Summary

Anwendung der Färbung lebender Mitochondrien bei der Zellsortierung zur Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden

Published: December 01, 2023
doi:

Summary

Hepatozyten, die aus pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, können durch Zellsortierung aufgereinigt werden, wobei eine Kombination aus mitochondrialer und aktivierter Leukozytenzelladhäsionsmolekülfärbung (ALCAM, auch bekannt als CD166) verwendet wird.

Abstract

Humane embryonale Stammzellen (ES) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) haben aufgrund ihrer unbegrenzten Proliferation und pluripotenten Eigenschaften potenzielle Anwendungen in der zellbasierten regenerativen Medizin zur Behandlung schwer erkrankter Organe. Die Differenzierung von humanen ES/iPS-Zellen in 100 % reine Zielzelltypen ist jedoch aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber der Umwelt eine Herausforderung. Die Tumorgenese nach einer Transplantation wird durch kontaminierte, proliferierende und undifferenzierte Zellen verursacht, so dass die Hochreinigungstechnologie für die sichere Realisierung der regenerativen Medizin unerlässlich ist. Um das Risiko der Tumorentstehung zu verringern, wurde eine Hochreinigungstechnologie für aus humanen iPS-Zellen gewonnene Hepatozyten entwickelt. Das Verfahren verwendet FACS (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung) unter Verwendung einer Kombination aus hohem mitochondrialem Gehalt und dem Zelloberflächenmarker ALCAM (aktiviertes Leukozytenzelladhäsionsmolekül) ohne genetische Veränderung. 97% ± 0,38% (n = 5) der gereinigten Hepatozyten mit dieser Methode zeigten eine Albuminproteinexpression. In diesem Artikel sollen detaillierte Verfahren für diese Methode vorgestellt werden, wie sie auf die aktuellste zweidimensionale Differenzierungsmethode für humane iPS-Zellen in Hepatozyten angewendet wird.

Introduction

Embryonale und induzierte pluripotente Stammzellen (ES bzw. iPS) gelten als vielversprechende Zellquellen für regenerative Therapien. Die Effizienz der Differenzierung dieser Zellen in spezifische Zielzelltypen kann jedoch variieren, selbst wenn die gleiche Zelllinie, das gleiche Protokoll und der gleiche Experimentator verwendetwerden 1,2,3,4. Diese Variabilität kann auf die hohe Empfindlichkeit menschlicher ES/iPS-Zellen gegenüber ihrer Umgebung zurückgeführt werden. Daher ist es derzeit schwierig, konsistent reine Zielzellen zu gewinnen. Um eine hochsichere regenerative Medizin zu erreichen, ist es von entscheidender Bedeutung, proliferative Zellen und undifferenzierte Stammzellen in therapeutischen Zellen zu eliminieren, und eine fortschrittliche Reinigungstechnologie für Zielzellen ist unerlässlich 5,6,7.

Ein Zellsortierer ist ein Gerät, das einzelne Zellen sofort analysiert und lebende Zellen von Interesse basierend auf den Fluoreszenzsignalstärken sortiert und damit eine vielversprechende Lösung bietet. Dies kann durch die Antikörperfärbung von zelltypspezifischen Oberflächenmarkern oder durch die Verwendung zelltypspezifischer Reportergenexpressionen erreicht werden. Unter Verwendung dieser Technik gibt es mehrere Berichte über Methoden zur Reinigung von aus pluripotenten Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten 8,9,10 und Hepatozyten11,12. Hattori et al. entwickelten ein innovatives mitochondriales Aufreinigungsverfahren unter Verwendung eines Zellsortierers13. Unter Ausnutzung der Tatsache, dass Kardiomyozyten durch mitochondriale Aktivität einen hohen Energiebedarf haben, kann die Färbung der Zellen mit dem lebenden Mitochondrien-indikativen Farbstoff TMRM (Tetramethylrhodaminmethylester) zur Markierung und hochreinen Kardiomyozyten mittels FACS aus humanen ES-Zell-abgeleiteten Embryoidkörpern mit verschiedenen Zelltypen verwendet werden. Das Fehlen von Tumorigenität wurde durch Teratombildungsassays mit den gereinigten Kardiomyozyten bestätigt. Darüber hinaus entdeckten Yamashita et al. unerwartet eine Methode zur Reinigung von Hepatozyten aus humanen ES-Zell-abgeleiteten Embryoidkörpern durch Isolierung von Fraktionen mit hoher mitochondrialer Aktivität und ALCAM-positiver Expression14. Die Begründung für diese Methode ist, dass Hepatozyten aufgrund ihres hohen Verbrauchs an ATP für den Nährstoffstoffwechsel und die Entgiftung auch eine relativ hohe Anzahl von Mitochondrien aufweisen15, und Hepatozyten exprimieren ALCAM, ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, das eine Rolle bei der Zelladhäsion und -migration spielt16.

Frühere hochaufreinigende Methoden für aus pluripotenten Stammzellen gewonnene Hepatozyten erforderten genetische Modifikationen, und nicht-genetische Aufreinigungsmethoden wiesen eine geringe Effizienz auf17. Die mitochondriale nicht-genetische Methode zeichnet sich dadurch aus, dass sie eine hohe Reinheit erreicht. Wenn hepatische Vorläuferzellen benötigt werden, können CD133- und CD13- oder Dlk1-basierte Methoden18,19 gewählt werden. Obwohl die Genauigkeit der Genom-Editing-Technologie fortgeschritten ist, kann das potenzielle Risiko unvorhergesehener genomischer Veränderungen (z. B. Karzinogenese) nicht vollständig ausgeschlossen werden. Methoden, die auf mitochondrialer Aktivität basieren, ohne genetische Veränderungen zu beinhalten, können frei von solchen Risiken sein.

