Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als Tiermodell der Multiplen Sklerose. Dieser Artikel beschreibt einen Ansatz zur Bewertung von Rückenmarksentzündungen, Demyelinisierung und axonalen Verletzungen bei EAE. Darüber hinaus wird eine Methode zur Quantifizierung des löslichen Neurofilament-Lichtspiegels im Mäuseserum vorgestellt, die die Beurteilung der axonalen Schädigung in lebenden Mäusen erleichtert.
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein gängiges immunbasiertes Modell der Multiplen Sklerose (MS). Diese Erkrankung kann bei Nagetieren durch aktive Immunisierung mit Proteinkomponenten der Myelinscheide und Complete Freund’s Adjuvans (CFA) oder durch den Transfer von myelinspezifischen T-Effektorzellen von Nagetieren, die mit Myelinprotein/CFA präpariert wurden, in naive Nagetiere induziert werden. Der Schweregrad der EAE wird in der Regel auf einer klinischen 5-Punkte-Skala bewertet, die den Grad der aufsteigenden Lähmung misst, aber diese Skala ist nicht optimal, um das Ausmaß der Genesung von EAE zu beurteilen. Zum Beispiel bleiben die klinischen Werte in einigen EAE-Modellen (z. B. Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-[MOG]-Peptid-induziertes EAE-Modell) trotz des Abklingens der Entzündung hoch. Daher ist es wichtig, das klinische Scoring durch das histologische Scoring der EAE zu ergänzen, das auch die Möglichkeit bietet, die zugrunde liegenden Mechanismen der Zellschädigung im Zentralnervensystem (ZNS) zu untersuchen.
Hier wird ein einfaches Protokoll vorgestellt, um Rückenmark- und Gehirnschnitte von Mäusen vorzubereiten und zu färben und Entzündungen, Demyelinisierung und axonale Verletzungen im Rückenmark zu bewerten. Die Methode zur Bewertung der Leukozyteninfiltration im Rückenmark kann auch zur Bewertung von Hirnentzündungen bei EAE angewendet werden. Ein Protokoll zur Messung von löslichem Neurofilamentlicht (sNF-L) im Serum von Mäusen mit einem Small Molecule Assay (SIMOA) Assay wird ebenfalls beschrieben, das Rückmeldung über das Ausmaß der Gesamtschädigung des ZNS bei lebenden Mäusen gibt.
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist das häufigste Mausmodell für die humane demyelinisierende Erkrankung Multiple Sklerose (MS)1. Die klassische MS-Entzündungspathologie, einschließlich der Infiltration von IFN-γ (gamma) und IL-17-produzierenden T-Helferzellen2, der Infiltration von entzündlichen Monozyten3, der Bildung perivaskulärer und submeningealer entzündlicher demyelinisierender Läsionen4 und des Auftretens einer Axonverletzung4 im Zentralnervensystem (ZNS), wird auch bei EAEbeobachtet 5,6,7,8,9 . Die Ähnlichkeit der Immunmechanismen zwischen EAE und MS hat die EAE zu einem geeigneten präklinischen Modell gemacht, um die Wirksamkeit und die Wirkmechanismen einer Reihe zugelassener immunbasierter Therapien für MS zu testen, darunter Natalizumab, Fingolimod, Dimethylfumarat und Glatirameracetat (siehe 1,5). Bestimmte EAE-Therapien modellieren andere Aspekte der progressiven MS-Pathologie, die über die axonale Verletzung hinausgehen, einschließlich der Entwicklung einer submeningealen Entzündung im Gehirn, chronischer Demyelinisierung, Rückenmarksatrophie, Synapse und Neuronenverlust 6,10,11,12. Daher ist EAE nützlich, um die Wirksamkeit neuroprotektiver Therapien für MS zu überprüfen.
