Darin demonstrieren wir ein dreistufiges Organoidmodell (zweidimensionale [2D]-Expansion, 2D-Stimulation, dreidimensionale [3D]-Reifung), das ein vielversprechendes Werkzeug für die Sehnengrundlagenforschung und eine potenziell gerüstfreie Methode für das Tendon Tissue Engineering bietet.
Sehnen und Bänder (T/L) sind starke, hierarchisch organisierte Strukturen, die den Bewegungsapparat vereinen. Diese Gewebe haben eine streng angeordnete Kollagen-Typ-I-reiche extrazelluläre Matrix (EZM) und Zellen der T/L-Linie, die hauptsächlich in parallelen Reihen angeordnet sind. Nach einer Verletzung benötigen T/L eine lange Zeit für die Rehabilitation mit hohem Ausfallrisiko und oft unbefriedigenden Reparaturergebnissen. Trotz der jüngsten Fortschritte in der T/L-Biologieforschung besteht eine der verbleibenden Herausforderungen darin, dass es im T/L-Bereich immer noch kein standardisiertes Differenzierungsprotokoll gibt, das in der Lage ist, den T/L-Bildungsprozess in vitro zu rekapitulieren. Zum Beispiel erfordert die Knochen- und Fettdifferenzierung von mesenchymalen Vorläuferzellen nur eine standardmäßige zweidimensionale (2D) Zellkultur und die Zugabe spezifischer Stimulationsmedien. Zur Differenzierung zum Knorpel ist eine dreidimensionale (3D) Pelletkultur und eine Supplementierung von TGFß notwendig. Für die Zelldifferenzierung zur Sehne ist jedoch ein sehr geordnetes 3D-Kulturmodell erforderlich, das idealerweise auch einer dynamischen mechanischen Stimulation unterzogen werden kann. Wir haben ein 3-stufiges Organoidmodell (Expansion, Stimulation und Reifung) etabliert, um eine 3D-stäbchenartige Struktur aus einem selbstorganisierten Zellblatt zu bilden, das eine natürliche Mikroumgebung mit eigenen EZM-, autokrinen und parakrinen Faktoren liefert. Diese stäbchenartigen Organoide haben eine mehrschichtige zelluläre Architektur innerhalb einer reichhaltigen EZM und können recht einfach gehandhabt werden, um statischer mechanischer Belastung ausgesetzt zu werden. Hier haben wir das 3-Stufen-Protokoll anhand von kommerziell erhältlichen dermalen Fibroblasten demonstriert. Wir konnten zeigen, dass dieser Zelltyp robuste und EZM-reiche Organoide bildet. Das beschriebene Verfahren kann hinsichtlich der Nährmedien weiter optimiert und in Richtung dynamischer axial-mechanischer Stimulation optimiert werden. Auf die gleiche Weise können alternative Zellquellen auf ihr Potenzial getestet werden, T/L-Organoide zu bilden und so eine T/L-Differenzierung zu durchlaufen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der etablierte 3D-T/L-Organoid-Ansatz als Modell für die Sehnengrundlagenforschung und sogar für das gerüstfreie T/L-Engineering verwendet werden kann.
Sehnen und Bänder (T/L) sind wichtige Bestandteile des Bewegungsapparates, die dem Körper wesentliche Unterstützung und Stabilität bieten. Trotz ihrer entscheidenden Rolle ist dieses Bindegewebe anfällig für Degeneration und Verletzungen, was zu Schmerzen und Einschränkungen der Beweglichkeit führt1. Darüber hinaus können ihre eingeschränkte Blutversorgung und ihre langsame Heilungsfähigkeit zu chronischen Verletzungen führen, während Faktoren wie Alterung, wiederholte Bewegungen und unsachgemäße Rehabilitation das Risiko von Degeneration und Verletzungen weiter erhöhen2. Konventionelle Behandlungen wie Ruhe, Physiotherapie und chirurgische Eingriffe sind nicht in der Lage, die T/L-Struktur und -Funktion vollständig wiederherzustellen. In den letzten Jahren haben sich Forscher bemüht, die komplizierte Natur von T/L besser zu verstehen, um wirksame Behandlungen für T/L-Störungen zu finden 3,4,5. T/L zeichnen sich durch eine hierarchisch organisierte, extrazelluläre Matrix (ECM)-dominierte Struktur aus, die hauptsächlich aus Typ-I-Kollagenfasern und Proteoglykanen besteht, ein Merkmal, das in vitro nur schwer repliziert werden kann 6. Herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkulturmodelle erfassen nicht die charakteristische dreidimensionale (3D) Organisation von T/L-Geweben, was ihr translationales Potenzial einschränkt und den innovativen Fortschritt auf dem Gebiet der T/L-Regeneration behindert.
