Maus-Modell der linken pulmonalen hilaren Klemme der Lungenischämie-Reperfusionsverletzung
Summary
Das Protokoll skizziert eine praktikable, zuverlässige und reproduzierbare Methode des linken pulmonalen hilären Klemmens, die zur Untersuchung von Ischämie-Reperfusionsschäden bei der Lunge in Mausmodellen verwendet werden kann.
Abstract
Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) während einer Lungentransplantation sind ein Hauptrisikofaktor für Komplikationen nach der Transplantation, einschließlich primärer Transplantatfunktionsstörungen, akuter und chronischer Abstoßung und Mortalität. Die Bemühungen, die Grundlagen der IRI zu untersuchen, führten zur Entwicklung eines zuverlässigen und reproduzierbaren Mausmodells für das Hilar-Clamping der linken Lunge. Bei diesem Modell handelt es sich um einen chirurgischen Eingriff, der an einer anästhesierten und intubierten Maus durchgeführt wird. Es wird eine linke Thorakotomie durchgeführt, gefolgt von einer sorgfältigen Lungenmobilisation und Dissektion des linken Lungenhilus. Bei der hilären Klemme handelt es sich um eine reversible Nahtligatur des Lungenhilums mit einem Slipknot, der den arteriellen Zufluss, den venösen Abfluss und den Luftstrom durch den linken Hauptstammbronchus stoppt. Die Reperfusion wird durch vorsichtiges Entfernen der Naht eingeleitet. Unser Labor verwendet 30 min Ischämie und 1 h Reperfusion für das Versuchsmodell in den aktuellen Untersuchungen. Diese Zeiträume können jedoch je nach experimenteller Fragestellung modifiziert werden. Unmittelbar vor der Tötung kann arterielles Blutgas aus dem linken Ventrikel nach einer 4-minütigen Periode der rechten hilaren Klemmung entnommen werden, um sicherzustellen, dass die erhaltenen PaO2-Werte nur der verletzten linken Lunge zugeordnet werden. Wir beschreiben auch eine Methode zur Messung der Zellextravasation mit Durchflusszytometrie, die die intravenöse Injektion eines Fluorochrom-markierten Antikörpers beinhaltet, der für die zu untersuchende(n) Zelle(n) vor der Tötung spezifisch ist. Die linke Lunge kann dann für die Durchflusszytometrie, gefroren oder fixiert, die in Paraffin eingebettete Immunhistochemie und die quantitative Polymerase-Kettenreaktion entnommen werden. Diese hilare Clamp-Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die der IRI zugrunde liegen. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine verminderte Sauerstoffversorgung der linken Lunge und histologische Hinweise auf eine Lungenschädigung nach hilärem Klemmen. Diese Technik kann von Personal mit und ohne mikrochirurgische Erfahrung leicht erlernt und reproduziert werden, was zu zuverlässigen und konsistenten Ergebnissen führt und als weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der Lungen-IRI dient.
Introduction
Die IRI während einer Organtransplantation ist ein Hauptrisikofaktor für eine primäre Transplantatdysfunktion und spätere Episoden der Transplantatabstoßung 1,2. Während der Transplantation ist die warme Ischämiezeit definiert als die Zeitspanne von der Kreuzklemmung der Spenderaorta bis zum Beginn der kalten Perfusion und von der Organentnahme aus dem Eis bis zur Organimplantation. Die Kältelagerzeit ist definiert als der Zeitraum vom Beginn der Kaltperfusion bis zur Entnahme des Organs aus dem Eis3. Die warme Ischämie ist für die spätere Organfunktion schädlicher als die kalte Ischämie 4,5,6, und ihre zugrunde liegenden Mechanismen rechtfertigen weitere Studien in präklinischen Modellen. Darüber hinaus ist eine Organtransplantation aus einer Spende nach Herztod (DCD) mit längeren warmen ischämischen Zeiten verbunden als eine herkömmliche Spende nach Hirntod (DBD)7. Während der Einsatz von DCD-Spendern den Spenderpool erweitern und die Lungenauslastung erhöhen kann, sind weitere präklinische Studien erforderlich, um die Auswirkungen der warmen Ischämie auf die Lungenfunktion nach der Transplantation zu bewerten. Im Folgenden beschreiben wir ein Modell der warmen IRI bei Mäusen über die linke pulmonale Hilarklemme.
Mehrere Tiermodelle für die hiläre Lungenklemmung wurden in den letzten Jahren entwickelt und angepasst und können die Verwendung einer atraumatischen mikrovaskulären Klemme 8,9,10,11,12,13, eines Rumel-Tourniquets14,15 oder einer Nahtligatur16 umfassen wie die hilare Klemme. Die Krux an der hilären Klemme ist, dass sie reversibel sein muss und die hilären Strukturen nur minimal oder gar nicht schädigt, damit eine Reperfusion erreicht werden kann. Hier beschreiben wir unsere hilare Clamp-Technik bei Mäusen, bei der es sich um eine reversible Nahtligatur des linken Lungenhilums mit einem Slipknot handelt. Bei dieser Methode werden der pulmonalarterielle Zufluss, der venöse Abfluss und der Luftstrom in und aus dem Hauptstammbronchus verschlossen. Der Hauptvorteil eines Slipknot über einer Gefäßklemme, einem Clip oder einem Tourniquet besteht darin, dass der Brustkorb bei längerer Ischämie geschlossen werden kann, wodurch unmerkliche Flüssigkeit und Wärmeverluste in der Maus minimiert werden. Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, um zuverlässige arterielle Blutgasmessungen (ABG) zu erhalten und die Zellextravasation nach hilärem Clamping zu messen.
Diese hilare Clamp-Technik nimmt einen wichtigen Platz in der breiteren Erforschung der Lungentransplantation ein. Im Vergleich zu Kleintiermodellen der orthotopen Lungentransplantation kann die Hilar-Clamp-Technik die Auswirkungen der IRI ohne Zusatz eines chirurgischen Anastomosentraumas oder einer Allogenität isolieren17. Darüber hinaus kann die Hilar-Clamp-Technik einfacher und schneller gemeistert werden als die Lungentransplantation bei Mäusen. Tatsächlich wurden in den letzten zehn Jahren mit hilären Clamp-Techniken mehrere wichtige Mechanismen in der Pathogenese der IRI identifiziert, wie z. B. TLR4, NADPH-Oxidase und Adenosin-A2A-Rezeptor 14,18,19,20. Im folgenden Protokoll stellen wir eine zuverlässige, lehrbare und reproduzierbare Methode des hilären Klemmens als Werkzeug zur Untersuchung der Lungen-IRI vor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine hilare Clamp-Technik, bei der ein Slipknot am linken Hilum angelegt wird, der die Lungenarterie und die Venen und den Bronchus verschließt, um eine warme Ischämie mit anschließender Reperfusion zu induzieren. Nach dem hilären Klemmen kann die linke Lunge für eine Vielzahl von experimentellen Techniken wie Histologie, Durchflusszytometrie, Massen- oder Einzelzellsequenzierung und quantitative Polymerase-Kettenreaktion entnommen werden. Darüber hinaus können Blut und Milz verwendet werden, um sy…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit erhielt keine spezifische Unterstützung von einer Förderagentur im öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Sektor.
Materials
| Medications | |||
| 10% povidone-iodine solution | Aplicare | NDC 52380-0126-2 | For disinfectant |
| Buprenorphine 1.3 mg/mL | Fidelis Animal Health | NDC 86084-100-30 | For pain control |
| Carprofen | Cronus Pharma | NDC 69043-027-18 | For pain control |
| Heparin 1000 units/mL | Sagent | NDC 25021-404-01 | For obtaining arterial blood |
| Isoflurane 1%-1.5% | Sigma Aldrich | 26675-46-7 | For anesthesia |
| Ketamine hydrochloride 100 mg/mL | Vedco | NDC 50989-996-06 | For anesthesia |
| Puralube Vet eye ointment | Medi-Vet.com | 11897 | To prevent eye dessiccation |
| Xylazine 20 mg/mL | Akorn | NDC 59399-110-20 | For pain control |
| Tools and Instruments | |||
| Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen | McKesson | 231 | To coagulate blood vessels |
| Curved mosquito clamp | Fine Science Tools | 13009-12 | For surgical procedure |
| Fine curved forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | For surgical procedure |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 15040-11 | For surgical procedure |
| Intubation clamp set-up | Fine Science Tools | 18374-44, 18144-30 | For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A. |
| Magnetic rib retractors | Fine Science Tools | 18200-01, 18200-10 | For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below. |
| Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm | Edmund Optics | 02-532 | To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly. |
| Power Pro Ultra clipper | Oster | 078400-020-001 | To clip hair |
| Scissors | Fine Science Tools | 14370-22 | For surgical procedure |
| Small animal heating pad | K&H Pet Products | Thermo-Peep Heated Pad | To maintain normothermia |
| Small animal ventilator | Harvard Apparatus | 55-0000 | For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%) |
| Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter) | Amazon.com | https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1 | For retraction of thoracotomy |
| Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer | Nova Biomedical | https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX–R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB |
For retraction of thoracotomy |
| Straight clamp | Fine Science Tools | 13008-12 | For surgical procedure |
| Straight forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | For surgical procedure |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | no longer produced | For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes |
| Supplies | |||
| ½ cc syringe with ½ inch 29G needle | McKesson | 942665 | For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally |
| ½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe | McKesson | 16-SNT1C2705 | For aspiration of arterial blood from left ventricle |
| 1-inch 20G IV catheter | Terumo | SROX2025CA | For endotracheal tube (ETT) |
| 1-inch silk tape | Durapore | 3M ID 7100057168 | To tape ETT to nose and to secure limbs |
| 3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle | McKesson | 102-SN310C31516P | For antibody injection into the inferior vena cava |
| 6-0 monofilament suture on a P-10 needle | McKesson | S697GX | For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin |
| 6-0 silk tie | Surgical Specialties Look | SP102 | To make slipknot for hilar clamp |
| Pointed cotton-tipped applicators | Solon | 56225 | To manipulate lung and for blunt dissection |
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