Einfrierverletzung im Kaumuskel der Maus zur Etablierung eines orofazialen Muskelfibrosemodells

Die orofaziale Muskulatur ist entscheidend für tägliche physiologische Aktivitäten wie Kauen, Sprechen, Atmen und Gesichtsausdruck¹. Bei angeborenen orofazialen Deformitäten weisen diese Muskeln jedoch atrophische und fibrotische Veränderungen auf, die zu einer Beeinträchtigung der Körpergesundheit und der sozialen Kognition führen². Die rekonstruktive Gesichtschirurgie ist nach wie vor die erste Wahl, aber bis zu 30-70 % der postoperativen Patienten leiden immer noch an Muskelschwund und Muskelfunktionsstörungen ^3,4 Das Versagen der orofazialen Muskelregeneration wird auf intrinsische Faktoren zurückgeführt, die nicht allein durch eine Operation korrigiert werden können.

Das Aufkommen der orofazialen Muskeln ist eine evolutionäre Neuheit, die mit dem komplexen Wirbeltierkopf und dem kammerförmigen Herzen einhergeht ^5,6. Im Gegensatz zu ihren aus Somiten gewonnenen Pendants in den Gliedmaßen entspringen die orofazialen Muskeln dem Kiemenbogen⁷. Diese phylogenetischen und ontogenetischen Merkmale können sie für ausgeprägte regenerative Verhaltensweisen prädisponieren⁸. Es wurde berichtet, dass der Kaumuskel (MAS) eine schwere Fibrose zu dem Zeitpunkt entwickelte, zu dem sich der Musculus tibialis anterior (TA) nach Exposition im gleichen Ausmaß der Verletzung vollständig^{regenerierte 1,9}. Der zugrundeliegende Mechanismus der Regeneration ist jedoch nach wie vor wenig verstanden.

In dieser Studie wurde ein Frostverletzungsmodell des Kaumuskels der Maus etabliert, um die Untersuchung der orofazialen Muskelregeneration zu erleichtern. Wir wählten 14 Tage nach der Verletzung als Zeitpunkt für die Beurteilung des Fibrose-Phänotyps, da dies der früheste Zeitpunkt war, zu dem eine erkennbare Divergenz zwischen zwei Muskeln erkennbar war. Die vollständige Regeneration des MAS nach einer Verletzung dauert mindestens 40 Wochen¹. Konsistent zeigte diese Studie eine bemerkenswerte Ablagerung von Kollagen nach einer Frostverletzung von MAS im Vergleich zur regulären Regeneration der TA 14 Tage nach der Verletzung. Mit Hilfe dieses Modells können weitere mechanistische Untersuchungen der Muskelatrophie und -fibrose durchgeführt werden, die wiederum dazu beitragen werden, potenzielle Therapiewege zur Förderung der orofazialen Muskelregeneration nach Operationen zu entwickeln.

Alle tierexperimentellen Verfahren in dieser Studie wurden von der Ethikkommission der West China School of Stomatology der Universität Sichuan überprüft und genehmigt (WCHSIRB-D-2020-114). Männliche C57BL/6-Mäuse (5 Wochen alt) wurden in einer feuchtigkeitskontrollierten (53 ± 2%) und temperaturkontrollierten (23 ± 2 °C) Anlage aufgezogen und befanden sich in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Frostverletzung