In jüngster Zeit bietet die Entwicklung von 3D-Organoidmodellen neue Möglichkeiten, die Grundlagenforschung und das gerüstfreie Tissue Engineering verschiedener Gewebetypen voranzutreiben 7,8,9,10,11,12,13. Um beispielsweise den myotendinösen Übergang zu untersuchen, entwickelten Larkin et al. 2006 3D-Skelettmuskelkonstrukte zusammen mit selbstorganisierten Sehnensegmenten, die von der Rattenschwanzsehneabgeleitet wurden 10. Darüber hinaus steuerten Schiele et al. 2013 durch die Verwendung von mikromaschinell bearbeiteten, mit Fibronektin beschichteten Wachstumskanälen die Selbstorganisation menschlicher dermaler Fibroblasten zur Bildung von Zellfasern ohne die Hilfe eines 3D-Gerüsts, ein Ansatz, der Schlüsselmerkmale der embryonalen Sehnenentwicklung erfassen kann11. In der Studie von Florida et al. 2016 wurden Knochenmark-Stromazellen zunächst in Knochen- und Bänderlinien expandiert, um dann selbstorganisierte Monolayer-Zellschichten zu erzeugen, die dann implementiert wurden, um ein mehrphasiges Knochen-Band-Knochen-Konstrukt zu schaffen, das das native vordere Kreuzband nachahmt, ein Modell, das auf ein verbessertes Verständnis der Bandregeneration abzielt12. Um die Mechanotransduktionsprozesse von Sehnen aufzuklären, verwendeten Mubyana et al. 2018 eine gerüstfreie Methodik, bei der einzelne Sehnenfasern erzeugt und einem mechanischen Belastungsprotokollunterzogen wurden 13. Organoide sind selbstorganisierte 3D-Strukturen, die die native Architektur, Mikroumgebung und Funktionalität von Geweben nachahmen. 3D-Organoidkulturen bieten ein physiologisch relevanteres Modell für die Untersuchung der Gewebe- und Organbiologie sowie der Pathophysiologie. Solche Modelle können auch verwendet werden, um die gewebespezifische Differenzierung verschiedener Stamm-/Vorläuferzelltypen zu induzieren 14,15. Daher wird die Implementierung von 3D-Organoidmodellen im Bereich der T/L-Biologie und des Tissue Engineering zu einem sehr attraktiven Ansatz 9,16. Alternative Zellquellen können für den Organoid-Assemblierung implementiert und zur tenogenen Differenzierung angeregt werden. Ein relevanter Zelltyp, der in dieser Studie zur Demonstration verwendet wurde, sind die dermalen Fibroblasten 7,17,18. Diese Zellen sind durch ein Hautbiopsieverfahren leicht zugänglich, das im Vergleich zur Knochenmarkpunktion oder Fettabsaugung weniger invasiv ist und aufgrund ihrer guten Proliferationsfähigkeit relativ schnell in großer Zahl vermehrt werden kann. Im Gegensatz dazu ist es schwieriger, spezialisiertere Zelltypen, wie z. B. T/L-residente Fibroblasten, zu isolieren und zu vermehren. Daher wurden dermale Fibroblasten auch als Ausgangspunkt für Zellreprogrammierungstechnologien hin zu induzierten pluripotenten embryonalen Stammzellen verwendet19. Wenn dermale Fibroblasten spezifischen 3D-Kulturbedingungen und Signalsignalen ausgesetzt werden, wie z. B. dem transformierenden Wachstumsfaktor-beta 3 (TGFß3), von dem berichtet wurde, dass er als Schlüsselregulator verschiedener zellulärer Prozesse, einschließlich der Bildung und Aufrechterhaltung von T/L, wirkt, kann dies ihre in vitro tenogene Differenzierung potenzieren, die zur Expression sehnenspezifischer Gene und zur Ablagerung von T/L-typischer EZMführt 20, 21. Urheberrecht
In dieser Arbeit beschreiben und demonstrieren wir ein bereits etabliertes und implementiertes 3-stufiges (2D-Expansion, 2D-Stimulation und 3D-Reifung) Organoid-Protokoll, das kommerziell erhältliche normale adulte humane dermale Fibroblasten (NHDFs) als Zellquelle verwendet und ein wertvolles Modell für die Untersuchung der In-vitro-Tenogenese darstellt7. Trotz der Tatsache, dass dieses Modell nicht äquivalent zu In-vivo-T /L-Gewebe ist, bietet es dennoch ein physiologisch relevanteres System, das zur Untersuchung zellulärer Differenzierungsmechanismen, zur Nachahmung der T/L-Pathophysiologie in vitro und zur Etablierung von T/L-personalisierten Medizin- und Wirkstoffscreening-Plattformen verwendet werden kann. Darüber hinaus können in zukünftigen Studien evaluiert werden, ob die 3D-Organoide durch weitere Optimierung für ein gerüstfreies T/L-Engineering geeignet sind und für die Entwicklung von mechanisch robusten Konstrukten nutzbar sind, die den Abmessungen und strukturellen und biophysikalischen Eigenschaften von nativen T/L-Geweben sehr ähnlich sind.
Die in dieser Studie gezeigten Ergebnisse liefern wertvolle Einblicke in die Etablierung und Charakterisierung des NHDF 3D-Organoidmodells zur Untersuchung von T/L-Geweben. Das 3-Stufen-Protokoll führte zur Bildung von 3D-stäbchenförmigen Organoiden, die typische Merkmale der T/L-Nische aufweisen. Dieses Modell wurde bereits in Kroner-Weigl et al. 20237 berichtet und hier sehr detailliert demonstriert.
Die Phasenkontrastbilder in Abbildu…
The authors have nothing to disclose.
D.D. und S.M.-D. Würdigung der BMBF-Förderung “CellWiTaL: Reproduzierbare Zellsysteme für die Wirkstoffforschung – Transferschichtfreier Laserdruck hochspezifischer Einzelzellen in dreidimensionalen zellulären Strukturen” Antrag Nr. 13N15874. D.D. und V.R.A. würdigen das EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS “Holistic training of next-generation Osteoarthritis researches” GA Nr. 101034412. Alle Autoren danken Frau Beate Geyer für ihre technische Unterstützung.
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |