Dieses Protokoll stellt ein physiologisch relevantes Tumor-on-a-Chip-Modell vor, um Hochdurchsatz-Grundlagen- und translationale Krebsforschung am Menschen durchzuführen und das Arzneimittel-Screening, die Krankheitsmodellierung und Ansätze der personalisierten Medizin mit einer Beschreibung von Lade-, Wartungs- und Bewertungsverfahren voranzutreiben.
Der Mangel an validierten Krebsmodellen, die die Tumormikroumgebung solider Krebsarten in vitro rekapitulieren, stellt nach wie vor einen erheblichen Engpass für die präklinische Krebsforschung und die therapeutische Entwicklung dar. Um dieses Problem zu lösen, haben wir den vaskularisierten Mikrotumor (VMT) oder Tumorchip entwickelt, ein mikrophysiologisches System, das die komplexe Mikroumgebung des menschlichen Tumors realistisch modelliert. Die VMT bildet sich de novo innerhalb einer mikrofluidischen Plattform durch Co-Kultur mehrerer humaner Zelltypen unter dynamischen, physiologischen Strömungsbedingungen. Dieses Gewebe-Engineering-Mikrotumor-Konstrukt enthält ein lebendes, durchblutetes Gefäßnetzwerk, das die wachsende Tumormasse genauso unterstützt, wie es neu gebildete Gefäße in vivo tun. Wichtig ist, dass Medikamente und Immunzellen die Endothelschicht überwinden müssen, um den Tumor zu erreichen, wodurch physiologische Barrieren für die therapeutische Verabreichung und Wirksamkeit in vivo modelliert werden. Da die VMT-Plattform optisch transparent ist, kann eine hochauflösende Bildgebung dynamischer Prozesse wie Immunzellextravasation und Metastasierung mit direkter Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Zellen innerhalb des Gewebes erreicht werden. Darüber hinaus behält die VMT in vivo die Tumorheterogenität, die Genexpressionssignaturen und das Ansprechen auf Medikamente bei. Praktisch jeder Tumortyp kann an die Plattform angepasst werden, und Primärzellen aus frischem chirurgischem Gewebe wachsen und sprechen auf die medikamentöse Behandlung in der VMT an, was den Weg zu einer wirklich personalisierten Medizin ebnet. Hier werden die Methoden zur Etablierung des VMT und dessen Nutzung für die onkologische Forschung skizziert. Dieser innovative Ansatz eröffnet neue Möglichkeiten für die Untersuchung von Tumoren und Arzneimittelreaktionen und gibt Forschern ein leistungsfähiges Werkzeug an die Hand, um die Krebsforschung voranzutreiben.
Krebs ist nach wie vor ein großes Gesundheitsproblem weltweit und die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Allein für das Jahr 2023 rechnet das National Center for Health Statistics mit mehr als 1,9 Millionen neuen Krebsfällen und über 600.000 Krebstodesfällen in den USA1, was den dringenden Bedarf an wirksamen Behandlungsansätzen unterstreicht. Derzeit erhalten jedoch nur 5,1 % der Krebstherapeutika, die sich in klinischen Studien befinden, letztendlich eine FDA-Zulassung. Das Scheitern vielversprechender Kandidaten, klinische Studien erfolgreich zu durchlaufen, kann teilweise auf die Verwendung nicht-physiologischer Modellsysteme wie 2D- und Sphäroidkulturen während der präklinischen Arzneimittelentwicklung zurückgeführt werden2. Diesen klassischen Krebsmodellen fehlen wesentliche Komponenten der Tumormikroumgebung, wie z. B. eine stromale Nische, assoziierte Immunzellen und durchblutete Gefäße, die wichtige Determinanten der therapeutischen Resistenz und des Fortschreitens der Krankheit sind. Daher ist ein neues Modellsystem notwendig, das die menschliche in vivo Tumormikroumgebung besser nachahmt, um die klinische Translation präklinischer Befunde zu verbessern.
Das Gebiet des Tissue Engineering schreitet rasant voran und bietet verbesserte Methoden zur Untersuchung menschlicher Krankheiten im Labor. Eine wichtige Entwicklung ist das Aufkommen mikrophysiologischer Systeme (MPS), auch bekannt als Organchips oder Gewebechips, bei denen es sich um funktionelle, miniaturisierte menschliche Organe handelt, die in der Lage sind, gesunde oder kranke Zustände zu replizieren 3,4,5. In diesem Zusammenhang wurden für die onkologische Forschung Tumorchips, d.h. dreidimensionale mikrofluidikbasierte in vitro humane Tumormodelle, entwickelt 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Diese fortschrittlichen Modelle enthalten biochemische und biophysikalische Hinweise in einer dynamischen Tumormikroumgebung und ermöglichen es den Forschern, das Verhalten von Tumoren und das Ansprechen auf Behandlungen in einem physiologisch relevanteren Kontext zu untersuchen. Trotz dieser Fortschritte haben jedoch nur wenige Gruppen erfolgreich ein lebendes, funktionelles Gefäßsystem integriert, insbesondere eines, das sich als Reaktion auf den physiologischen Fluss selbst mustert 3,4,5,6. Die Einbeziehung eines funktionellen vaskulären Netzwerks ist von entscheidender Bedeutung, da es die Modellierung physikalischer Barrieren ermöglicht, die die Verabreichung von Medikamenten oder Zellen, das Homing von Zellen in bestimmte Mikroumgebungen und die transendotheliale Migration von Tumor-, Stroma- und Immunzellen beeinflussen. Durch die Einbeziehung dieses Merkmals kann der Tumorchip die Komplexität, die in der In-vivo-Tumormikroumgebung beobachtet wird, besser darstellen.
