalten in Käfige gebracht werden, können sie mehrere Wochen im Kühlschrank aufbewahrt werden, müssen aber gefüttert werden. Alle paar Tage sollten die Schmetterlinge herausgenommen werden, um mit einer verdünnten Honigwasserlösung gefüttert zu werden. Bei Innenbeleuchtung kann dies durch die Verwendung eines Stifts erfolgen, um den Rüssel in das Essen einzurollen. Auf der Leistungsseite der Erwachsenen kann eine Vielzahl von Fitnessmaßnahmen an Kohlweißlingen durchgeführt werden. Die Körpergröße kann als nasse oder trockene Masse von Larven in bestimmten Stadien, Puppen oder Erwachsenen (geopfert oder in Pergaminhüllen gehalten) oder durch die Messung der Flügellänge im Programm ImageJ gemessen werden (siehe 12,24,25,28). Die Lebenszeitfruchtbarkeit von Weibchen kann durch tägliche Eisammlungen an Wirtspflanzen gemessen werden 25,69,70, und die Größe bestimmter Merkmale kann als Leistungsmaßstab gemessen werden; beispielsweise die Masse oder das Volumen des Gehirns oder einzelner Hirnregionen 62,71,72 oder der Masse- oder Proteingehalt des Brustkorbs oder des Flugmuskels 62,70. Schließlich können Erwachsene in Verhaltensstudien verwendet werden, um eine beliebige Anzahl von Fragen zu testen, die die Auswirkungen von Ernährungsmanipulationen auf die Nahrungssuche oder die Wahl der Eiablage untersuchen27,73.
Wenn das Aufzuchtprotokoll nicht wie erwartet funktioniert, gibt es einige Aspekte, die behoben werden müssen. Zunächst kann man sich fragen, ob die Lichtverhältnisse hoch genug sind, um ein normales Verhalten von Erwachsenen hervorzurufen. Während im Labor angepasste Pieris-Linien unter fluoreszierendem Licht Eier legen, ist das einzige künstliche Licht, das für Wildtyp-Linien funktioniert, leistungsstarke Breitspektrum-Gewächshauslampen. Natürliches Licht in Gewächshäusern, Fensterbänken oder im Freien funktioniert am besten, um das Paarungs- und Eiablageverhalten hervorzurufen. Zweitens, wenn die Eier nicht schlüpfen oder wenn die Larven früh in der Entwicklung sterben, gibt es ein paar Dinge zu beachten. Das Material der Wirtspflanze muss organisch sein, wobei zu beachten ist, dass “biologische” Pflanzen aus Geschäften manchmal mit Chemikalien behandelt werden, die Larven abtöten können, so dass es oft am besten ist, eigene Wirtspflanzen aufzuziehen. Wenn die Akzeptanzrate des Wirts niedriger ist, können jüngere Blätter mit höherem Stickstoffgehalt ausprobiert werden, wobei Topfpflanzen anstelle von Einzelblättern präsentiert werden und sichergestellt wird, dass die Weibchen gepaart werden. Weibchen akzeptieren die Aussaat von Kohl, sogar kleine Sprossen, die 2 Wochen alt sind. Die Paraffinmethode eignet sich gut, um Eier unter verschiedenen Bedingungen zu überführen, aber es sollte beachtet werden, dass die Akzeptanzrate tendenziell niedriger ist als bei ganzen Pflanzen. Drittens müssen alle Bestandteile der Diät von hoher Qualität sein und dürfen nicht abgelaufen sein. Leinsamenöl sollte jährlich ausgetauscht und24,25 im Kühlschrank aufbewahrt werden. Auch Weizenkeime, die Vitaminmischung und Antibiotika sollten kühl gehalten werden. Viertens kann man in Betracht ziehen, das Diättassen-Setup zu optimieren. Für die Aufzucht kann eine beliebige Anzahl von Einweg-Plastikbechertypen verwendet werden, von 1 oz bis 15 oz. Wir haben festgestellt, dass 4 Unzen eine gute Größe sind, um das Schlüpfen von Erwachsenen zu ermöglichen, und sich gut in unsere Klimakammern packen lassen. Löcher in den Deckeln ermöglichen einen Luftstrom, aber zu viele Löcher können die Nahrung bei niedriger Luftfeuchtigkeit austrocknen, so dass diese Zahl möglicherweise angepasst werden muss. Fünftens müssen die Bedingungen in der Klimakammer möglicherweise in Kombination mit den Becherbedingungen angepasst werden. Wenn die Bedingungen zu trocken sind, können Wirtspflanzen mit Eiern austrocknen, bevor Larven übertragen werden können, und Becher mit Nahrung können austrocknen, bevor Schmetterlinge schlüpfen. Auf der anderen Seite, wenn die Bedingungen zu nass sind, können die Becher Schimmel und Krankheiten beherbergen. Forscher müssen möglicherweise den Luftstrom in den Bechern durch die Verwendung von Netzdeckeln oder mehr oder weniger Löchern in den Deckeln anpassen. Ein weiteres häufiges Problem sind Kammerleuchten, die hell genug sind, um Temperaturschwankungen in den Tassen und eine Bildung von Kondenswasser zu verursachen. Die Verwendung von Dimmleuchten ist eine einfache Option für die Larvenaufzucht.
