Hepatozyten, die aus pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, können durch Zellsortierung aufgereinigt werden, wobei eine Kombination aus mitochondrialer und aktivierter Leukozytenzelladhäsionsmolekülfärbung (ALCAM, auch bekannt als CD166) verwendet wird.
Humane embryonale Stammzellen (ES) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) haben aufgrund ihrer unbegrenzten Proliferation und pluripotenten Eigenschaften potenzielle Anwendungen in der zellbasierten regenerativen Medizin zur Behandlung schwer erkrankter Organe. Die Differenzierung von humanen ES/iPS-Zellen in 100 % reine Zielzelltypen ist jedoch aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber der Umwelt eine Herausforderung. Die Tumorgenese nach einer Transplantation wird durch kontaminierte, proliferierende und undifferenzierte Zellen verursacht, so dass die Hochreinigungstechnologie für die sichere Realisierung der regenerativen Medizin unerlässlich ist. Um das Risiko der Tumorentstehung zu verringern, wurde eine Hochreinigungstechnologie für aus humanen iPS-Zellen gewonnene Hepatozyten entwickelt. Das Verfahren verwendet FACS (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung) unter Verwendung einer Kombination aus hohem mitochondrialem Gehalt und dem Zelloberflächenmarker ALCAM (aktiviertes Leukozytenzelladhäsionsmolekül) ohne genetische Veränderung. 97% ± 0,38% (n = 5) der gereinigten Hepatozyten mit dieser Methode zeigten eine Albuminproteinexpression. In diesem Artikel sollen detaillierte Verfahren für diese Methode vorgestellt werden, wie sie auf die aktuellste zweidimensionale Differenzierungsmethode für humane iPS-Zellen in Hepatozyten angewendet wird.
Embryonale und induzierte pluripotente Stammzellen (ES bzw. iPS) gelten als vielversprechende Zellquellen für regenerative Therapien. Die Effizienz der Differenzierung dieser Zellen in spezifische Zielzelltypen kann jedoch variieren, selbst wenn die gleiche Zelllinie, das gleiche Protokoll und der gleiche Experimentator verwendetwerden 1,2,3,4. Diese Variabilität kann auf die hohe Empfindlichkeit menschlicher ES/iPS-Zellen gegenüber ihrer Umgebung zurückgeführt werden. Daher ist es derzeit schwierig, konsistent reine Zielzellen zu gewinnen. Um eine hochsichere regenerative Medizin zu erreichen, ist es von entscheidender Bedeutung, proliferative Zellen und undifferenzierte Stammzellen in therapeutischen Zellen zu eliminieren, und eine fortschrittliche Reinigungstechnologie für Zielzellen ist unerlässlich 5,6,7.
Ein Zellsortierer ist ein Gerät, das einzelne Zellen sofort analysiert und lebende Zellen von Interesse basierend auf den Fluoreszenzsignalstärken sortiert und damit eine vielversprechende Lösung bietet. Dies kann durch die Antikörperfärbung von zelltypspezifischen Oberflächenmarkern oder durch die Verwendung zelltypspezifischer Reportergenexpressionen erreicht werden. Unter Verwendung dieser Technik gibt es mehrere Berichte über Methoden zur Reinigung von aus pluripotenten Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten 8,9,10 und Hepatozyten11,12. Hattori et al. entwickelten ein innovatives mitochondriales Aufreinigungsverfahren unter Verwendung eines Zellsortierers13. Unter Ausnutzung der Tatsache, dass Kardiomyozyten durch mitochondriale Aktivität einen hohen Energiebedarf haben, kann die Färbung der Zellen mit dem lebenden Mitochondrien-indikativen Farbstoff TMRM (Tetramethylrhodaminmethylester) zur Markierung und hochreinen Kardiomyozyten mittels FACS aus humanen ES-Zell-abgeleiteten Embryoidkörpern mit verschiedenen Zelltypen verwendet werden. Das Fehlen von Tumorigenität wurde durch Teratombildungsassays mit den gereinigten Kardiomyozyten bestätigt. Darüber hinaus entdeckten Yamashita et al. unerwartet eine Methode zur Reinigung von Hepatozyten aus humanen ES-Zell-abgeleiteten Embryoidkörpern durch Isolierung von Fraktionen mit hoher mitochondrialer Aktivität und ALCAM-positiver Expression14. Die Begründung für diese Methode ist, dass Hepatozyten aufgrund ihres hohen Verbrauchs an ATP für den Nährstoffstoffwechsel und die Entgiftung auch eine relativ hohe Anzahl von Mitochondrien aufweisen15, und Hepatozyten exprimieren ALCAM, ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, das eine Rolle bei der Zelladhäsion und -migration spielt16.
