Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Transfektion von Naegleria gruberi Trophozoiten mit einem Konstrukt, das während der gesamten passagierenden Trophozoiten in vitro sowie durch Enzystierung und Exzystierung erhalten bleibt.
Alle ribosomalen Gene von Naegleria trophozoiten werden in einem geschlossenen zirkulären extrachromosomalen ribosomalen DNA (rDNA) enthaltenden Element (CERE) aufrechterhalten. Während wenig über CERE bekannt ist, zeigt eine vollständige Genomsequenzanalyse von drei Naegleria-Spezies eindeutig, dass es im Kerngenom keine rDNA-Cistronen gibt. Darüber hinaus wurde ein einzelner DNA-Replikationsursprung im N. gruberi CERE kartiert, was die Hypothese unterstützt, dass CERE unabhängig vom Kerngenom repliziert. Diese CERE-Eigenschaft deutet darauf hin, dass es möglich sein könnte, manipuliertes CERE zu verwenden, um fremde Proteine in Naegleria trophozoites einzuführen. Als ersten Schritt zur Erforschung der Verwendung eines CERE als Vektor in Naegleria haben wir ein Protokoll zur Transfektion von N. gruberi mit einem molekularen Klon von N. gruberi CERE entwickelt, der in pGEM7zf+ (pGRUB) kloniert wurde. Nach der Transfektion konnte pGRUB in N. gruberi Trophozoiten für mindestens sieben Passagen sowie durch Enzystierung und Exzystierung leicht nachgewiesen werden. Als Kontrolle wurden Trophozoiten mit dem Rückgratvektor pGEM7zf+ ohne die N. gruberi-Sequenzen (pGEM) transfiziert. pGEM wurde nach der ersten Passage nach der Transfektion in N. gruberi nicht nachgewiesen, was auf seine Unfähigkeit zur Replikation in einem eukaryotischen Organismus hinweist. Diese Studien beschreiben ein Transfektionsprotokoll für Naegleria trophozoiten und zeigen, dass die bakterielle Plasmidsequenz in pGRUB die erfolgreiche Transfektion und Replikation des transfizierten CERE-Klons nicht hemmt. Darüber hinaus wird dieses Transfektionsprotokoll entscheidend für das Verständnis der minimalen Sequenz des CERE sein, die seine Replikation in Trophozoiten antreibt, sowie für die Identifizierung regulatorischer Regionen in der nicht-ribosomalen Sequenz (NRS).
Die Gattung Naegleria umfasst über 45 Arten, obwohl es unwahrscheinlich ist, dass alle Vertreter der Art identifiziert wurden1. Naegleria kann in verschiedenen Formen existieren: als Trophozoiten (Amöben), als Flagellaten oder, wenn die Ressourcen stark begrenzt sind, als Zysten 1,2,3,4. Die Gattung Naegleria ist bekannt für ihre eine besonders gefährliche Art, Naegleria fowleri, bekannt als “die gehirnfressende Amöbe” (besprochen in 1,2,3,4,5,6,7), die die Ursache der fast überall tödlichen primären Amöben-Meningoenzephalitis ist.
Naegleria kodieren ihre rDNA auf dem CERE, das sich im Nukleolus befindet. Die vollständige Sequenzierung des Genoms von drei Naegleria-Spezies bestätigt das Fehlen von rDNA im Kerngenom 8,9,10,11. Basierend auf den begrenzten CERE-Sequenzen in voller Länge reicht die CERE-Sequenz von etwa 10 kbp bis 18 kbp Länge. CERE jeder Naegleria-Spezies tragen jeweils ein einzelnes rDNA-Cistron (mit der ribosomalen 5,8-, 18- und 28S-DNA) auf jeweils etwa 4.000 CERE pro Zelle 12,13,14. Abgesehen von rDNA verfügt jede CERE über eine große Nicht-rDNA-Sequenz (NRS). Die CERE-Größen variieren zwischen den Arten; Die Unterschiede sind hauptsächlich auf die unterschiedliche Länge der NRS zurückzuführen, da die rDNA-Sequenzen in der Gattung 1,15,16,17,18,19,20 hoch konserviert sind. Die Kartierung eines einzigen Ursprungs der DNA-Replikation innerhalb des N. gruberi CERE NRS21 unterstützt die Hypothese, dass Naegleria CERE unabhängig vom Kerngenom repliziert.
