Summary

Maus-Modell der linken pulmonalen hilaren Klemme der Lungenischämie-Reperfusionsverletzung

Published: April 12, 2024
doi:

Summary

Das Protokoll skizziert eine praktikable, zuverlässige und reproduzierbare Methode des linken pulmonalen hilären Klemmens, die zur Untersuchung von Ischämie-Reperfusionsschäden bei der Lunge in Mausmodellen verwendet werden kann.

Abstract

Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) während einer Lungentransplantation sind ein Hauptrisikofaktor für Komplikationen nach der Transplantation, einschließlich primärer Transplantatfunktionsstörungen, akuter und chronischer Abstoßung und Mortalität. Die Bemühungen, die Grundlagen der IRI zu untersuchen, führten zur Entwicklung eines zuverlässigen und reproduzierbaren Mausmodells für das Hilar-Clamping der linken Lunge. Bei diesem Modell handelt es sich um einen chirurgischen Eingriff, der an einer anästhesierten und intubierten Maus durchgeführt wird. Es wird eine linke Thorakotomie durchgeführt, gefolgt von einer sorgfältigen Lungenmobilisation und Dissektion des linken Lungenhilus. Bei der hilären Klemme handelt es sich um eine reversible Nahtligatur des Lungenhilums mit einem Slipknot, der den arteriellen Zufluss, den venösen Abfluss und den Luftstrom durch den linken Hauptstammbronchus stoppt. Die Reperfusion wird durch vorsichtiges Entfernen der Naht eingeleitet. Unser Labor verwendet 30 min Ischämie und 1 h Reperfusion für das Versuchsmodell in den aktuellen Untersuchungen. Diese Zeiträume können jedoch je nach experimenteller Fragestellung modifiziert werden. Unmittelbar vor der Tötung kann arterielles Blutgas aus dem linken Ventrikel nach einer 4-minütigen Periode der rechten hilaren Klemmung entnommen werden, um sicherzustellen, dass die erhaltenen PaO2-Werte nur der verletzten linken Lunge zugeordnet werden. Wir beschreiben auch eine Methode zur Messung der Zellextravasation mit Durchflusszytometrie, die die intravenöse Injektion eines Fluorochrom-markierten Antikörpers beinhaltet, der für die zu untersuchende(n) Zelle(n) vor der Tötung spezifisch ist. Die linke Lunge kann dann für die Durchflusszytometrie, gefroren oder fixiert, die in Paraffin eingebettete Immunhistochemie und die quantitative Polymerase-Kettenreaktion entnommen werden. Diese hilare Clamp-Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die der IRI zugrunde liegen. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine verminderte Sauerstoffversorgung der linken Lunge und histologische Hinweise auf eine Lungenschädigung nach hilärem Klemmen. Diese Technik kann von Personal mit und ohne mikrochirurgische Erfahrung leicht erlernt und reproduziert werden, was zu zuverlässigen und konsistenten Ergebnissen führt und als weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der Lungen-IRI dient.

Introduction

Die IRI während einer Organtransplantation ist ein Hauptrisikofaktor für eine primäre Transplantatdysfunktion und spätere Episoden der Transplantatabstoßung 1,2. Während der Transplantation ist die warme Ischämiezeit definiert als die Zeitspanne von der Kreuzklemmung der Spenderaorta bis zum Beginn der kalten Perfusion und von der Organentnahme aus dem Eis bis zur Organimplantation. Die Kältelagerzeit ist definiert als der Zeitraum vom Beginn der Kaltperfusion bis zur Entnahme des Organs aus dem Eis3. Die warme Ischämie ist für die spätere Organfunktion schädlicher als die kalte Ischämie 4,5,6, und ihre zugrunde liegenden Mechanismen rechtfertigen weitere Studien in präklinischen Modellen. Darüber hinaus ist eine Organtransplantation aus einer Spende nach Herztod (DCD) mit längeren warmen ischämischen Zeiten verbunden als eine herkömmliche Spende nach Hirntod (DBD)7. Während der Einsatz von DCD-Spendern den Spenderpool erweitern und die Lungenauslastung erhöhen kann, sind weitere präklinische Studien erforderlich, um die Auswirkungen der warmen Ischämie auf die Lungenfunktion nach der Transplantation zu bewerten. Im Folgenden beschreiben wir ein Modell der warmen IRI bei Mäusen über die linke pulmonale Hilarklemme.

Mehrere Tiermodelle für die hiläre Lungenklemmung wurden in den letzten Jahren entwickelt und angepasst und können die Verwendung einer atraumatischen mikrovaskulären Klemme 8,9,10,11,12,13, eines Rumel-Tourniquets14,15 oder einer Nahtligatur16 umfassen wie die hilare Klemme. Die Krux an der hilären Klemme ist, dass sie reversibel sein muss und die hilären Strukturen nur minimal oder gar nicht schädigt, damit eine Reperfusion erreicht werden kann. Hier beschreiben wir unsere hilare Clamp-Technik bei Mäusen, bei der es sich um eine reversible Nahtligatur des linken Lungenhilums mit einem Slipknot handelt. Bei dieser Methode werden der pulmonalarterielle Zufluss, der venöse Abfluss und der Luftstrom in und aus dem Hauptstammbronchus verschlossen. Der Hauptvorteil eines Slipknot über einer Gefäßklemme, einem Clip oder einem Tourniquet besteht darin, dass der Brustkorb bei längerer Ischämie geschlossen werden kann, wodurch unmerkliche Flüssigkeit und Wärmeverluste in der Maus minimiert werden. Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, um zuverlässige arterielle Blutgasmessungen (ABG) zu erhalten und die Zellextravasation nach hilärem Clamping zu messen.