Um diesen ungedeckten Bedarf zu decken, haben wir eine neuartige Wirkstoff-Screening-Plattform entwickelt, die es ermöglicht, Mikrogefäßnetzwerke innerhalb eines mikrofluidischen Gerätszu bilden 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Diese Basis-Organchip-Plattform, die als vaskularisiertes Mikroorgan (VMO) bezeichnet wird, kann an praktisch jedes Organsystem angepasst werden, um die ursprüngliche Gewebephysiologie für die Krankheitsmodellierung, das Arzneimittelscreening und Anwendungen der personalisierten Medizin zu replizieren. VMOs werden durch die Co-Kultivierung von endothelialen koloniebildenden zellabgeleiteten Endothelzellen (ECFC-EC), HUVEC oder iPSC-EC (im Folgenden EC) und mehreren Stromazellen in der Kammer etabliert, einschließlich normaler menschlicher Lungenfibroblasten (NHLF), die die Matrix umbauen, und Perizyten, die die Gefäße umhüllen und stabilisieren. Das VMO kann auch als Krebsmodellsystem etabliert werden, indem Tumorzellen mit dem zugehörigen Stroma kokultiviert werden, um einen vaskularisierten Mikrotumor (VMT)8,9,10,11,12,13 oder ein Tumorchip-Modell zu erstellen. Durch die Co-Kultur mehrerer Zelltypen in einer dynamischen Flussumgebung bilden perfundierte mikrovaskuläre Netzwerke de novo in den Gewebekammern des Geräts, wo die Vaskulogenese durch interstitielle Flussraten eng reguliert wird14,15. Das Medium wird durch einen hydrostatischen Druckkopf durch die mikrofluidischen Kanäle des Geräts getrieben, der die umgebenden Zellen der Gewebekammer ausschließlich über die Mikrogefäße mit Nährstoffen versorgt, mit einem Permeabilitätskoeffizienten von 1,2 x 10-7 cm/s, ähnlich wie bei Kapillaren in vivo8.
Die Integration von selbstorganisierenden Mikrogefäßen in das VMT-Modell stellt einen bedeutenden Durchbruch dar, da es: 1) die Struktur und Funktion vaskularisierter Tumormassen in vivo nachahmt; 2) kann Schlüsselschritte der Metastasierung modellieren, einschließlich Tumor-Endothel- und Stromazell-Interaktionen; 3) etabliert physiologisch selektive Barrieren für die Nährstoff- und Arzneimittelabgabe und verbessert so das pharmazeutische Screening; und 4) ermöglicht die direkte Bewertung von Medikamenten mit anti-angiogenen und anti-metastasierenden Eigenschaften. Durch die Replikation der In-vivo-Verabreichung von Nährstoffen, Medikamenten und Immunzellen in einer komplexen 3D-Mikroumgebung ist die VMO/VMT-Plattform ein physiologisch relevantes Modell, das zur Durchführung von Wirkstoff-Screenings und zur Untersuchung der Krebs-, Gefäß- oder organspezifischen Biologie verwendet werden kann. Wichtig ist, dass die VMT das Wachstum verschiedener Arten von Tumoren unterstützt, darunter Dickdarmkrebs, Melanom, Brustkrebs, Glioblastom, Lungenkrebs, Peritonealkarzinose, Eierstockkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs 8,9,10,11,12,13. Die mikrofluidische Plattform ist nicht nur kostengünstig, einfach einzurichten und für Hochdurchsatzexperimente geeignet, sondern auch optisch vollständig kompatibel für die Echtzeit-Bildanalyse von Tumor-Stroma-Interaktionen und die Reaktion auf Stimuli oder Therapeutika. Jeder Zelltyp im System ist mit einem anderen Fluoreszenzmarker markiert, um eine direkte Visualisierung und Verfolgung des Zellverhaltens während des gesamten Experiments zu ermöglichen und ein Fenster in die dynamische Tumormikroumgebung zu schaffen. Wir haben bereits gezeigt, dass die VMT das Wachstum, die Architektur, die Heterogenität, die Genexpressionssignaturen und das Ansprechen von Medikamenten in vivo genauer modelliert als Standardkulturmodalitäten10. Wichtig ist, dass die VMT das Wachstum und die Untersuchung von Patientenzellen, einschließlich Krebszellen, unterstützt, die die Pathologie der Elterntumoren besser modellieren als Standard-Sphäroidkulturen und die Bemühungen um personalisierte Medizin weiter vorantreiben11. Dieses Manuskript skizziert die Methoden zur Etablierung des VMT und zeigt seinen Nutzen für die Untersuchung menschlicher Krebserkrankungen.
Fast jedes Gewebe im Körper erhält Nährstoffe und Sauerstoff über das Gefäßsystem, was es zu einer kritischen Komponente für eine realistische Krankheitsmodellierung und ein Arzneimittelscreening in vitro macht. Darüber hinaus werden verschiedene Malignome und Krankheitszustände durch vaskuläre endotheliale Dysfunktion und Hyperpermeabilität definiert3. Bemerkenswert ist, dass bei Krebs das tumorassoziierte Gefäßsystem oft schlecht durchblutet, gestört und undicht ist, was a…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Mitgliedern des Labors von Dr. Christopher Hughes für ihren wertvollen Beitrag zu den beschriebenen Verfahren sowie unseren Mitarbeitern im Labor von Dr. Abraham Lee für ihre Unterstützung bei der Entwicklung und Herstellung der Plattform. Diese Arbeit wurde durch folgende Zuschüsse unterstützt: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) und TL1 TR001415 und W81XWH2110393 (SJH).
Fabrication | |||
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
Cell culture/Loading | |||
BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |