Summary

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Published: February 02, 2024
doi:

Summary

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Abstract

Technisch hergestellte Zelltherapien, die chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen verwenden, haben eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei Personen mit hämatologischen Malignomen erreicht und befinden sich derzeit in der Entwicklung für die Behandlung verschiedener solider Tumoren. Bisher erfolgte die vorläufige Evaluierung neuartiger CAR-T-Zellprodukte überwiegend in Xenograft-Tumormodellen mit immundefizienten Mäusen. Dieser Ansatz wurde gewählt, um die erfolgreiche Transplantation von humanen CAR-T-Zellen in der experimentellen Umgebung zu erleichtern. Syngene Mausmodelle, in denen Tumore und CAR-T-Zellen vom selben Mausstamm abstammen, erlauben jedoch die Evaluierung neuer CAR-Technologien im Kontext eines funktionierenden Immunsystems und einer umfassenden Tumormikroumgebung (TME). Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, den Prozess der Generierung von CAR-T-Zellen in der Maus zu rationalisieren, indem standardisierte Methoden für die retrovirale Transduktion und die ex vivo T-Zellkultur vorgestellt werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können auf andere CAR-Konstrukte als die in dieser Studie verwendeten angewendet werden, um eine routinemäßige Evaluierung neuer CAR-Technologien in immunkompetenten Systemen zu ermöglichen.

Introduction

Adoptive T-Zell-Therapien, die chimäre Antigenrezeptoren (CARs) exprimieren, haben das Gebiet der Krebsimmuntherapie revolutioniert, indem sie die Kraft des adaptiven Immunsystems nutzen, um antigenpositive Krebszellen spezifisch anzuvisieren und zu eliminieren1. Während der Erfolg von CAR-T-Zelltherapien, die auf maligne B-Zell-Erkrankungen abzielen, klinisch validiert wurde, sind präklinische Studien, die in Tiermodellen durchgeführt wurden, für die Entwicklung neuer CARs, die auf solide Tumore abzielen, nach wie vor von entscheidender Bedeutung. Bisher konnte jedoch nur eine begrenzte klinische Wirksamkeit bei soliden Tumorindikationen nachgewiesen werden, und es wird immer deutlicher, dass einzelne präklinische Modelle die Pharmakodynamik und klinische Wirksamkeit eines lebenden Arzneimittels nicht genau vorhersagen 2,3. Daher haben die Forscher begonnen, die präklinische Studie mit CAR-T-Zellprodukten zu erweitern, um parallele Bewertungen in Xenotransplantat- und syngenen Modellen von menschlichen bzw. murinen Krebserkrankungen einzubeziehen.

Im Gegensatz zu Xenograft-Modellen, bei denen menschliche Tumore und T-Zellen in immundefiziente Mäuse transplantiert werden, ermöglichen syngene Modelle die Untersuchung von CAR-T-Zellantworten im Kontext eines funktionierenden Immunsystems. Insbesondere bieten immunkompetente Mäuse mit syngenen Tumoren ein System zur Untersuchung der Interaktion zwischen adoptiv übertragenen T-Zellen und kontextspezifischen Milieus – einschließlich tumorassoziierter Makrophagen (TAMs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs), von denen bekannt ist, dass sie die T-Zell-Funktion in der Tumormikroumgebung (TME) unterdrücken4,5,6. Darüber hinaus bieten syngene Modelle eine zusätzliche Plattform zur Bewertung der On-Target- und Off-Tumor-Toxizität und der Interaktion von CAR-T-Zellen mit Wirtsfaktoren, die zu zusätzlichen Toxizitäten führen können, einschließlich des Zytokinfreisetzungssyndroms7.

Trotz dieser Vorteile ist die Anzahl der syngenen CAR-T-Zellstudien nach wie vor begrenzt. Insbesondere erfordern syngene Modelle ein autologes Engineering von CAR-T-Zellen aus demselben Mausstamm und stellen daher eine zusätzliche Herausforderung dar, da es keine Methodik für eine effiziente murine T-Zell-Transduktion und ex vivo Expansion gibt 2,8. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden, um eine stabile CAR-Expression durch die Produktion retroviraler Vektoren und eine optimierte T-Zell-Transduktion zu erreichen. Ein Schema des gesamten Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Verwendung dieses Ansatzes demonstriert eine effiziente retrovirale Transduktion von murinen CAR-T-Zellen und das Erreichen einer hohen CAR-Expression ohne die Notwendigkeit einer Viruskonzentration durch Ultrazentrifugation. Neben der Co-Expression weiterer Transgene werden auch Strategien zur Veränderung der Antigenspezifität des CAR-Konstrukts diskutiert.

