Primäre sensorische Areale im Neokortex zeigen während der Entwicklung einzigartige spontane Aktivitäten. In diesem Artikel wird beschrieben, wie einzelne Neuronenaktivitäten und primäre sensorische Areale visualisiert werden können, um bereichsspezifische synchrone Aktivitäten bei neugeborenen Mäusen in vivo zu analysieren.
Das Gehirn von Säugetieren durchläuft während der pränatalen und postnatalen Periode dynamische Entwicklungsveränderungen sowohl auf zellulärer als auch auf Schaltkreisebene. Nach der Entdeckung zahlreicher Gene, die zu diesen Entwicklungsveränderungen beitragen, ist nun bekannt, dass auch die neuronale Aktivität diese Prozesse wesentlich moduliert. In der sich entwickelnden Großhirnrinde weisen Neuronen synchronisierte Aktivitätsmuster auf, die auf jeden primären sensorischen Bereich spezialisiert sind. Diese Muster unterscheiden sich deutlich von denen, die in der reifen Hirnrinde beobachtet werden, was ihre Rolle bei der Regulierung bereichsspezifischer Entwicklungsprozesse unterstreicht. Defizite in der neuronalen Aktivität während der Entwicklung können zu verschiedenen Erkrankungen des Gehirns führen. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, die Regulationsmechanismen zu untersuchen, die den Aktivitätsmustern in der neuronalen Entwicklung zugrunde liegen. Diese Arbeit fasst eine Reihe von Protokollen zusammen, um primäre sensorische Areale und neuronale Aktivität bei neonatalen Mäusen zu visualisieren, die Aktivität einzelner Neuronen innerhalb der kortikalen Teilfelder mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in vivo abzubilden und teilfeldbezogene Aktivitätskorrelationen zu analysieren. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse der Patchwork-artigen synchronen Aktivität innerhalb einzelner Fässer im somatosensorischen Kortex. Wir diskutieren auch verschiedene mögliche Anwendungen und einige Einschränkungen dieses Protokolls.
Die Großhirnrinde umfasst mehrere sensorische Areale mit unterschiedlichen Funktionen. Die Areale erhalten Eingaben, die von den entsprechenden Sinnesorganen ausgehen und meist über das Rückenmark oder den Hirnstamm weitergeleitet und über den Thalamus 1,2 weitergeleitet werden. Bemerkenswert ist, dass Neuronen in jedem primären sensorischen Bereich während der frühen Entwicklungsstadien eine einzigartig synchronisierte Aktivität aufweisen, die ebenfalls von den Sinnesorganen oder den unteren Nervenzentren ausgeht, sich aber im Wesentlichen von den Aktivitäten unterscheidet, die im reifen Kortex beobachtet werden3.
Bei neonatalen Nagetieren beispielsweise zeigt der primäre Sehbereich (V1) eine wellenartige Aktivität, die von der Netzhaut ausgeht (Netzhautwelle) und sich über die gesamte Sehbahn ausbreitet, während die Retinotopieerhalten bleibt 4. Der primäre auditorische Bereich (A1) zeigt eine synchrone Aktivität, die in bandförmigen Subregionen organisiert ist, die den Isofrequenzbändern im reifen Gehirn entsprechen. Die Aktivität geht von den inneren Haarzellen der Cochlea aus 5,6. Der Fasskortex im primären somatosensorischen Bereich (S1) zeigt ein patchworkartiges Aktivitätsmuster, in dem Neuronen der Schicht 4 innerhalb einzelner Fässer, nämlich Neuronen, die auf einzelne Schnurrhaare reagieren, synchron aktiviert werden7. Obwohl vermutet wird, dass sie vom Trigeminusganglion ausgeht, ist die Quelle der Aktivität unbekannt7. Folglich sind die Aktivitätsmuster von Neugeborenen sowohl innerhalb jedes primären sensorischen Bereichs als auch innerhalb der intra-räumlichen Teilbereiche spezialisiert. Die gleichzeitige Visualisierung der neuronalen Aktivität und der Struktur primärer sensorischer Areale kann eine Untersuchung des Beitrags dieser Aktivitätsmuster zur Entwicklung sensorischer Systeme erleichtern.
In diesem Artikel haben wir eine Reihe von Protokollen zusammengefasst: (1) zur Visualisierung einzelner neuronaler Aktivitäten unter Verwendung der spärlichen Markierung von GCaMP und primären sensorischen Bereichen unter Verwendung von TCA-RFP-Mäusen, die rot fluoreszierendes Protein in thalamokortikalen Axonen exprimieren7, (2) zur Abbildung der Aktivität auf Einzelzellebene bei neonatalen Mäusen mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in vivound (3) die Aktivitätskorrelationen innerhalb des S1-Fasskortex zu analysieren. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen eine Patchwork-artig synchronisierte Aktivität innerhalb einzelner Fässer einer postnatalen Tag (P)6 Maus. Trotz einiger Einschränkungen kann diese Technik für die chronische Bildgebung, die Weitfeldbildgebung über mehrere sensorische Bereiche und verschiedene Manipulationsexperimente verwendet werden. Die facettenreiche Analyse der neuronalen Aktivität während der Entwicklung wird unser Verständnis der Mechanismen der Bildung von Schaltkreisen im Gehirn bereichern.
Angesichts der Tatsache, dass die spontanen Aktivitäten aus dem Sinnesorgan oder dem unteren Nervensystem hervorgehen und über einen Weg, der dem eines reifen Nervensystems3 entspricht, zum primären sensorischen Bereich gelangen, ist es entscheidend, den primären sensorischen Bereich und die Position der abgebildeten Neuronen innerhalb des Bereichs zu definieren. In diesem Protokoll haben wir diese Anforderung erfüllt, indem wir transgene Mäuse eingesetzt ha…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (B) (22H05092, 22H05094) und für Scientific Research Grants 20K06876, AMED unter der Fördernummer 21wm0525015, der Takeda Science Foundation, der Naito Foundation, der Kato Memorial Bioscience Foundation, der Kowa Life Science Foundation, NIG-JOINT (24A2021) (an H.M.); und der Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid für wissenschaftliche Forschungsstipendien 19K06887 und 22K06446, dem Kodama Memorial Fund for Medical Research, der Uehara Memorial Foundation, der Kato Memorial Bioscience Foundation und der Takeda Science Foundation (an N.N-T). Wir danken Dr. Takuji Iwasato für die TCA-RFP-Mäuse.
20× objective lens (water immersion) | |||
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System | Corning | 431096 | |
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA) | Nacalai | 09154-85 | |
Acrylic resin (UNIFAST II) | GC | N/A | |
Agarose | Sigma | A9793 | |
Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | |
CaCl2•2H2O | Nacalai | 06731-05 | |
Electroporator | BEX | GEB14 | |
Eye drop (Scopisol) | Senju Pharmaceutical | N/A | |
Fluorescence stereo microscope | Leica | M165FC | |
Glucose | Nacalai | 16806-25 | |
Heating pad | Muromachi Kikai | FHC-HPS | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Isoflurane | Pfizer | N/A | |
KCl | Nacalai | 28514-75 | |
MgSO4•7H2O | Wako | 131-00405 | |
Micropipette puller | Narishige | PC-100 | |
Multiphoton laser | Spectra-Physics | Mai Tai eHP DeepSee | |
Multiphoton microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
NaCl | Nacalai | 31320-05 | |
Non-woven fabric (Kimwipe) | Kimberly Clark | S-200 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Nacalai | 27575-31 | |
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE | Addgene | pK175 | |
Plasmid: TRE-nCre | Addgene | pK031 | |
Precision calibrated micropipets | Drummond | 2-000-050 | |
Razor blade | Feather | FA-10 | |
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen) | Zoetis JP | N/A | |
Round cover glass, 3-mm-diameter | Matsunami | CS01078 | |
Saline | Otsuka | 035175315 | |
Sodium pentobarbital | Nacalai | 26427-72 | |
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning) | ThorLabs | LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M | |
TCA-RFP mouse | N/A | N/A | Mizuno et al., 2018a |
Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
Titanium bar | Endo Scientific Instrument | N/A | Custom made (Mizuno et al., 2018b) |
Titanium bar fixing plate | N/A | Custom made (Mizuno et al., 2018b) | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter | BEX | CUY650P5 | |
Wild-type ICR mouse | Nihon SLC | Slc:ICR |