Als Ergebnis der Untersuchung verschiedener mitochondrialer Indikatoren in neonatalen Kardiomyozyten von Ratten wurde beobachtet, dass TMRM innerhalb von 24 Stunden vollständig verschwand, während andere Farbstoffe mindestens 5 Tage lang blieben13. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass TMRM und JC-1 die Zellviabilität nicht beeinflussten, wenn sie mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay bewertet wurden, während andere Farbstoffe unterschiedliche Auswirkungen auf die Zellviabilität zeigten13. TMRM weist eine höhere Sicherheit auf.

Bisher wurden mehrere zweidimensionale (2D) Differenzierungsmethoden entwickelt, die im Vergleich zur dreidimensionalen (3D) Embryoidkörperbildung effizientere Ansätze zur Induktion der Differenzierung darstellen. Dies liegt daran, dass differenzierungsinduzierende Verbindungen oder Zytokine den Zellen einheitlich auf einer 2D-Ebene und nicht in einem 3D-Raum verabreicht werden können. In dieser Studie wurde die zuvor beschriebene Methode20 modifiziert, um die Differenzierung in humane iPS-Zell-abgeleitete Hepatozyten zu induzieren. Im Folgenden werden die Verfahren zur zeitgemäßen 2D-Differenzierung und -Reinigung von Hepatozyten, die aus humanen iPS-Zellen gewonnen werden, detailliert beschrieben.

Protocol

In dieser Studie wurden kommerziell hergestellte humane iPS-Zellen (Stamm 253G1) verwendet (siehe Materialtabelle). 1. Erhaltung humaner iPS-Zellen Humane iPS-Zellen werden unter feederfreien Bedingungen im AK02-Medium auf Kulturschalen aufbewahrt, die mit 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 beschichtet sind (siehe Materialtabelle). 2. Leberdifferenzierung von humanen iPS-Zellen in 2D-Kulturen<…

Representative Results

Die Zeitleiste der Prozesse, die humane iPS-Zellen dazu veranlassen, sich durch 2D-Kultur (Abbildung 1A) und repräsentative Zellmerkmale (Abbildung 1B) in Hepatozyten zu differenzieren, wird gezeigt. Ungefähr am 12. Tag der Differenzierung begannen die Zellen polygonale Zellformen und runde Zellkerne zu zeigen, die für Hepatozyten charakteristisch sind. Einige Hepatozyten zeigten auch eine Mehrkernigkeit. Die FACS-Analyse wurde mit…

Discussion

Aufgrund ihrer Funktionen im Nährstoffstoffwechsel und in der Entgiftung besitzen Hepatozyten im Vergleich zu anderen Zelltypen eine relativ große Anzahl an Mitochondrien15. ALCAM ist ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie und spielt eine Rolle bei der Zelladhäsion und -migration. Es wird in verschiedenen Zelltypen exprimiert, darunter hepatische, epitheliale, lymphozytäre, myeloische, Fibroblasten- und neuronale Zellen16. Durch die Verwendung einer Kombination aus…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie mit der Fördernummer [23390072] unterstützt.

Materials

253G1 human iPS cell line RIKEN BioResource Research Center HPS0002
4% paraformaldehyde FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant NACALAI TESQUE, INC. 18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 Chemicon MAB1281 Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
BD FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
CHIR-99021 MedChemExpress HY-10182 
Ciclosporin A FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 035-18961
Collagenase FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 354230 Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 036-24023 ROCK inhibitor
Dexamethasone FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
Fetal Bovine Serum Biowest 51820-500
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody R&D Systems AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H2270
iMatrix-511 silk Nippi 892021
ImmunoBlock KAC CTKN001 Blocking solution
ITS-G Supplement(×100) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 090-06741
Leibovitz's L-15 Medium FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa) Toronto Research Chemicals H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin Dako A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20) NACALAI TESQUE, INC. 28353-85
RPMI-1640 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 189-02025
Sodium L-Ascorbate NACALAI TESQUE, INC. 03422-32
StemFit AK02N REPROCELL RCAK02N
TBS (10x) NACALAI TESQUE, INC. 12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) Thermo Fisher Scientific T668
Triton X-100 NACALAI TESQUE, INC. 28229-25
Trypan Blue Solution NACALAI TESQUE, INC. 20577-34
TRYPSIN 250 Difco 215240
Tryptose phosphate broth solution Sigma-Aldrich T8159

Referenzen

  1. Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241 (2018).
  2. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).
  3. Anderson, N. C., et al. Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders. Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).
  4. Chen, C. X. -. Q., et al. Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons. bioRxiv. , (2021).
  5. Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).
  6. Nori, S., et al. Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition. Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).
  7. Hentze, H., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).
  8. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  9. Hidaka, K., et al. Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells. The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).
  10. Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype. The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).
  11. Duan, Y., et al. Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).
  12. Takayama, K., et al. Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research. Biomaterials. 161, 24-32 (2018).
  13. Hattori, F., et al. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature methods. 7, 61-66 (2009).
  14. Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).
  15. Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis. Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).
  16. Swart, G. W. M. Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration. European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).
  17. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  18. Kamiya, A., Inagaki, Y. Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration. Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).
  19. Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential. PLOS One. 8 (7), e67541 (2013).
  20. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).
  21. Hirata, H., et al. ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes. Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Yamashita, H., Hattori, F. Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e65777, doi:10.3791/65777 (2023).

View Video