EAE wird bei Nagetieren auf verschiedene Weise induziert. Die aktive Immunisierung ist die gebräuchlichste Induktionsmethode und beinhaltet die Immunisierung von Nagetieren mit Myelin-Antigenen (entweder ganze Proteine oder Peptide), die in CFA emulgiert sind, ergänzt mit hitzeabgetötetem Mycobacterium tuberculosis13. Je nach Mausstamm wird auch Pertussistoxin (PTX) an Tag 0 und Tag 2 der Immunisierung verabreicht, um die Penetranz der Erkrankung zu erhöhen13. EAE kann auch durch adoptive Übertragung von myelinspezifischen T-Zellen, die aus Myelin/CFA-geprimten Mäusen gewonnen wurden, in gesunde Mäuse induziert werden14 oder kann sich spontan in Mäusen entwickeln, die T-Zell-Rezeptoren überexprimieren, die für die wichtigsten Myelinantigenespezifisch sind 5.
Der Schweregrad und das Fortschreiten der EAE-Erkrankung werden in der Regel anhand einer diskreten 5-Punkte-Skala bewertet: 1 – Schwanzschlaffheit, 2 – Hinter- oder Fußschwäche, 3 – vollständige Lähmung einer oder beider Hintergliedmaßen, 4 – Schwäche der Vordergliedmaßen, 5 – todgeweiht oder tot13. Dieses klinische Scoring-System dokumentiert das Fortschreiten der aufsteigenden Lähmung, die zu Beginn der Krankheit auftritt, ist jedoch weniger empfindlich bei der Erfassung des Ausmaßes der Genesung von ZNS-Entzündungsattacken. Zum Beispiel werden sowohl Mäusen, die Schwierigkeiten beim Gehen haben, als auch Mäusen, die leicht gehen können, aber eine Schwäche beim Fassen der Füße aufweisen, eine Punktzahl von 2 auf der EAE-Skala zugewiesen. Die Werte können in der postakuten Phase der EAE aufgrund des Vorhandenseins einer dauerhaften Axonverletzung oder eines dauerhaften Axonverlusts hoch bleiben, selbst trotz des Abklingens der Entzündungsreaktion9. Es gab eine Vielzahl von Versuchen, verfeinerte Bewertungssysteme, Verhaltenstests, Messungen der Hintergliedmaßen- und Griffkraft sowie Infrarot-Überwachungssysteme zu entwickeln, um Unterschiede in den klinischen Defiziten bei EAE 9,16,17,18 besser zu erfassen; Diese komplizierteren Scoring-Messungen unterscheiden jedoch nicht zwischen dem Beitrag von Entzündungen und Gewebeverletzungen zu den zugrunde liegenden neurologischen Defiziten. Daher besteht der Goldstandardansatz zur Bewertung des Schweregrads der EAE darin, sowohl ein klinisches als auch ein histologisches Scoring durchzuführen.
Hier wird ein Protokoll beschrieben, wie Rückenmarks- und Gehirnproben von Mäusen in Paraffin so präpariert und eingebettet werden können, dass der stochastische Prozess der Läsionsbildung, der bei EAE auftritt, erfasst wird. Es wird auch ein Protokoll vorgestellt, wie Schnitte mit Luxol Fast Blue (LFB) gefärbt werden können, das ursprünglich von Kluver und Barrera19 entwickelt wurde und Myelin im ZNS nachweist. Die Schnitte werden entweder mit LFB allein gefärbt (für die Demyelinisierungsanalyse) oder mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gegengefärbt, um entzündliche Läsionen sichtbar zu machen und zu bewerten. Es werden auch Protokolle zur Quantifizierung des Vorhandenseins von Gesamtleukozyten (CD45), des Verlusts von Myelin und der Anzahl verletzter Axone (SMI-32) im Rückenmark unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper, immunhistochemischer (IHC) Techniken und öffentlich zugänglicher Software bereitgestellt. Das Protokoll zur Quantifizierung von Leukozyten im Rückenmark kann auch auf die Quantifizierung von Leukozyten im Gehirn angewendet werden.
Die histologische Beurteilung von axonalen Verlusten und Verletzungen im Gehirn ist vergleichsweise schwieriger als im Rückenmark, da die Bahnen der weißen Substanz im Gehirn nicht parallel zueinander verlaufen. Die Messung des Serum-Neurofilament-Lichts (sNF-L) hat sich als vielversprechender Biomarker für neuronale Verletzungen bei MSherausgestellt 20,21. Jüngste Studien haben diese Technologie auf EAE 22,23,24 ausgeweitet. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Messung des Serum-Neurofilament-Lichts (sNF-L) in lebenden Mäusen mit einem Small Molecule Assay (SIMOA) Assay vorgestellt. Diese Methode erfordert nur eine kleine Menge Serum und kann an lebenden Mäusen in nur einem halben Tag durchgeführt werden, was eine schnelle Rückmeldung darüber liefert, wie sich eine getestete Therapie auf die Gesamtschädigung des ZNS auswirkt. Alle hier beschriebenen Methoden können auf Mäuse jeden Geschlechts und Stammes angewendet werden.