Diese hilare Clamp-Technik nimmt einen wichtigen Platz in der breiteren Erforschung der Lungentransplantation ein. Im Vergleich zu Kleintiermodellen der orthotopen Lungentransplantation kann die Hilar-Clamp-Technik die Auswirkungen der IRI ohne Zusatz eines chirurgischen Anastomosentraumas oder einer Allogenität isolieren17. Darüber hinaus kann die Hilar-Clamp-Technik einfacher und schneller gemeistert werden als die Lungentransplantation bei Mäusen. Tatsächlich wurden in den letzten zehn Jahren mit hilären Clamp-Techniken mehrere wichtige Mechanismen in der Pathogenese der IRI identifiziert, wie z. B. TLR4, NADPH-Oxidase und Adenosin-A2A-Rezeptor 14,18,19,20. Im folgenden Protokoll stellen wir eine zuverlässige, lehrbare und reproduzierbare Methode des hilären Klemmens als Werkzeug zur Untersuchung der Lungen-IRI vor.

Protocol

Alle Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Washington University School of Medicine genehmigt. Die Tiere erhielten eine humane Pflege in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, 8. Auflage21 , der von der National Academy of Sciences erstellt und von den National Institutes of Health veröffentlicht wurde, und den von der National Society for Medical Research formulierten Grundsätzen für die Pflege von Labortier…

Representative Results

Nach linker hilärer Klemmung beträgt der Partialdruck der Oxygenierung im arteriellen Blut (PaO2), der der linken Lunge zugeschrieben wird, ~100 mmHg, signifikant niedriger im Vergleich zu den ~500 mmHg nach Scheinthorakotomie (Abbildung 7A, n=6-7). Bemerkenswert ist, dass Schein-Thorakotomien bei B6-Mäusen durchgeführt wurden, wobei die ABG-Messung nach 4 Minuten nach rechtsem Hilar-Clamping durchgeführt wurde, was den Werten entspricht, die nur der linken Lunge zugeschriebe…

Discussion

Wir beschreiben eine hilare Clamp-Technik, bei der ein Slipknot am linken Hilum angelegt wird, der die Lungenarterie und die Venen und den Bronchus verschließt, um eine warme Ischämie mit anschließender Reperfusion zu induzieren. Nach dem hilären Klemmen kann die linke Lunge für eine Vielzahl von experimentellen Techniken wie Histologie, Durchflusszytometrie, Massen- oder Einzelzellsequenzierung und quantitative Polymerase-Kettenreaktion entnommen werden. Darüber hinaus können Blut und Milz verwendet werden, um sy…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit erhielt keine spezifische Unterstützung von einer Förderagentur im öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Sektor.

Materials

Medications
10% povidone-iodine solution Aplicare NDC 52380-0126-2 For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL Fidelis Animal Health NDC 86084-100-30 For pain control
Carprofen Cronus Pharma NDC 69043-027-18 For pain control
Heparin 1000 units/mL Sagent NDC 25021-404-01 For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5% Sigma Aldrich 26675-46-7 For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL Vedco NDC 50989-996-06 For anesthesia
Puralube Vet eye ointment Medi-Vet.com 11897 To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL Akorn NDC 59399-110-20 For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen McKesson 231 To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp Fine Science Tools 13009-12 For surgical procedure
Fine curved forceps Fine Science Tools 11274-20 For surgical procedure
Fine scissors Fine Science Tools 15040-11 For surgical procedure
Intubation clamp set-up Fine Science Tools 18374-44, 18144-30 For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A. 
Magnetic rib retractors Fine Science Tools 18200-01, 18200-10 For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm Edmund Optics 02-532 To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper Oster 078400-020-001 To clip hair
Scissors Fine Science Tools 14370-22 For surgical procedure
Small animal heating pad K&H Pet Products Thermo-Peep Heated Pad To maintain normothermia
Small animal ventilator Harvard Apparatus 55-0000 For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter) Amazon.com https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1 For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer Nova Biomedical https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX–R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB  
For retraction of thoracotomy
Straight clamp Fine Science Tools 13008-12 For surgical procedure
Straight forceps Fine Science Tools 91113-10 For surgical procedure
Surgical microscope Wild Heerbrugg no longer produced For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle McKesson 942665 For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe McKesson 16-SNT1C2705 For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter Terumo SROX2025CA For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape Durapore 3M ID 7100057168 To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle McKesson 102-SN310C31516P For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle McKesson S697GX For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie Surgical Specialties Look SP102 To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators Solon 56225 To manipulate lung and for blunt dissection

