Summary

Transfektion eines molekularen Klons von Naegleria gruberi rDNA in N. gruberi Trophozoiten

Published: June 21, 2024
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Transfektion von Naegleria gruberi Trophozoiten mit einem Konstrukt, das während der gesamten passagierenden Trophozoiten in vitro sowie durch Enzystierung und Exzystierung erhalten bleibt.

Abstract

Alle ribosomalen Gene von Naegleria trophozoiten werden in einem geschlossenen zirkulären extrachromosomalen ribosomalen DNA (rDNA) enthaltenden Element (CERE) aufrechterhalten. Während wenig über CERE bekannt ist, zeigt eine vollständige Genomsequenzanalyse von drei Naegleria-Spezies eindeutig, dass es im Kerngenom keine rDNA-Cistronen gibt. Darüber hinaus wurde ein einzelner DNA-Replikationsursprung im N. gruberi CERE kartiert, was die Hypothese unterstützt, dass CERE unabhängig vom Kerngenom repliziert. Diese CERE-Eigenschaft deutet darauf hin, dass es möglich sein könnte, manipuliertes CERE zu verwenden, um fremde Proteine in Naegleria trophozoites einzuführen. Als ersten Schritt zur Erforschung der Verwendung eines CERE als Vektor in Naegleria haben wir ein Protokoll zur Transfektion von N. gruberi mit einem molekularen Klon von N. gruberi CERE entwickelt, der in pGEM7zf+ (pGRUB) kloniert wurde. Nach der Transfektion konnte pGRUB in N. gruberi Trophozoiten für mindestens sieben Passagen sowie durch Enzystierung und Exzystierung leicht nachgewiesen werden. Als Kontrolle wurden Trophozoiten mit dem Rückgratvektor pGEM7zf+ ohne die N. gruberi-Sequenzen (pGEM) transfiziert. pGEM wurde nach der ersten Passage nach der Transfektion in N. gruberi nicht nachgewiesen, was auf seine Unfähigkeit zur Replikation in einem eukaryotischen Organismus hinweist. Diese Studien beschreiben ein Transfektionsprotokoll für Naegleria trophozoiten und zeigen, dass die bakterielle Plasmidsequenz in pGRUB die erfolgreiche Transfektion und Replikation des transfizierten CERE-Klons nicht hemmt. Darüber hinaus wird dieses Transfektionsprotokoll entscheidend für das Verständnis der minimalen Sequenz des CERE sein, die seine Replikation in Trophozoiten antreibt, sowie für die Identifizierung regulatorischer Regionen in der nicht-ribosomalen Sequenz (NRS).

Introduction

Die Gattung Naegleria umfasst über 45 Arten, obwohl es unwahrscheinlich ist, dass alle Vertreter der Art identifiziert wurden1. Naegleria kann in verschiedenen Formen existieren: als Trophozoiten (Amöben), als Flagellaten oder, wenn die Ressourcen stark begrenzt sind, als Zysten 1,2,3,4. Die Gattung Naegleria ist bekannt für ihre eine besonders gefährliche Art, Naegleria fowleri, bekannt als “die gehirnfressende Amöbe” (besprochen in 1,2,3,4,5,6,7), die die Ursache der fast überall tödlichen primären Amöben-Meningoenzephalitis ist.

Naegleria kodieren ihre rDNA auf dem CERE, das sich im Nukleolus befindet. Die vollständige Sequenzierung des Genoms von drei Naegleria-Spezies bestätigt das Fehlen von rDNA im Kerngenom 8,9,10,11. Basierend auf den begrenzten CERE-Sequenzen in voller Länge reicht die CERE-Sequenz von etwa 10 kbp bis 18 kbp Länge. CERE jeder Naegleria-Spezies tragen jeweils ein einzelnes rDNA-Cistron (mit der ribosomalen 5,8-, 18- und 28S-DNA) auf jeweils etwa 4.000 CERE pro Zelle 12,13,14. Abgesehen von rDNA verfügt jede CERE über eine große Nicht-rDNA-Sequenz (NRS). Die CERE-Größen variieren zwischen den Arten; Die Unterschiede sind hauptsächlich auf die unterschiedliche Länge der NRS zurückzuführen, da die rDNA-Sequenzen in der Gattung 1,15,16,17,18,19,20 hoch konserviert sind. Die Kartierung eines einzigen Ursprungs der DNA-Replikation innerhalb des N. gruberi CERE NRS21 unterstützt die Hypothese, dass Naegleria CERE unabhängig vom Kerngenom repliziert.