Die histologische Färbung des Rückenmarks ist ein wichtiges Instrument zur Beurteilung des Schweregrads der EAE-Erkrankung, insbesondere in Fällen, in denen es Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen im Ausmaß der Genesung der Erkrankung in der postakuten Phase der Erkrankung gibt. Die Färbung auf Immunzellinfiltration (CD45), Myelin (LFB) und axonale Schädigung (SMI-32) hilft dabei, die zugrunde liegende Ursache für die veränderten klinischen Werte bei Mäusen zu charakterisieren. Das hier beschriebene histologische Färbeprotokoll gibt einen Überblick über die Entzündung sowie das Ausmaß der Myelin- und axonalen Verletzung. Darüber hinaus validieren die gezeigten Ergebnisse die sNF-L-Messung als Methode zur Beurteilung des Ausmaßes der neuronalen Gesamtschädigung bei EAE.
Die kritischen Parameter für diese Analyse bestehen darin, sicherzustellen, dass die Forscher für die Identität der Abschnitte blind sind und dass es auf jeder Ebene des Rückenmarks gleichwertige Proben für die verschiedenen Mäuse gibt. Dies liegt daran, dass die Schwere der Entzündung auf niedrigeren Ebenen der Nabelschnur größer sein kann. Ein weiterer kritischer Parameter ist die Größe der Versuchsgruppen. Rückenmark und Gehirn werden in der Regel von 6-8 Mäusen pro Gruppe am Endpunkt entnommen, um signifikante Unterschiede zwischen Gruppen mit Behandlungen oder Genotypen mit bescheidenen Effektstärken zu sehen. Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass ausgewählte Mäuse im Durchschnitt repräsentative Mittelwerte der gesamten Gruppe aufweisen. In Bezug auf die Fehlerbehebung ist ein häufiges Problem, auf das diejenigen, die mit dem Protokoll unerfahren sind, stoßen, dass das Rückenmark nicht ausreichend lange fixiert ist und nicht leicht aus der Wirbelsäule herausgepresst werden kann. Ist dies der Fall, kann das Rückenmark manuell von der Säule abgetrennt werden, indem man mit einer feinen Schere entlang der Dornfortsätze schneidet und die Säule öffnet, um das Rückenmark freizulegen. Alternativ kann das Gewebe für einige zusätzliche Tage fixiert werden, ohne den Erfolg der Antikörperfärbung zu beeinträchtigen. Die hier beschriebenen Antikörperklone wirken in Gewebe, das bis zu 2 Wochen in Formalin fixiert ist.
Das Einbetten der Rückenmarksstücke erfordert Geschick und Übung. Es wird empfohlen, Augenlupen zu tragen und eine Lampe über die Einbettstation zu richten, um besser erkennen zu können, ob die Abschnitte im Querschnitt oder im Längsschnitt fallen. Wenn Sie die Längen der Rückenmarksstücke während der Grobung auf weniger als 2 mm halten, können sie im Querschnitt fallen. Ein weiteres häufiges Problem, das bei weniger erfahrenen Anwendern auftritt, ist, dass der LFB während der nächtlichen Inkubation verdunstet, so dass die Hälfte des Objektträgers gefärbt und die andere Hälfte ungefärbt bleibt. Um Verdunstung zu vermeiden, sollte die Glasfärbeschale mit thermoplastischer Folie und anschließend mit Plastikfolie verschlossen werden. Wenn es zu Verdunstung kommt und Abschnitte ungleichmäßig gefärbt sind, empfiehlt es sich, die Objektträger mit Lithiumcarbonat vollständig zu entblauen, und über Nacht erneut in LFB zu färben. Ein weiteres häufiges Problem ist, dass Benutzer die graue Substanz nach LFB nicht vollständig entblauen. Es ist wichtig, einzelne Abschnitte unter dem Mikroskop zu untersuchen, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Menge an Entbrühung erreicht wurde, bevor mit anderen Schritten im Protokoll fortgefahren wird. Obwohl die CD45- und SMI-32-IHC-Färbungen robust funktionieren, ist es dennoch wichtig, die Antikörperkonzentrationen in Vorexperimenten für jede neu erhaltene Antikörpercharge zu beheben. Dies kann erfolgen, indem eine Vielzahl von Konzentrationen des Antikörpers an einem positiven Kontrollabschnitt (EAE-Rückenmark) getestet wird. Die erstmalige Färbung sollte auch eine Negativkontrolle umfassen, die nur aus einem Sekundärantikörper ohne Zusatz von Primärantikörpern besteht. Schließlich ist es bei der Bildanalyse wichtig, einzelne Bilder zu begrenzen, da die Verfärbung über Objektträger oder Abschnitte hinweg ungleichmäßig sein kann.