Referenzen

  1. Bharat, A., et al. Immunological link between primary graft dysfunction and chronic lung allograft rejection. Ann Thorac Surg. 86 (1), 189-195 (2008).
  2. Daud, S. A. Impact of immediate primary lung allograft dysfunction on bronchiolitis obliterans syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 175 (5), 507-513 (2007).
  3. Halazun, K. J., Al-Mukhtar, A., Aldouri, A., Willis, S., Ahmad, N. Warm ischemia in transplantation: search for a consensus definition. Transplant Proc. 39 (5), 1329-1331 (2007).
  4. Warnecke, G., et al. Warm or cold ischemia in animal models of lung ischemia-reperfusion injury: is there a difference . Thorac Cardiovasc Surg. 52 (3), 174-179 (2004).
  5. Hasenauer, A., et al. Effects of cold or warm ischemia and ex-vivo lung perfusion on the release of damage associated molecular patterns and inflammatory cytokines in experimental lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (9), 905-916 (2021).
  6. Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  7. Santos, P., Teixeira, P. J. Z., Moraes Neto, D. M., Cypel, M. Donation after circulatory death and lung transplantation. J Bras Pneumol. 48 (2), e20210369 (2022).
  8. Moskowitzova, K., et al. Mitochondrial transplantation enhances murine lung viability and recovery after ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (1), L78-L88 (2020).
  9. Nakata, K., et al. Functional blockage of S100A8/A9 ameliorates ischemia-reperfusion injury in the lung. Bioengineering (Basel). 9 (11), 673 (2022).
  10. Nakata, K., et al. Protective effects of anti-HMGB1 monoclonal antibody on lung ischemia reperfusion injury in mice. Biochem Biophys Res Commun. 573, 164-170 (2021).
  11. Wang, Q., Li, Y., Wu, C., Wang, T., Wu, M. Aquaporin-1 inhibition exacerbates ischemia-reperfusion-induced lung injury in mouse. Am J Med Sci. 365 (1), 84-92 (2023).
  12. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. J Surg Res. 194 (2), 659-666 (2015).
  13. Zhang, X., et al. Mitogen-activated protein kinases regulate HO-1 gene transcription after ischemia-reperfusion lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (4), L815-L829 (2002).
  14. Sharma, A. K., et al. Adenosine A2A receptor activation on CD4+ T lymphocytes and neutrophils attenuates lung ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 139 (2), 474-482 (2010).
  15. Yang, Z., Sharma, A. K., Linden, J., Kron, I. L., Laubach, V. E. CD4+ T lymphocytes mediate acute pulmonary ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 137 (3), 695-702 (2009).
  16. Sayah, D. M., et al. Neutrophil extracellular traps are pathogenic in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Respir Crit Care Med. 191 (4), 455-463 (2015).
  17. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 6 (7), 1672-1679 (2007).
  18. Hsiao, H. M. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  19. Sharma, A. K., Mulloy, D. P., Le, L. T., Laubach, V. E. NADPH oxidase mediates synergistic effects of IL-17 and TNF-alpha on CXCL1 expression by epithelial cells after lung ischemia-reperfusion. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (1), L69-L79 (2014).
  20. Zanotti, G., et al. Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (297), L52-L63 (2009).
  21. National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
  22. Saito, M., et al. Pirfenidone alleviates lung ischemia-reperfusion injury in a rat model. J Thorac Cardiovasc Surg. 158 (1), 289-296 (2019).
  23. Tanaka, S., et al. Protective effects of Imatinib on ischemia/reperfusion injury in rat lung. Ann Thorac Surg. 102 (5), 1717-1724 (2016).
  24. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  25. Koletsis, E., et al. In situ cooling in a lung hilar clamping model of ischemia-reperfusion injury. Exp Biol Med (Maywood). 231 (8), 1410-1420 (2006).
  26. Hermsen, R., et al. Genomic landscape of rat strain and substrain variation. BMC Genomics. 16 (1), 357 (2015).
  27. Beck, J. A., et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 24 (1), 23-25 (2000).
  28. Liao, W. I., et al. A mouse model of orotracheal intubation and ventilated lung ischemia reperfusion surgery. J Vis Exp. (187), 64383 (2022).
  29. Murata, T., Nakazawa, H., Mori, I., Ohta, Y., Yamabayashi, H. Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis. Am Rev Respir Dis. 146 (4), 1048-1053 (1992).
  30. Ukita, R., et al. A large animal model for pulmonary hypertension and right ventricular failure: Left pulmonary artery ligation and progressive main pulmonary artery banding in sheep. J Vis Exp. (173), 62694 (2021).
  31. Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. J Vis Exp. (147), 59431 (2019).
  32. Welbourn, C. R., et al. Pathophysiology of ischaemia reperfusion injury: central role of the neutrophil. Br J Surg. 78 (6), 651-655 (1991).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Bai, Y. Z., Yokoyama, Y., Li, W., Terada, Y., Kreisel, D., Nava, R. G. Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (206), e66232, doi:10.3791/66232 (2024).

View Video