In Bezug auf die Forschungsfragen in dieser Arbeit ergab diese Studie, dass Kohlweiß relativ empfindlicher auf Kupfer reagiert als auf Nickel oder Zink. Kupfer hatte signifikante negative Auswirkungen auf die Entwicklungszeit bei Konzentrationen von nur 50 ppm (Abbildung 3 und Tabelle 3) und auf das Überleben bei 500 ppm (Abbildung 4, Tabelle 4). Im Gegensatz dazu gab es keine negativen Auswirkungen von Nickel auf das Überleben (bis zu 500 ppm; Abbildung 3) oder negative Auswirkungen auf die Entwicklungszeit bei 100 ppm (Abbildung 4). Kohlweißlinge waren ziemlich tolerant gegenüber Zink, wobei Überlebenseffekte erst bei 1.000 ppm beobachtet wurden (Abbildung 3) und negative Auswirkungen auf die Entwicklungszeit ab 100 ppm (Abbildung 4). Aufgrund der relativ höheren Konzentrationen von Zink im Schmetterlingsgewebe und im Senf (ihrer Wirtspflanze; Abbildung 1) wurde erwartet, dass eine relativ größere Toleranz gegenüber Zink zu beobachten sein würde. Die Empfindlichkeit gegenüber Kupfer und die Toleranz gegenüber Nickel waren jedoch angesichts des sehr geringen Nickelgehalts im Schmetterlingsgewebe (Abbildung 1) und der Notwendigkeit von Kupfer als Mikronährstoff etwas unerwartet. Diese unerwarteten Ergebnisse werden im Folgenden erörtert, nachdem die Toleranz dieser Metalle bei anderen Schmetterlingen und Motten berücksichtigt wurde.
Um die vorliegenden Daten mit der bei anderen Schmetterlingen gemessenen Metallsensitivität zu vergleichen, wurden Daten aus bestehenden Studien zur Mindestkonzentration zusammengestellt, bei der Schwermetalle das Überleben negativ beeinflussten 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; Diese Studien konzentrierten sich auf Nachtfalter, insbesondere auf Schädlingsarten (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Alle in dieser Studie gemessenen Sensitivitätswerte liegen in der Nähe des Bereichs, der für diese anderen Arten gemessen wurde (Abbildung 5). Das Maß für die Nickeltoleranz in dieser Studie scheint jedoch höher zu sein als erwartet – während es bei 500 ppm keinen signifikanten Effekt auf das Überleben gab, fand die vorherige Studie an Pieris rapae auch eine sehr hohe Toleranz für Nickel (signifikante Effekte ab 1.000 ppm56), trotz niedriger Konzentrationen in ihrem Gewebe (Abbildung 1). Das Maß für die Kupfersensitivität in dieser Studie scheint auch für Studien an Lepidoptera am unteren Ende zu liegen. Während die Verwendung einer künstlichen Diät einen bequemen und kontrollierten Vergleich der relativen Metallsensitivität ermöglicht, ist es wichtig zu beachten, dass Komponenten der Diät die Messung der absoluten Metallsensitivität verändern können. Zum Beispiel könnte Vitamin C in der Nahrung metallinduzierten oxidativen Stress ausgleichen74, oder Antibiotika in der Nahrung könnten die Auswirkungen von Mikroben auf die Verarbeitung von Metallen verändern75. Ein interessanter zukünftiger Forschungszweig wäre die systematische Manipulation solcher Nahrungskomponenten, um die Auswirkungen auf die Metalltoxizität zu testen, insbesondere angesichts der Frage nach der funktionellen Rolle von Lepidoptera-Darmmikroben 76,77 und Nektarkomponenten, die antioxidative Eigenschaften haben könnten78. Darüber hinaus können unterschiedliche Ernährungsbedürfnisse zwischen den Arten interspezifische Vergleiche erschweren, und künstliche Ernährungsmethoden sollten durch Manipulationen von Wirtspflanzen ergänzt werden.