Dieses Protokoll verwendet frei verfügbare Software. Wenn man keinen Zugang zu einem Prozessor, einem Embedder oder Mikrotom hat, können diese Schritte an einen krankenhausbasierten Pathologiekern übergeben werden, der diese Dienste anbietet. Wenn man keinen Zugang zu einem Objektträgerscanner hat, kann man auch ein Lichtmikroskop verwenden, das mit einer Videokamera ausgestattet ist, um TIFF-Bilder des Rückenmarks oder der Gehirnregionen zu speichern. Für einen mikroskopbasierten Arbeitsablauf erfassen Sie LFB- oder LFB/H&E-Schnitte bei geringer Leistung (40-fache Vergrößerung) und für CD45- und SMI-32-Färbungen mindestens vier Fenster, die in den ventralen, dorsalen und lateralen Teilen des Rückenmarks zentriert sind (200-fache Vergrößerung für CD45 und 400-fache Vergrößerung für SMI-32). An diesen Bildern kann eine Bildanalyse durchgeführt werden, um die Färbung auf ähnliche Weise wie beschrieben zu quantifizieren.
Die Entscheidung, welcher histologische Ansatz zur Bewertung der EAE gewählt werden soll, hängt davon ab, wie stark sich die klinischen Werte zwischen den Gruppen unterscheiden. Wenn es beispielsweise drastische Unterschiede im klinischen EAE-Score gibt (eine Gruppe erhielt EAE und eine Gruppe nicht), hängt dies in der Regel mit Unterschieden in der peripher vermittelten Entzündung zusammen. In diesem Fall ist ein Scoring für das Vorhandensein von demyelinisierenden Läsionen auf LFB/H&E-gefärbten Schnitten ausreichend und zeigt Unterschiede zwischen den Gruppen auf. Wenn sich die Gruppen zu Beginn des klinischen Scores ähnlicher sind und es stattdessen Unterschiede im Ausmaß der klinischen Genesung gibt (z. B. Experiment in Abbildung 5A), ist es am besten, den hier beschriebenen vollständigen histologischen Arbeitsablauf anzuwenden, einschließlich der Bewertung der Hirnentzündung im Hirnstamm und im Kleinhirn, um zu unterscheiden, ob die Unterschiede in der Krankheitschronizität mit Unterschieden in der Entzündung oder der Gewebeschädigung zusammenhängen. Wenn Unterschiede in der Entzündung festgestellt werden, die durch CD45-Zählung beurteilt werden, können weitere IHC-Studien durchgeführt werden, um T-Zellen (Anti-CD3), infiltrierende Monozyten/Makrophagen (Mac3) und Mikroglia (Iba-1/TMEM119) zu färben (empfohlene Antikörperklone sind in der Zusatztabelle 3 aufgeführt). Die Aktivierung der Mikroglia spiegelt sich in einer Erhöhung der Intensität der Iba-1-Färbung auf doppelt markierten Iba-1+TMEM-19+ -Mikroglia und einer erhöhten Retraktion der Mikrogliaprozesse wider, die durch die Sholl-Analyse in Sektionen32 beurteilt werden können. Darüber hinaus können Techniken wie Durchflusszytometrie oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung angewendet werden, um eine tiefere Charakterisierung der Häufigkeit und des Phänotyps von Immunpopulationen im Gehirn und Rückenmark durchzuführen.