Frühere hochaufreinigende Methoden für aus pluripotenten Stammzellen gewonnene Hepatozyten erforderten genetische Modifikationen, und nicht-genetische Aufreinigungsmethoden wiesen eine geringe Effizienz auf17. Die mitochondriale nicht-genetische Methode zeichnet sich dadurch aus, dass sie eine hohe Reinheit erreicht. Wenn hepatische Vorläuferzellen benötigt werden, können CD133- und CD13- oder Dlk1-basierte Methoden18,19 gewählt werden. Obwohl die Genauigkeit der Genom-Editing-Technologie fortgeschritten ist, kann das potenzielle Risiko unvorhergesehener genomischer Veränderungen (z. B. Karzinogenese) nicht vollständig ausgeschlossen werden. Methoden, die auf mitochondrialer Aktivität basieren, ohne genetische Veränderungen zu beinhalten, können frei von solchen Risiken sein.
Als Ergebnis der Untersuchung verschiedener mitochondrialer Indikatoren in neonatalen Kardiomyozyten von Ratten wurde beobachtet, dass TMRM innerhalb von 24 Stunden vollständig verschwand, während andere Farbstoffe mindestens 5 Tage lang blieben13. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass TMRM und JC-1 die Zellviabilität nicht beeinflussten, wenn sie mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay bewertet wurden, während andere Farbstoffe unterschiedliche Auswirkungen auf die Zellviabilität zeigten13. TMRM weist eine höhere Sicherheit auf.
Bisher wurden mehrere zweidimensionale (2D) Differenzierungsmethoden entwickelt, die im Vergleich zur dreidimensionalen (3D) Embryoidkörperbildung effizientere Ansätze zur Induktion der Differenzierung darstellen. Dies liegt daran, dass differenzierungsinduzierende Verbindungen oder Zytokine den Zellen einheitlich auf einer 2D-Ebene und nicht in einem 3D-Raum verabreicht werden können. In dieser Studie wurde die zuvor beschriebene Methode20 modifiziert, um die Differenzierung in humane iPS-Zell-abgeleitete Hepatozyten zu induzieren. Im Folgenden werden die Verfahren zur zeitgemäßen 2D-Differenzierung und -Reinigung von Hepatozyten, die aus humanen iPS-Zellen gewonnen werden, detailliert beschrieben.
Aufgrund ihrer Funktionen im Nährstoffstoffwechsel und in der Entgiftung besitzen Hepatozyten im Vergleich zu anderen Zelltypen eine relativ große Anzahl an Mitochondrien15. ALCAM ist ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie und spielt eine Rolle bei der Zelladhäsion und -migration. Es wird in verschiedenen Zelltypen exprimiert, darunter hepatische, epitheliale, lymphozytäre, myeloische, Fibroblasten- und neuronale Zellen16. Durch die Verwendung einer Kombination aus…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie mit der Fördernummer [23390072] unterstützt.
253G1 human iPS cell line | RIKEN BioResource Research Center | HPS0002 | |
4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-20145 | |
Activin A Solution, Human, Recombinant | NACALAI TESQUE, INC. | 18585 | |
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Chemicon | MAB1281 | Antibody against human nuclear antigen |
B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BD FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182 | |
Ciclosporin A | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 035-18961 | |
Collagenase | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 034-22363 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Gel-like basement membrane matrix |
CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-24023 | ROCK inhibitor |
Dexamethasone | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-18863 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-29353 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
Fetal Bovine Serum | Biowest | 51820-500 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine |
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody | R&D Systems | AF1172 | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H2270 | |
iMatrix-511 silk | Nippi | 892021 | |
ImmunoBlock | KAC | CTKN001 | Blocking solution |
ITS-G Supplement(×100) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 090-06741 | |
Leibovitz's L-15 Medium | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 128-06075 | |
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa) | Toronto Research Chemicals | H293745 | |
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin | Dako | A0001 | |
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20) | NACALAI TESQUE, INC. | 28353-85 | |
RPMI-1640 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 189-02025 | |
Sodium L-Ascorbate | NACALAI TESQUE, INC. | 03422-32 | |
StemFit AK02N | REPROCELL | RCAK02N | |
TBS (10x) | NACALAI TESQUE, INC. | 12748-31 | |
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Thermo Fisher Scientific | T668 | |
Triton X-100 | NACALAI TESQUE, INC. | 28229-25 | |
Trypan Blue Solution | NACALAI TESQUE, INC. | 20577-34 | |
TRYPSIN 250 | Difco | 215240 | |
Tryptose phosphate broth solution | Sigma-Aldrich | T8159 |