N. gruberi ist eine nicht-pathogene Amöbe, die häufig zur Untersuchung der Biologie von Naegleria verwendet wird. Wir haben eine Methodik zur Transformation von N. gruberi Trophozoiten mit einem CERE-Klon der gleichen Spezies entwickelt, um die Hypothese zu testen, dass Naegleria amoebae CERE innerhalb der Trophozoiten tolerieren und unabhängig voneinander replizieren. Dies wurde erreicht, indem N. gruberi mit einem Volllängenklon von N. gruberi CERE in Trophozoiten umgewandelt und das Schicksal des Spender-CERE-Klons mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verfolgt wurde. Einen allgemeinen Überblick über das Protokoll gibt Abbildung 1. Die hierin präsentierten Daten zeigen, dass der Spenderklon durch mindestens sieben Passagen in der Gewebekultur nachgewiesen werden kann, sowie durch Enzystierung und Exzystierung aufrechterhalten werden kann. Diese Studien bilden die Grundlage für ein Mittel, um zu analysieren, wie sich CERE repliziert, und um seine Verwendung als Vektor zur Transfektion von Naeglerien zu untersuchen.

Protocol

Die Einzelheiten zu den Spezies, Reagenzien und Geräten, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Sequenz des pGRUB-Konstrukts mit 17.004 Basenpaaren ist in der Zusatzdatei 1 enthalten. 1. Trophozoiten züchten Gefrorene Trophozoiten von N. gruberi bei 37 °C 3 Min. auftauen. Trophozoiten werden in T25-Kolben in modifiziertem Pepton/Hefeextrakt/Nukleinsäure/Folsäure/Hä…

Representative Results

Die PCR von Trophozoiten, die mit pGRUB transfiziert wurden, zeigt, dass das transfizierte CERE durch mindestens sieben Passagen der Trophozoiten sowie durch Enzystung und Exzystment nachgewiesen wird (Abbildung 4). Die in der PCR verwendeten Primer glühen sowohl an den pGEM-Vektor als auch an die CERE-Sequenz, wodurch sichergestellt wird, dass die PCR kein natives CERE nachweist. Die PCR nach Transfektion von pGEM in Trophozoiten zeigte, dass pGEM negativ war (Abbildun…

Discussion

Das hierin skizzierte Protokoll ist sehr einfach, obwohl jedes Konstrukt wahrscheinlich einen gewissen Grad an Optimierung erfordert, insbesondere des DNA-Transfektionsreagenz-Verhältnisses, abhängig von der Art des Konstrukts und der verwendeten Naegleria-Spezies . Wir haben nur ein kommerziell erhältliches Transfektionsreagenz mit diesem Protokoll getestet, aber es ist wahrscheinlich, dass mehrere andere wirksam sein können. Da ein vollständiger Klon des CERE verwendet wird, der einen funktionellen Urspru…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studien wurden teilweise durch ein Stipendium des George F. Haddix Fund der Creighton University (KMD) finanziert. Abbildung 1 wird in biorender.com generiert, und Abbildung 3 wird in benchling.com generiert.

Materials

Agarose Bio Rad 161-3102
Ammonium Acetate Sigma Aldrich A-7330
Calcium Chloride Sigma Aldrich C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75 Thermo Scientific 130190
Culture Plate, 6-well Corning 3506
DNAse Sigma Aldrich D-4527
EDTA, 0.5 M Affymetrix 15694
Electropheresis Gel Apparatus Amersham Biosciences 80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL Fisher Scientific 05-408-138
Ethanol, 100% Decon Laboratories 2716
Ethidium Bromide Sigma Aldrich E-8751
Fetal Bovine Serum Gibco 26140
Folic Acid Sigma Aldrich F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder Thermo Scientific SM1331
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix Promega M7122
Heating Block Thermo Scientific 88871001
Hemacytometer Hausser Scientific 1483
Hemin Sigma Aldrich 51280
Iron Chloride Sigma Aldrich 372870-256
Ligase NEB M2200S
Magneisum Chloride Fisher Scientific M33-500
Microfuge Thermo Scientific MySpin 12
Microscope Nikon TMS
N. gruberi ATCC 30224
Nucleic Acid Chem Impex Int’l #01625
Peptone Gibco 211677
pGEM Promega P2251
Potassium Phosphate Sigma Aldrich P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit Bio Rad 1645052
Sodium Chloride MCB Reagents SX0420
Sodium Phosphate, dibasic Sigma Aldrich S2554
Tabletop Centrifuge eppendorf 5415R
Tris, base Sigma Aldrich T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4% Gibco 15250-061
ViaFect Reagent Promega E4981
Weigh Scale Denver Instruments APX-60
Yeast Extract Gibco 212750

Referenzen

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Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Mullican, J. C., Drescher, K. M. Transfection of a Molecular Clone of Naegleria gruberi rDNA into N. gruberi Trophozoites. J. Vis. Exp. (208), e66726, doi:10.3791/66726 (2024).

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