Die Zählung von SMI-32+ Axonen ist eine empfindliche Methode zum Nachweis von Axonverletzungen in EAE32,33 und in MS34. SMI-32, das die nicht-phosphorylierte Form von Neurofilamenten erkennt, die schwer oder mittel sind, reichern sich in den Endbulben der durchtrennten Neuronen an. Eine Alternative zum Nachweis verletzter Axone ist die Färbung mit Amyloid-Vorläuferprotein (APP), das sich infolge eines gestörten Axontransports in Axonen anreichern kann33. Das Färbemuster für SMI-32 und APP überlappt sich in der Regel nicht, obwohl beide eine Axonverletzung widerspiegeln, was darauf hindeutet, dass sie unterschiedliche Pathologien erkennen33. Man kann die histologischen Messungen der Axonverletzung auch durch die Messung von sNF-L ergänzen, die ein schnelles und sensitives Maß für eine laufende axonale Verletzung sowohl im Rückenmark als auch im Gehirn ist. Es bietet den Vorteil, dass es in einem halben Tag bei lebenden Mäusen durchgeführt werden kann. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass die Kits teuer sind und die Maschine hochspezialisiert ist. Das Unternehmen, das das sNF-L-Kit verkauft, bietet eine Servicegebühr für diejenigen an, die keinen Zugang zu einer SIMOA-Maschine haben. Eine Alternative zur Beurteilung der Axonverletzung besteht darin, den Axonverlust zu bewerten, indem entweder Axone in toluidinblau gefärbten Abschnitten des Rückenmarks12 gezählt werden oder Neurofilamentbündel gezählt werden, die von SMI-31 in Bereichen der weißen Substanz des Rückenmarks nachgewiesen werden32. Beides sind aufwändigere Ansätze als die SMI-32- oder sNF-L-Messung.
Wenn sich die klinischen EAE-Scores zwischen den Gruppen unterscheiden, aber das Scoring für Entzündung, Demyelinisierung und axonale Schädigung keine Unterschiede zwischen den Gruppen zeigt, kann es sinnvoll sein, die Astrozytenaktivierung mit GFAP zu färben (siehe Ergänzende Tabelle 3 für den empfohlenen Antikörperklon). Die Aktivierung von Astrozyten ist mit einer Zunahme der GFAP-Färbung verbunden, und es wurde gezeigt, dass dies mit der EAE-Progression in einigen EAE-Modellen korreliert, einschließlich chronischer EAE bei der DA-Ratte35.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll Methoden und bietet einen Analyse-Workflow zur Durchführung eines histologischen Scorings von EAE.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Raymond Sobel (Stanford University) für seine Methode, Gehirn- und Rückenmarksschnitte zu groben und zu fixieren. Wir danken Kyle Roberton und Milan Ganguly vom Toronto Centre for Phenogenomics für das Erlernen der Einbettungsmethode und dafür, dass sie so viele unserer Gehirn- und Rückenmarksabschnitte durchtrennt haben. Wir danken Dr. Matthew Cussick und Dr. Robert Fujinami (University of Utah) für die Bereitstellung ihrer Protokolle zur Bewertung submeningealer und perivaskulärer Entzündungen im Rückenmark. Wir danken Shalina Ousman für die Bereitstellung des Klons des CD45-Antikörpers. Wir danken Xiofang Lu für die Schulung am Gewebeprozessor und an der Gewebeeinbettungsstation sowie für die Wartung dieser Geräte im Keenan Research Centre of Biomedical Research am St. Michael’s Hospital. Diese Arbeit wurde durch ein biomedizinisches Stipendium von MS Canada (an SED) unterstützt. Carmen Ucciferri wird durch ein Stipendium der kanadischen Regierung unterstützt. Nuria Alvarez-Sanchez wird durch ein Keenan-Postdoktorandenstipendium unterstützt.
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
Biosafety Cabinet | Any | ||
Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
ddH2O | – | – | |
Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
Fumehood | Any | ||
Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
Light microscope | Any | ||
Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
p1000 Pipette and Tips | various | ||
p200 Pipette and Tips | various | ||
Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408–129 | Used to store mouse serum samples |
Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |