Summary

Mikroinjektion von rekombinantem RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinse

Published: September 01, 2023
doi:

Summary

Dieses Protokollpapier beschreibt die Methodik der Mikroinjektion eines RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinsen als Werkzeug zur Untersuchung der In-situ-Funktion und Expression von Proteinen während der Linsenentwicklung.

Abstract

Das embryonale Huhn (Gallus domesticus) ist aufgrund seiner hohen Ähnlichkeit mit der menschlichen Linse ein etabliertes Tiermodell für die Untersuchung der Linsenentwicklung und -physiologie. RCAS(A) ist ein replikationskompetentes Hühner-Retrovirus, das sich teilende Zellen infiziert und als leistungsfähiges Werkzeug dient, um die In-situ-Expression und -Funktion von Wildtyp- und Mutantenproteinen während der Linsenentwicklung durch Mikroinjektion in das leere Lumen des Linsenvesikels in frühen Entwicklungsstadien zu untersuchen und seine Wirkung auf die umgebenden proliferierenden Linsenzellen zu beschränken. Im Vergleich zu anderen Ansätzen, wie z.B. transgenen Modellen und ex vivo Kulturen, bietet die Verwendung eines RCAS(A)-replikationskompetenten aviären Retrovirus ein hocheffektives, schnelles und anpassbares System zur Expression exogener Proteine in Kükenembryonen. Insbesondere kann der gezielte Gentransfer auf proliferative Linsenfaserzellen beschränkt werden, ohne dass gewebespezifische Promotoren erforderlich sind. In diesem Artikel geben wir einen kurzen Überblick über die Schritte, die für die Herstellung des rekombinanten Retrovirus RCAS(A) erforderlich sind, geben einen detaillierten, umfassenden Überblick über das Mikroinjektionsverfahren und stellen Beispielergebnisse der Technik zur Verfügung.

Introduction

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Methodik der Mikroinjektion eines RCAS(A) (replikationskompetentes aviäres Sarkom/Leukose-Retrovirus A) in embryonale Hühnerlinsen zu beschreiben. Die effektive retrovirale Verabreichung in eine embryonale Hühnerlinse hat sich als vielversprechendes Werkzeug für die In-vivo-Untersuchung des molekularen Mechanismus und der Strukturfunktion von Linsenproteinen in normaler Linsenphysiologie, pathologischen Bedingungen und Entwicklung erwiesen. Darüber hinaus könnte dieses experimentelle Modell für die Identifizierung therapeutischer Ziele und das Screening von Medikamenten für Erkrankungen wie den menschlichen kongenitalen Katarakt verwendet werden. Insgesamt zielt dieses Protokoll darauf ab, die notwendigen Schritte für die Entwicklung einer anpassbaren Plattform für die Untersuchung von Linsenproteinen festzulegen.

Embryonale Küken (Gallus domesticus) sind aufgrund ihrer Ähnlichkeit in Linsenstruktur und -funktion mit der menschlichen Linse ein etabliertes Tiermodell für die Untersuchung der Linsenentwicklung und -physiologie 1,2,3,4. Die Verwendung eines RCAS(A)-replikationskompetenten aviären Retrovirus gilt als hocheffektives, schnelles und anpassbares System zur Expression exogener Proteine in Kükenembryonen. Insbesondere hat es eine einzigartige Fähigkeit, den Zielgentransfer auf proliferative Linsenfaserzellen zu beschränken, ohne dass gewebespezifische Promotoren erforderlich sind, wobei der einzigartige embryonale Entwicklungszeitrahmen verwendet wird, in dem das Vorhandensein von leerem Linsenlumen eine In-situ-RCAS(A)-Mikroinjektion in die eingeschränkte Stelle für die Expression exogener Proteine in proliferativen Linsenfaserzellen ermöglicht5, 6,7,8.

Das hier ausführlich beschriebene Verfahren der Mikroinjektion von Kükenembryonen basiert ursprünglich teilweise auf den Arbeiten von Fekete et. al.6 und weiterentwickelt von Jiang et. al.8 und wurde als Mittel verwendet, um sowohl virale als auch nichtvirale Plasmide in die Linse embryonaler Küken einzuführen 1,9,10,11,12,13. Insgesamt zeigt die bisherige Arbeit das Potenzial der Verwendung dieser Methodik zur Untersuchung der Linsenentwicklung, -differenzierung, zellulären Kommunikation und des Fortschreitens von Krankheiten sowie zur Entdeckung und Erprobung therapeutischer Ziele für Linsenerkrankungen wie Katarakte.

Protocol

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz und der Durchführungsverordnung zum Tierschutz nach den Grundsätzen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Alle Tierbehandlungen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Health Science Center der University of Texas in San Antonio genehmigt. Eine Übersicht über das Protokoll finden Sie in Abbildung 1. Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die…

Representative Results

Nach der Bestimmung eines oder mehrerer spezifischer Zielproteine und der Identifizierung der zugehörigen Gensequenz(en) umfasst der experimentelle Gesamtansatz die Klonierung der Gensequenz(en) in einen retroviralen RCAS(A)-Vektor durch die anfängliche Klonierung in einen Adaptervektor, gefolgt von einem viralen Vektor. Zweitens werden hochtitrige Viruspartikel mit Hilfe von Verpackungszellen hergestellt, um die Virionen zu ernten und zu konzentrieren. Diese ersten beiden Hauptschritte wurden an anderer Stelle ausfüh…

Discussion

Dieses experimentelle Modell bietet die Möglichkeit, das/die interessierende(n) Protein(e) in der intakten Linse zu exprimieren, was zur Untersuchung der funktionellen Relevanz dieser Proteine für die Struktur und Funktion der Linse führt. Das Modell der Mikroinjektion von embryonalen Küken basiert teilweise auf den Arbeiten von Fekete et. al.6 und wurde von Jiang et. al.8 und wurde als Mittel zum Einfügen von viralen Plasmiden und Wirkstoffen wie Agonisten, kleiner in…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (an J.X.J) und F32DK134051 (an F.M.A.) und die Welch Foundation Grants: AQ-1507 (an J.X.J.) unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Die Figuren wurden teilweise mit Biorender.com erstellt.

Materials

0.22 µm Filter Corning 431118 For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish FisherScientific 50-202-030 For using during microinjection
Centrifuge Fisherbrand 13-100-676 Spinning down solution
Constructs GENEWIZ For generation of constructs
Dissecting microscope AmScope SM-4TZ-144A Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers Integrated DNA Technologies Generation of primers:

Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively

Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-204 Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-50WY Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen For cell culture
Egg Holder Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator GQF Manufacturing Company Inc. 1502 For incubation of fertilized eggs
Fast Green Fisher scientific F99-10 For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs Texas A&M University N/A Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone Laboratories For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-095-003 For anti-FLAG  1:500
Forceps FisherScientific 22-327379 For moving things around and isolation
Glass capillaries Sutter Instruments B100-75-10 Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine Invitrogen L3000001 For transfection
Manual vertical micropipette puller Sutter Instruments P-30 To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes FisherScientific 02-682-004 Dissolving solution
Microscope Keyence BZ-X710 For imaging staining
Parafilm FisherScientific 03-448-254 Placing solution
Penicillin/Streptomycin Invitrogen For cell culture
Pico-Injector Harvard Apparatus PLI-100 For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0 Self generated Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody Rockland Immunichemicals 600-401-383 For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch 111-295-003 For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad Sutter Instruments BX10 For storage of glass micropipette

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Acosta, F. M., Ma, B., Gu, S., Jiang, J. X. Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens. J. Vis. Exp. (199), e65727, doi:10.3791/65727 (2023).

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