Summary

In vivo Visualisierung der spontanen Aktivität im sensorischen Kortex von Neonatalen Mäusen mit einer Auflösung von einzelnen Neuronen

Published: November 21, 2023
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Summary

Primäre sensorische Areale im Neokortex zeigen während der Entwicklung einzigartige spontane Aktivitäten. In diesem Artikel wird beschrieben, wie einzelne Neuronenaktivitäten und primäre sensorische Areale visualisiert werden können, um bereichsspezifische synchrone Aktivitäten bei neugeborenen Mäusen in vivo zu analysieren.

Abstract

Das Gehirn von Säugetieren durchläuft während der pränatalen und postnatalen Periode dynamische Entwicklungsveränderungen sowohl auf zellulärer als auch auf Schaltkreisebene. Nach der Entdeckung zahlreicher Gene, die zu diesen Entwicklungsveränderungen beitragen, ist nun bekannt, dass auch die neuronale Aktivität diese Prozesse wesentlich moduliert. In der sich entwickelnden Großhirnrinde weisen Neuronen synchronisierte Aktivitätsmuster auf, die auf jeden primären sensorischen Bereich spezialisiert sind. Diese Muster unterscheiden sich deutlich von denen, die in der reifen Hirnrinde beobachtet werden, was ihre Rolle bei der Regulierung bereichsspezifischer Entwicklungsprozesse unterstreicht. Defizite in der neuronalen Aktivität während der Entwicklung können zu verschiedenen Erkrankungen des Gehirns führen. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, die Regulationsmechanismen zu untersuchen, die den Aktivitätsmustern in der neuronalen Entwicklung zugrunde liegen. Diese Arbeit fasst eine Reihe von Protokollen zusammen, um primäre sensorische Areale und neuronale Aktivität bei neonatalen Mäusen zu visualisieren, die Aktivität einzelner Neuronen innerhalb der kortikalen Teilfelder mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in vivo abzubilden und teilfeldbezogene Aktivitätskorrelationen zu analysieren. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse der Patchwork-artigen synchronen Aktivität innerhalb einzelner Fässer im somatosensorischen Kortex. Wir diskutieren auch verschiedene mögliche Anwendungen und einige Einschränkungen dieses Protokolls.

Introduction

Die Großhirnrinde umfasst mehrere sensorische Areale mit unterschiedlichen Funktionen. Die Areale erhalten Eingaben, die von den entsprechenden Sinnesorganen ausgehen und meist über das Rückenmark oder den Hirnstamm weitergeleitet und über den Thalamus 1,2 weitergeleitet werden. Bemerkenswert ist, dass Neuronen in jedem primären sensorischen Bereich während der frühen Entwicklungsstadien eine einzigartig synchronisierte Aktivität aufweisen, die ebenfalls von den Sinnesorganen oder den unteren Nervenzentren ausgeht, sich aber im Wesentlichen von den Aktivitäten unterscheidet, die im reifen Kortex beobachtet werden3.

Bei neonatalen Nagetieren beispielsweise zeigt der primäre Sehbereich (V1) eine wellenartige Aktivität, die von der Netzhaut ausgeht (Netzhautwelle) und sich über die gesamte Sehbahn ausbreitet, während die Retinotopieerhalten bleibt 4. Der primäre auditorische Bereich (A1) zeigt eine synchrone Aktivität, die in bandförmigen Subregionen organisiert ist, die den Isofrequenzbändern im reifen Gehirn entsprechen. Die Aktivität geht von den inneren Haarzellen der Cochlea aus 5,6. Der Fasskortex im primären somatosensorischen Bereich (S1) zeigt ein patchworkartiges Aktivitätsmuster, in dem Neuronen der Schicht 4 innerhalb einzelner Fässer, nämlich Neuronen, die auf einzelne Schnurrhaare reagieren, synchron aktiviert werden7. Obwohl vermutet wird, dass sie vom Trigeminusganglion ausgeht, ist die Quelle der Aktivität unbekannt7. Folglich sind die Aktivitätsmuster von Neugeborenen sowohl innerhalb jedes primären sensorischen Bereichs als auch innerhalb der intra-räumlichen Teilbereiche spezialisiert. Die gleichzeitige Visualisierung der neuronalen Aktivität und der Struktur primärer sensorischer Areale kann eine Untersuchung des Beitrags dieser Aktivitätsmuster zur Entwicklung sensorischer Systeme erleichtern.

In diesem Artikel haben wir eine Reihe von Protokollen zusammengefasst: (1) zur Visualisierung einzelner neuronaler Aktivitäten unter Verwendung der spärlichen Markierung von GCaMP und primären sensorischen Bereichen unter Verwendung von TCA-RFP-Mäusen, die rot fluoreszierendes Protein in thalamokortikalen Axonen exprimieren7, (2) zur Abbildung der Aktivität auf Einzelzellebene bei neonatalen Mäusen mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in vivound (3) die Aktivitätskorrelationen innerhalb des S1-Fasskortex zu analysieren. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen eine Patchwork-artig synchronisierte Aktivität innerhalb einzelner Fässer einer postnatalen Tag (P)6 Maus. Trotz einiger Einschränkungen kann diese Technik für die chronische Bildgebung, die Weitfeldbildgebung über mehrere sensorische Bereiche und verschiedene Manipulationsexperimente verwendet werden. Die facettenreiche Analyse der neuronalen Aktivität während der Entwicklung wird unser Verständnis der Mechanismen der Bildung von Schaltkreisen im Gehirn bereichern.

Protocol

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für Tierversuche der Universität Kumamoto und des Nationalen Instituts für Genetik durchgeführt und von den Tierversuchskommissionen genehmigt. 1. In-utero-Elektroporation (IUE) Verpaaren Sie männliche TCA-RFP-Mäuse mit ICR-Hintergrund mit weiblichen Wildtyp-ICR-Mäusen. Beobachten Sie den Vaginalpfropfen, um am frühen Morgen des nächsten Tages nach Paarung…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt die repräsentativen Ergebnisse der Neuronenaktivitäten der Schicht 4 im Fasskortex eines P6-Welpen, die mit dem vorliegenden Protokoll visualisiert wurden. Zwei-Photonen-Bilder des grünen Kanals (GCaMP) und des roten Kanals (TCA-RFP) wurden zeitlich gemittelt und in Abbildung 1A dargestellt. Da die TCA-RFP-Fluoreszenz viel schwächer war als die GCaMP-Fluoreszenz, sickerte das GCaMP-Signal in den roten Kanal…

Discussion

Angesichts der Tatsache, dass die spontanen Aktivitäten aus dem Sinnesorgan oder dem unteren Nervensystem hervorgehen und über einen Weg, der dem eines reifen Nervensystems3 entspricht, zum primären sensorischen Bereich gelangen, ist es entscheidend, den primären sensorischen Bereich und die Position der abgebildeten Neuronen innerhalb des Bereichs zu definieren. In diesem Protokoll haben wir diese Anforderung erfüllt, indem wir transgene Mäuse eingesetzt ha…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (B) (22H05092, 22H05094) und für Scientific Research Grants 20K06876, AMED unter der Fördernummer 21wm0525015, der Takeda Science Foundation, der Naito Foundation, der Kato Memorial Bioscience Foundation, der Kowa Life Science Foundation, NIG-JOINT (24A2021) (an H.M.); und der Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid für wissenschaftliche Forschungsstipendien 19K06887 und 22K06446, dem Kodama Memorial Fund for Medical Research, der Uehara Memorial Foundation, der Kato Memorial Bioscience Foundation und der Takeda Science Foundation (an N.N-T). Wir danken Dr. Takuji Iwasato für die TCA-RFP-Mäuse.

Materials

20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System Corning 431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA) Nacalai 09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II) GC N/A
Agarose Sigma A9793
Aspirator tube assembly Drummond 2-040-000
CaCl2•2H2O Nacalai 06731-05
Electroporator BEX GEB14
Eye drop (Scopisol) Senju Pharmaceutical N/A
Fluorescence stereo microscope Leica M165FC
Glucose Nacalai 16806-25
Heating pad Muromachi Kikai FHC-HPS
HEPES Gibco 15630-080
Isoflurane Pfizer N/A
KCl Nacalai 28514-75
MgSO4•7H2O Wako 131-00405
Micropipette puller Narishige PC-100
Multiphoton laser Spectra-Physics Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope Zeiss LSM 7MP
NaCl Nacalai 31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe) Kimberly Clark S-200
Phosphate buffered saline (PBS) Nacalai 27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE Addgene pK175
Plasmid: TRE-nCre Addgene pK031
Precision calibrated micropipets Drummond 2-000-050
Razor blade Feather FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen) Zoetis JP N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter  Matsunami CS01078
Saline Otsuka 035175315
Sodium pentobarbital Nacalai 26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning) ThorLabs LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse N/A N/A Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond) 3M 1469SB
Titanium bar Endo Scientific Instrument N/A Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate N/A Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue Sigma T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter BEX CUY650P5
Wild-type ICR mouse Nihon SLC Slc:ICR

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Diesen Artikel zitieren
Nakagawa-Tamagawa, N., Egashira, T., Rao, M. S., Mizuno, H. In Vivo Visualization of Spontaneous Activity in Neonatal Mouse Sensory Cortex at a Single-Neuron Resolution. J. Vis. Exp. (201), e65899, doi:10.3791/65899 (2023).

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