Diese Schmetterlinge sind besonders tolerant gegenüber Nickel und empfindlich gegenüber Kupfer. Frühere Forschungen haben ergeben, dass viele Pflanzen aus der Familie der Senfgewächse, zu denen auch Pflanzen gehören, die von Pieridae bevorzugt werden, Nickel als Abwehrmechanismus gegen Pflanzenfresser überakkumulieren 55,56,63,79,80,81. Diese Hyperakkumulation beträgt über 1.000 ppm im Pflanzengewebe, was um Größenordnungen größer ist als bei den meisten Pflanzen (Abbildung 1). Es ist möglich, dass Pieris aufgrund der früheren Selektion durch solche Nickelakkumulatoren eine besonders hohe Toleranz für Nickel haben, wie bereits spekuliertwurde 26. Während Kupfer weniger häufig als Mikronährstoff in der Ernährung von Insekten untersucht wurde, gibt es einige Hinweise darauf, dass es eine geringe Rolle bei der Fortpflanzung und Immunität spielt, wenn auch hauptsächlich bei blutsaugenden Insekten (z. B. 82,83). Es ist möglich, dass Kupfer bei Schmetterlingen eine weniger wichtige physiologische Rolle spielt als bei anderen Tieren 84,85,86, was mit neueren Arbeiten übereinstimmt, die hervorheben, dass Kupfer als Schadstoff für Insekten ebenso besorgniserregend sein kann wie Blei, Cadmium und Quecksilber (z. B. 87,88,89). Während sich gezeigt hat, dass Pieris eine Kupferkontamination in niedrigen Konzentrationen vermeidet90, hat die Mobilität von Kupfer in Pflanzen (z. B. das Eindringen in Blätter und Blüten) es auch als besorgniserregende Metallverunreinigung gekennzeichnet91.
Während diese Ergebnisse interessante Daten über die relative Toxizität dieser Metalle für Kohlweißlinge liefern, zielt diese Arbeit auch darauf ab, als detaillierte visuelle Illustration von Methoden zur Aufzucht dieses leistungsstarken Systems von allgemeinem Nutzen zu sein. Kohlweißling ist in kontrollierten Laborexperimenten leicht zu züchten und zu manipulieren 4,5, was Studien zur Wirtssuche 6,7,8, zur Nahrungssuche 9,10,11 und zur sexuellen Selektion 12,13,14 erleichtert. Die Fähigkeit, diese Schmetterlinge mit einer künstlichen Ernährung zu züchten, ist der Schlüssel zur Schaffung gemeinsamer Gartenbedingungen für Vergleiche und zur Manipulation von Nährstoffen, Toxinen und sogar neuartigen Wirtspflanzen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese künstliche Ernährung nicht unbedingt die optimale künstliche Ernährung für diese Art ist und wahrscheinlich durch zukünftige Manipulationen verbessert werden könnte. Zum Beispiel wurde die Salzmischung in dieser Diät (und anderen Lepidoptera-Diäten) ursprünglich für Wirbeltiere entwickelt und hat einen höheren Kalziumgehalt als das, was die meisten Insekten benötigen92,93. So haben einige unserer Aufzuchtbemühungen maßgeschneiderte Salzmischungen mit niedrigerem Kalziumgehalt hergestellt (z. B. 62), und andere verwenden “Becks Salzmischung”, die für viele Insektenarten besser geeignet ist94. In unseren eigenen Manipulationen fanden wir auch heraus, dass Schmetterlinge mit relativ weniger Weizenkeimen und relativ mehr Zellulose im Vergleich zu den ursprünglichen Konzentrationen besser abschnitten4. Ein Bereich, der weiterer Aufmerksamkeit bedarf, ist die Lipidquelle und -konzentration in der Ernährung. Frühere Arbeiten haben beispielsweise gezeigt, dass die Umstellung von Leinöl (das in dieser Studie verwendet wurde) auf Phospholipide die Paarungsraten und Wachstumsraten von Pieris bei künstlicher Ernährung erhöhte95. Die Supplementierung bestimmter Fettsäuren in der künstlichen Ernährung kann zusätzliche positive Auswirkungen haben96,97. Die Optimierung der künstlichen Ernährung von Pieris98,99 schafft Möglichkeiten, interessante Fragen zur Ernährungsökologie 100,101,102, zur Evolutionsökologie und zur Ökotoxikologie zu beantworten. Diese Ansätze der künstlichen Ernährung ermöglichen es den Forschern, Fragen zur Rolle bestimmter Lipide in der kognitiven Evolution 103, zur Voranpassung an Toxine28, zu Nahrungskomponenten, die die Toxizität von Schadstoffen reduzieren104, oder zu stöchiometrischen Wechselwirkungen zwischen Nährstoffen105 zu beantworten.
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar für die Unterstützung durch studentische Hilfskräfte während der Aufzucht für diese Arbeit, insbesondere Regina Kurandina und Rhea Smykalski. Carolyn Kalinowski half bei der Zusammenstellung von Literatur über die Toxizität von Metallen bei anderen Schmetterlingen. Diese Arbeit wurde durch ein Sommerforschungsstipendium des Department of Ecology, Evolution, and Behavior der University of Minnesota ermöglicht.
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