1. Anästhesie: Betäuben Sie die Mäuse mit mit Isofluran getränkten Wattebällchen und injizieren Sie Tiletamin-Zolazepam intraperitoneal in einer Dosis von 50 mg/kg. Die prä- und postoperative Analgesie erfolgte durch intraperitoneale Injektion von Meloxicam in einer Dosierung von 1 mg/kg. Schützen Sie ihre Augen mit Tierarztsalbe. Während des gesamten Eingriffs wurde ein Heizkissen mit einer Temperatur von 38 °C unter das OP-Tuch gelegt, um das Tier thermisch zu unterstützen. Fixieren Sie die Mäuse mit Klebeband, nachdem Sie sie auf die Seite auf einen Operationstisch gelegt haben (Abbildung 1). Beurteilen Sie die ausreichende Anästhesie anhand des Verlusts des Augenlidreflexes, des Aufrichtreflexes und des Pedalrückzugsreflexes.
   HINWEIS: Halten Sie bei der Anwendung einer Isofluoranästhesie die Maus in einer Hand und den mit Isofluoran getränkten Wattebausch in der anderen. Achten Sie darauf, den Wattebausch in einiger Entfernung zum Tier zu halten, um Beschwerden und Hautreizungen zu vermeiden.
2. Präoperative Haarentfernung: Rasieren Sie mit einem Elektrorasierer die Haare an der Wade und im Gesicht der Maus und tragen Sie die Enthaarungspaste mit einem Wattestäbchen auf die Haut auf, wobei Sie den Kaumuskel und den vorderen Tibialis-Muskel bedecken. Waschen Sie die Paste nach 1-2 Minuten mit einem chirurgischen Tuch auf Ethanolbasis ab (Abbildung 2A und Abbildung 2G). Die Operationsstellen wurden in drei Runden mit einem Peeling auf Jodbasis und 75 % Ethanol desinfiziert.
   HINWEIS: Der Elektrorasierer allein reichte für die Haarentfernung nicht aus, vor allem im Kaubereich. Beim Auftragen der Enthaarungspaste ist es wichtig, keine übermäßige Paste zu verwenden. Wischen Sie die Haut vorsichtig ab, wenn Sie die Paste abwaschen, um Hautverbrennungen zu vermeiden.
3. Exposition im Operationsfeld: Vor dem chirurgischen Eingriff mit OP-Abdeckungen abdecken. Für den MAS-Muskel tasten Sie zuerst am unteren Rand des Unterkiefers entlang. 5 mm vom Rand entfernt ist ein Schnitt von 7 mm entlang der Linie zu machen, die die orale Kommissur mit dem Tragus verbindet (die gestrichelte Linie zeigt die Lage des Schnitts in Abbildung 2B).
4. Für den TA-Muskel tasten Sie zuerst entlang der Wade entlang, um den vorderen Rand des Tibiaknochens zu lokalisieren. Schneiden Sie mit einem Skalpell 2 mm hinter dem Rand durch die Haut, beginnend am Knie und endend am Knöchel (die gestrichelte Linie zeigt die Position des Schnitts in Abbildung 2H). Wenn bei jeder Maus der MAS- und der TA-Muskel auf der linken Seite verletzt sind, wird der andere Muskel auf der kontralateralen Seite als Kontrolle verwendet.
   HINWEIS: Dieser Schnitt ist sehr oberflächlich, um sicherzustellen, dass die Muskeln beim Schnitt nicht verletzt werden. Der Schnitt im Gesicht sollte nicht zu nahe am Tragus liegen. Andernfalls wird die Ohrspeicheldrüse freigelegt, was beim anschließenden Einfrieren zu übermäßigen Blutungen führt.
5. Einfrieren von Trockeneis: Halten Sie ein Stück Trockeneis mit einer vorgekühlten Pinzette entlang der Längsachsen der MAS- und TA-Muskeln (Abbildung 2C bzw. Abbildung 2I). Lege das Trockeneis direkt für 5 s direkt auf die Oberfläche des Muskels. Vergewissern Sie sich, dass der Muskel unmittelbar nach dem Entfernen des Trockeneises steif und blassweiß erscheint (Abbildung 2D und Abbildung 2J), aber dass er innerhalb von 22-25 s zu seiner normalen Farbe und Textur zurückkehrt, ähnlich wie der benachbarte unverletzte Muskel (Abbildung 2E und Abbildung 2K).
   HINWEIS: Die Pinzette, die das Trockeneis hält, sollte vorgekühlt werden, um eine schnelle Sublimation des Trockeneises zu vermeiden. Ein Timer ist obligatorisch, um die 5-Sekunden-Frostverletzung durchzuführen und die Erholungszeit des Muskels von 22-25 Sekunden zu zählen. Jeder Muskel mit einer Erholungszeit von weniger als 22 s oder länger als 25 s sollte aufgegeben werden. Dieser Schritt erfordert Übung.
6. Wundverschluss: Nach vollständiger Wiederherstellung des Muskels verschließen Sie die Hautwunde mit mindestens drei 7-0-Nähten (Abbildung 2F und Abbildung 2L).
7. Wiederbelebung: Wenn die Naht fertig ist, setzen Sie die Mäuse mit thermischer Unterstützung in den Käfig und überwachen Sie sie kontinuierlich, bis alle Aufrichtungsreflexe wiedererlangt sind.