N. gruberi ist eine nicht-pathogene Amöbe, die häufig zur Untersuchung der Biologie von Naegleria verwendet wird. Wir haben eine Methodik zur Transformation von N. gruberi Trophozoiten mit einem CERE-Klon der gleichen Spezies entwickelt, um die Hypothese zu testen, dass Naegleria amoebae CERE innerhalb der Trophozoiten tolerieren und unabhängig voneinander replizieren. Dies wurde erreicht, indem N. gruberi mit einem Volllängenklon von N. gruberi CERE in Trophozoiten umgewandelt und das Schicksal des Spender-CERE-Klons mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verfolgt wurde. Einen allgemeinen Überblick über das Protokoll gibt Abbildung 1. Die hierin präsentierten Daten zeigen, dass der Spenderklon durch mindestens sieben Passagen in der Gewebekultur nachgewiesen werden kann, sowie durch Enzystierung und Exzystierung aufrechterhalten werden kann. Diese Studien bilden die Grundlage für ein Mittel, um zu analysieren, wie sich CERE repliziert, und um seine Verwendung als Vektor zur Transfektion von Naeglerien zu untersuchen.
Das hierin skizzierte Protokoll ist sehr einfach, obwohl jedes Konstrukt wahrscheinlich einen gewissen Grad an Optimierung erfordert, insbesondere des DNA-Transfektionsreagenz-Verhältnisses, abhängig von der Art des Konstrukts und der verwendeten Naegleria-Spezies . Wir haben nur ein kommerziell erhältliches Transfektionsreagenz mit diesem Protokoll getestet, aber es ist wahrscheinlich, dass mehrere andere wirksam sein können. Da ein vollständiger Klon des CERE verwendet wird, der einen funktionellen Urspru…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studien wurden teilweise durch ein Stipendium des George F. Haddix Fund der Creighton University (KMD) finanziert. Abbildung 1 wird in biorender.com generiert, und Abbildung 3 wird in benchling.com generiert.
Agarose | Bio Rad | 161-3102 | |
Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | A-7330 | |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C-4901 | |
Crushed ice | |||
Culture Flasks, T-75 | Thermo Scientific | 130190 | |
Culture Plate, 6-well | Corning | 3506 | |
DNAse | Sigma Aldrich | D-4527 | |
EDTA, 0.5 M | Affymetrix | 15694 | |
Electropheresis Gel Apparatus | Amersham Biosciences | 80-6052-45 | |
Eppendorf Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Eppendorf Tubes, 2 mL | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
Ethanol, 100% | Decon Laboratories | 2716 | |
Ethidium Bromide | Sigma Aldrich | E-8751 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | |
Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876-25G | |
GeneRuler 1 kb Plus Ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | UN2789 | |
GoTaq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
Heating Block | Thermo Scientific | 88871001 | |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
Hemin | Sigma Aldrich | 51280 | |
Iron Chloride | Sigma Aldrich | 372870-256 | |
Ligase | NEB | M2200S | |
Magneisum Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
Microfuge | Thermo Scientific | MySpin 12 | |
Microscope | Nikon | TMS | |
N. gruberi | ATCC | 30224 | |
Nucleic Acid | Chem Impex Int’l | #01625 | |
Peptone | Gibco | 211677 | |
pGEM | Promega | P2251 | |
Potassium Phosphate | Sigma Aldrich | P0662-500G | |
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit | Bio Rad | 1645052 | |
Sodium Chloride | MCB Reagents | SX0420 | |
Sodium Phosphate, dibasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
Tabletop Centrifuge | eppendorf | 5415R | |
Tris, base | Sigma Aldrich | T1503-1KG | |
Trypan Blue, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
ViaFect Reagent | Promega | E4981 | |
Weigh Scale | Denver Instruments | APX-60 | |
Yeast Extract | Gibco | 212750 |