Protocol

Alle Tierbehandlungen wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, Protokolle AC-AABQ5551 und AC-AAAZ4470) mit 6-8 Wochen alten weiblichen BALB/c- oder CF57BL/6-Mäusen mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g durchgeführt. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Dieses Protokoll ist um die “Tage nach der Aktivierung” der murinen T-Zellen herum strukturiert, und die Virusproduktion beginnt am Tag -2. Das Retrovirus kann nac…

Representative Results

Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, den Prozess der murinen T-Zell-Transduktion für die Generierung von CAR-T-Zellen der Maus zu standardisieren. Abbildung 1 enthält eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte. Der Prozess beginnt mit der Produktion retroviraler Vektoren durch Co-Transfektion von viralen Komponenten in Phoenix Eco-Zellen. Abbildung 2 zeigt die optimale Dichte der Phoenix Eco-Zellen am Tag der Transfektion. Isoli…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte und Reagenzien, die für die retrovirale Transduktion von murinen T-Zellen zur Generierung von CAR-T-Zellen für In-vivo-Studien erforderlich sind. Durch die Optimierung der retroviralen Transduktionsbedingungen wird eine robuste CAR-Expression erreicht, ohne dass eine Viruskonzentration durch Ultrazentrifugation oder zusätzliche Reagenzien erforderlich ist. Es gibt jedoch mehrere Modifikationen, die auf diese Methodik angewendet werden können.

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken L. Brockmann für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch NIH 1R01EB030352 und UL1 TR001873 unterstützt.

Materials

0.45 μm filters MilliporeSigma SLHVR33RS
1 mL syringe  Fisher Scientific  14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes  Fisher Scientific  05-408-135
10 mL syringe  BD 14-823-16E
100 μm strainer Corning 07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes ThermoFisher Scientific  130183
15 mL conical tubes  Falcon 14-959-70C
40 μm strainer  Corning 07-201-430
50 mL conical tubes  Falcon 14-959-49A
70 μm strainer Corning 07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer  ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old  Jackson Laboratory 651
B-Mercaptoethanol  Gibco 21985023
Bovine Serum Albumin  GOLDBIO A-420-500
DMEM Medium Gibco 11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium  Gibco 14-190-250
DynaMag-2 Magnet  Invitrogen 12-321-D
EasySep Magnet  Stemcell Technologies 18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19851
FACS buffer  BD BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)  Corning MT35011CV
GlutaMAX Gibco 35-050-061
G-Rex6 Wilson Wolf 80240M 
HEPES Buffer Solution  Gibco 15-630-080
Human recombinant IL-15  Miltenyi Biotec 130-095-765
Human recombinant IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-748
Human recombinant IL-7 Miltenyi Biotec 130-095-363
Lipofectamine 3000 Invitrogen L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Gibco 11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421 Biolegend 100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads Gibco 11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605 BD 563151
Mouse Anti-CD44 APC  Biolegend 103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 Tonbo SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 Tonbo SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera  Nikon
Non-treated 24 well plates  CytoOne CC7672-7524
Opti-MEM Gibco 31-985-062
pCL-Eco Addgene #12371
Penicillin/Streptomycin Solution Gibco 15-070-063
Phoenix Eco cells ATCC CRL-3214
pMDG.2 Addgene #12259
pMSCV_PGK_GFP28z N/A Produced by R.LV.
Purified sfGFP N/A Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent') Takara Bio T100B
RPMI 1640 Gibco 21875
Serological pipette 10 mL Fisher Scientific  13-678-11E
Serological pipette 25 mL Fisher Scientific  13-678-11
Serological pipette 5 mL Fisher Scientific  13-678-11D
Sodium Pyruvate Gibco 11-360-070
TC-treated 24 well plates  Corning 08-772-1
Trypan blue  Gibco 15-250-061

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Vincent, R. L., Li, F., Ballister, E. R., Arpaia, N., Danino, T. Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells. J. Vis. Exp. (204), e65887, doi:10.3791/65887 (2024).

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