2. Muskelaufbau

1. Euthanasieren Sie die Mäuse mit einer Überdosis Isofluran, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Entnehmen Sie die MAS- und TA-Muskeln auf beiden Seiten für die histologische Analyse.
2. MAS-Muskeldissektion: Schneiden Sie die Haut im Gesicht der Maus auf und entfernen Sie die Ohrspeicheldrüse, um den hinteren Teil des MAS-Muskels freizulegen. Präparieren Sie das MAS von seinem vorderen Ansatz bis hin zu seinem hinteren Ansatz am Unterkiefer. Der weiß gestrichelte Bereich zeigt den freiliegenden Teil des MAS (Abbildung 3A).
   HINWEIS: Der MAS-Muskel besteht aus tiefen und oberflächlichen Kompartimenten, die beide eng mit der Oberfläche des Unterkiefers verbunden sind. Achten Sie darauf, die Schere während der Dissektion an den Unterkiefer zu drücken, um eine vollständige Isolierung des MAS zu gewährleisten. Achten Sie darauf, die Zygomatico-Mandibularis von MAS durch ihre Grenzen zwischen Jochbein und Unterkiefer zu unterscheiden.
3. TA-Muskeldissektion: Schneiden Sie die Haut vom Knöchel bis zum Knie auf und entfernen Sie die Faszie, um den TA-Muskel freizulegen. Isolieren Sie mit der Spitze der Mikrodissektionszange die Sehne der TA und schieben Sie sie bis zum Knie, um die Fasern abzubrechen, die an der Tibia befestigt sind. Schneiden Sie dann die Sehne am Knöchel ab (Abbildung 3B).
   HINWEIS: Für den TA-Muskel gibt es einige Muskelsehnen um den Knöchel der Maus; Es würde Übung erfordern, die Sehne der TA zu erkennen, die die größte und der Tibia am nächsten ist.
4. Vorkühlung isopentan: Bereiten Sie zwei Isolierfässer vor; Füllen Sie das kleine Fass mit Isopentan und das große Fass mit flüssigem Stickstoff. Platzieren Sie den kleinen Zylinder 10 Minuten vor der Muskeldissektion in dem großen Zylinder (Abbildung 3D).
5. Vorbereitung der Einbettungsform: Stellen Sie für jede Probe eine zylindrische Zinnfolienform her und füllen Sie sie mit der optimalen Schnitttemperatur (OCT).
6. Frisch gefroren: Tauchen Sie den Muskel in OCT ein und halten Sie ihn senkrecht zur OCT-Verbindung (Abbildung 3C). Verwenden Sie einen Nadelhalter, um die Form in das vorgekühlte Isopentan zu übertragen. Warten Sie 40 s, bis das OCT weiß und durchgehend wird (Abbildung 3D).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Position der Form nicht zu niedrig ist. Andernfalls vermischt sich das Isopentan mit dem OCT und beeinträchtigt den Prozess des Einfrierens der Muskeln. Die Höhe der OCT in der Form sollte mit der Höhe der Muskelprobe vergleichbar sein. Vermeiden Sie eine übermäßige Menge an OCT, um ein schnelles und effizientes Einfrieren zu gewährleisten.
7. Probenlagerung: Lagern Sie frische gefrorene Muskelproben in klar beschrifteten 24-Well-Platten. Trennen Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie für den Langzeitgebrauch bei -80 °C.

3. Histologische Analyse

1. Mit einem Kryostaten schneiden Sie 10 μm dicke Schnitte aus der Muskelprobe auf oberflächenbehandelte Objektträger.
2. Legen Sie die Objektträger für 20 min in eiskaltes Aceton und trocknen Sie sie 20 min lang an der Luft.
3. Waschen Sie die Objektträger 3 x 5 min lang mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   HINWEIS: Von diesem Schritt an wurden die Objektträger in einer Feuchtigkeitskammer aufbewahrt, um ein Austrocknen zu vermeiden.
4. Sirius Red Färbung
   1. Bereiten Sie Sirius Red Arbeitslösung vor, indem Sie 0,5 g Sirius Red Pulver in 500 ml gesättigter Pikrinsäure auflösen.
   2. Färben Sie die Objektträger 1 h lang bei Raumtemperatur mit Sirius Red Arbeitslösung.
   3. Waschen Sie die Objektträger 2 x 5 min mit 0,5% Essigsäure.
   4. Nach dem Färbeprozess sollten die Proben zuerst 15 s lang in 95 %igem Ethanol dehydriert werden, gefolgt von einer Dehydratisierung in wasserfreiem Ethanol für 1 min. Der letzte Schritt besteht darin, die Rutsche mit neutralem Balsam zu montieren.
5. Immunhistologische Färbung
   1. Permeabilisieren Sie die Abschnitte mit 0,3 % Triton in PBS für 20 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einer PBS-Wäsche.
   2. Für die Pax7-Färbung blockieren Sie die Abschnitte mit dem Reagenz, das mit dem Referenzkit geliefert wurde. Für die Laminin- und Pdgfrα-Färbung mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 5 % Eselserum in PBS für 1 h bei Raumtemperatur blockieren.
   3. Inkubieren Sie die Schnitte mit primären Antikörpern gegen Pax7, Laminin und Pdgfrα über Nacht bei 4 °C, gefolgt von einem Waschen mit PBS für 3 x 5 Minuten.
   4. Inkubieren Sie die Schnitte mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Sekundärantikörpern für 1 h bei Raumtemperatur, gefolgt von einem Waschen mit PBS für 3 x 5 min.
   5. Mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) 3 min bei Raumtemperatur inkubieren, anschließend 3 x 5 min mit PBS waschen.
   6. Legen Sie Montagemedium auf die Sektion, legen Sie das Deckglas darauf und verwenden Sie Nagellack, um das Deckglas zu versiegeln.

Die HE- und Sirius-Red-Färbung (Abbildung 4 und ergänzende Abbildung S1) zeigten eine vollständige Muskelregeneration von TA in diesem Modell mit Gefrierverletzungen. Im Gegensatz dazu zeigte MAS eine gestörte Myofaserregeneration und eine übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix. Die Histologie des intakten MAS- und TA-Muskels ist in Abbildung 4A, B dargestellt, wo die Myofasern ausgerichtet sind und der fibrotische Bereich nur im interstitiellen Raum und zwischen verschiedenen Bündeln auftrat. Während der TA-Muskel 14 Tage nach der Verletzung weitgehend die gleiche Muskelstruktur wie seine intakte Kontrolle hatte (Abbildung 4G-J), war die Struktur des MAS-Muskels stark gestört (Abbildung 4C-F). Fibrotische Areale traten an der Stelle fast aller Muskelfasern im anterioren, mittleren und hinteren Querschnitt des MAS-Muskels auf (Abbildung 4C-F).

Die immunhistologische Färbung von Pax7 (Ergänzende Abbildung S2) und Pdgfrα ermöglichte weitere Untersuchungen der Muskelsatellitenzellen (MuSCs) bzw. der fibro-adipogenen Vorläuferzellen (FAPs). Im MAS-Muskel traten bei 14 dpi dicht besiedelte Kerne auf, jedoch ohne proportional erhöhte MuSCs (Abbildung 5A,B). Eine große Anzahl zentral kernhaltiger Myofasern (dargestellt durch die blaue Pfeilspitze) wurde bei TA bei 14 dpi nachgewiesen (Abbildung 5H), während die Kontur der Myofasern bei MAS im verletzten Bereich kaum wahrnehmbar war (Abbildung 5E,F). Stattdessen wurde die Infiltration von Pdgfrα-positiven FAPs und neu gebildeten Myofasern mit kleinem Durchmesser (durch weiße Pfeile gekennzeichnet) beobachtet (Abbildung 5F).

Abbildung 1: Ein Überblick über den chirurgischen Aufbau. (A) Die Maus wurde betäubt und auf dem Operationstisch fixiert. Auf der linken Seite wurden Haare im Gesicht und am Bein entfernt. Ein Timer wurde verwendet, um das Einfrieren der Muskeln und die Erholungszeit zu überwachen. (B) Trockeneis mit einem Durchmesser von 3,5 mm und einer Höhe von 6-12 mm wurde in einem Becherglas zum Einfrieren vorbereitet. Die Pinzette wurde für den späteren Gebrauch in Trockeneis vorgekühlt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Die intraoperative Aufzeichnung von MAS- und TA-Gefrierverletzungen. (A) Haarentfernung bei MAS-Einfrieren. (B) Öffnen Sie die Haut, um den MAS-Muskel freizulegen. (C) Einfrieren mit Trockeneis entlang der Längsachse von MAS. (D) Das Auftreten von MAS unmittelbar nach 5 s Gefrieren. (E) Das Auftreten von MAS nach 22-25 Sekunden der Genesung. (F) Verschluss der Gesichtswunde. (G) Haarentfernung zum Einfrieren von TA. (H) Öffnen Sie die Haut, um den TA-Muskel freizulegen. (I) Einfrieren mit Trockeneis entlang der Längsachse der TA. (J) Das Auftreten von TA unmittelbar nach 5 s Gefrieren. (K) Das Auftreten von TA nach 22-25 s Genesung. (L) Verschluss der Beinwunde. Abkürzungen: MAS = masseter; TA = Tibialis anterior. Die gestrichelten Linien in den Abbildungen 2B und 2H zeigen die Lage der Schnitte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: MAS- und TA-Muskelentnahme. (A) Das Auftreten des MAS-Muskels 14 Tage nach der Frostverletzung. Das rot gestrichelte Oval zeigt MAS an; Das weiße gestrichelte Dreieck zeigt die Freilegung des MAS-Muskels. (B) Das Auftreten des TA-Muskels 14 Tage nach der Frostverletzung. Das rot gestrichelte Oval zeigt TA an. (C) Tauchen Sie die Muskelprobe senkrecht in die OCT-Verbindung. (D) Übertragen Sie die Muskelprobe auf stickstoffgekühltes Isopentan. Abkürzungen: MAS = masseter; TA = Tibialis anterior; OCT = optimale Schnitttemperatur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Histologische Analyse der MAS- und TA-Muskeln. Sirius-Rot-Färbung des intakten (A-E) Muskelabschnitts des MAS und des vorderen, mittleren und hinteren Abschnitts des MAS bei 14 dpi. (F-J) Intakter Muskelabschnitt der TA und vorderer, mittlerer und hinterer Abschnitt der TA bei 14 dpi. Maßstabsleiste = 100 μm. Abkürzungen: MAS = masseter; TA = Tibialis anterior; dpi = Tage nach der Verletzung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Immunfluoreszenzanalyse von MAS- und TA-Muskeln. Immunfärbung von Pax7 und DAPI (blau) in (A) intaktem MAS, (B) 14 dpi MAS, (C) intaktem TA und (D) 14 dpi TA. Immunfärbung von Laminin, Pax7 und DAPI (blau) in (E) intaktem MAS, (F) 14 dpi MAS, (G) intaktem TA und (H) 14 dpi TA. Maßstabsleiste = 20 μm. Abkürzungen: MAS = masseter; TA = Tibialis anterior; dpi = Tage nach der Verletzung; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Die weißen Pfeile zeigen die repräsentative Faser mit kleinem Durchmesser des MAS an. Die blau gestrichelte Fläche und die Pfeile zeigen die repräsentativen regenerierenden Myofasern und zentralen Kerne der TA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Persistierende Fibrose während der Muskelregeneration. (A) Schematische Darstellung der TA- und MAS-Muskelregeneration, die durch eine Frostverletzung induziert wird. (B-G) Repräsentative Bilder der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung in TA- und MAS-Muskelquerschnitten zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung. Maßstabsleisten = 100 μm. Diese Abbildung ist eine Reproduktion von Cheng et al.8. Abkürzungen: MAS = masseter; TA = Tibialis anterior; dpi = Tage nach der Verletzung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Beeinträchtigung des Myogeneseprozesses. (A) Immunfluoreszenzbilder von Pax7 (grün) und DAPI (blau) im TA- und MAS-Muskel. (B) Quantifizierung des Prozentsatzes der Pax7-positiven/DAPI-Kerne. Maßstabsbalken = 100 μm * Zeigt an, dass er sich deutlich von der intakten Muskelkontrolle unterscheidet. # Zeigt an, dass er sich deutlich vom anderen Muskel zum gleichen Zeitpunkt unterscheidet. **p < 0,01, ##p < 0,01. Diese Abbildung ist eine Reproduktion von Cheng et al.8. Abkürzungen: MAS = masseter; TA = Tibialis anterior; dpi = Tage nach der Verletzung; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.