Summary

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Identifizierung pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie nach dualer Färbung mit Antikörpern gegen das N-terminale Fragment von Hühner-GSDME (chGSDME-NT) und Propidiumiodid (PI).

Abstract

Pyroptose ist eine entzündliche Form des programmierten Zelltods, die hauptsächlich durch die Bildung von Plasmamembranporen durch den N-Terminus angetrieben wird, die aus den gespaltenen Proteinen der Gasdermin-Familie (GSDM) erzeugt werden. Die Untersuchung von membrangebundenem GSDM-NT mittels Western Blot ist die am häufigsten verwendete Methode zur Beurteilung der Pyroptose. Allerdings ist es mit dieser Methode schwierig, Zellen mit Pyroptose von anderen Formen des Zelltods zu unterscheiden. In dieser Studie wurden mit dem Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) infizierte DF-1-Zellen als Modell verwendet, um den Anteil der Zellen, die einer Pyroptose unterzogen werden, mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren, wobei spezifische Antikörper gegen das N-terminale Fragment der Hühner-GSDME (chGSDME-NT) und Propidiumiodid (PI)-Färbung verwendet wurden. Die chGSDME-NT-positiven Zellen waren mittels Durchflusszytometrie mit Alexa Fluor 647-markierten Anti-chGSDME-NT-Antikörpern leicht nachweisbar. Darüber hinaus war der Anteil der doppelt positiven chGSDME-NT/PI-Zellen in IBDV-infizierten Zellen (rund 33 %) signifikant höher als in scheininfizierten Kontrollen (P < 0,001). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Untersuchung von membrangebundenem chGSDME-NT mittels Durchflusszytometrie ein wirksamer Ansatz zur Bestimmung pyroptotischer Zellen bei Zellen im Zelltod ist.

Introduction

Die Pyroptose ist eine entzündliche Form des programmierten Zelltods, die bei Säugetieren hauptsächlich von der Bildung von Plasmamembranporen durch Gasdermin (GSDM) D abhängt 1,2,3. Aufgrund des genetischen Mangels an GSDMD bei Hühnern 4,5 bleibt der Mechanismus der Pyroptose bei Hühnern schwer fassbar. Die Gasdermin-Familie umfasst konservierte Proteine, darunter GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDMME und DFNB59 3,6. Studien haben gezeigt, dass GSDME aus Teleostfischen und Enten durch Caspase-1/3/7 oder Caspase-3/7 gespalten wird, um den pyroptotischen Zelltod zu induzieren 7,8. Die Rolle der GSDME-vermittelten Pyroptose bei der Wirtsreaktion auf pathogene Infektionen bei Hühnern muss jedoch noch geklärt werden.

Die Infektiöse Schleimbeutelkrankheit (CED) ist eine akute, hochansteckende und immunsuppressive Geflügelkrankheit, die durch IBDV9 verursacht wird. IBDV, ein unbehülltes bi-segmentiertes doppelsträngiges (ds) RNA-Virus, gehört zur Gattung Avibirnavirus in der Familie der Birnaviridae10. Frühere Studien anderer und unseres Labors haben gezeigt, dass eine IBDV-Infektion den Zelltod in Wirtszellen über verschiedene Wege induziert 11,12,13,14. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass eine IBDV-Infektion die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) auslöst, einem Indikator für den lytischen Zelltod 6,15, was darauf hindeutet, dass eine IBDV-Infektion den lytischen Zelltod in Wirtszellen induziert. Darüber hinaus zeigen die Daten, dass IBDV-infizierte Zellen morphologische Merkmale des pyroptotischen Zelltods aufweisen, einschließlich einer Zellschwellung mit großen Blasen, die aus der Plasmamembran wehen, und einer positiven Propidiumiodid (PI)-Färbung, was darauf hindeutet, dass eine IBDV-Infektion Pyroptose in Zellen induziert.

In Anbetracht der Tatsache, dass die Bildung von Membranporen in pyroptotischen Zellen durch das N-terminale Fragment von gespaltenem GSDM (GSDM-NT) ein Kennzeichen der Pyroptose ist, könnten pyroptotische Zellen theoretisch durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, indem GSDM-NT auf der Zellmembran mit spezifischen Antikörpern untersucht wird. In pyroptotischen Zellen von Vögeln bildet das N-terminale Fragment von Hühnergasdermin E (chGSDME-NT) Membranporen, die es Propidiumiodid (PI) ermöglichen, die DNA zu durchdringen und zu binden. So kann der Anteil pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, wodurch die Pyroptose von anderen Formen des Zelltods, wie Apoptose und Nekrose, unterschieden wird. Über die Methode zur Untersuchung pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie wurde jedoch nicht berichtet. In dieser Studie wurden DF-1-Zellen mit IBDV infiziert, und es wurde eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um pyroptotische Zellen mit monoklonalen Antikörpern (McAb) gegen das chGSDME-NT-Fragment (membrangebunden) und PI-Färbung zu untersuchen. Überraschenderweise konnten pyroptotische Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie effektiv nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte der Anteil pyroptotischer Zellen quantifiziert werden. Diese Erkenntnisse stellen ein leistungsfähiges und effektives Mittel zur Bestimmung der Pyroptose dar.

In diesem Artikel wird eine Methode zur Untersuchung der Pyroptose in IBDV-infizierten Zellen mittels Durchflusszytometrie mittels anti-chGGME-NT, MCAB- und PI-Färbung beschrieben. Diese Methode kann auch auf andere erregerinfizierte Zellen ausgeweitet und angewendet werden, um verschiedene Zelltypen mit Pyroptose zu untersuchen und sie von anderen Formen des Zelltods zu unterscheiden.

Protocol

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Vorbereitung der Probenzellen Kultivieren Sie DF-1-Zellen (immortal chicken embryo fibroblasts) in Sechs-Well-Platten (5 x 10,5 Zellen pro Well) mit Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), in einem 5 % CO2 -Inkubator bei 38 °C. Wenn die Zellen eine …

Representative Results

chGSDME-NT auf der Membran von DF-1-Zellen mit IBDV-Infektion konnte mittels Durchflusszytometrie leicht nachgewiesen werdenEines der wichtigsten Merkmale pyroptotischer Zellen ist die Bildung von Membranporen durch GSDM-NT-Fragmente, die aus der Gasdermin-Spaltung erzeugt werden. Daher könnten pyroptotische Zellen theoretisch durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, indem GSDM-NT auf Zellmembranen mit spezifischen Antikörpern untersucht wird. So wur…

Discussion

Dieser Artikel beschreibt eine effektive Methode zur Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie, die durch duale Färbung infizierter Zellen mit Alexa Fluor 647-markiertem anti-chGSDME-NT McAb und PI erreicht wird. Dieser Ansatz kann auch auf verschiedene Zelltypen angewendet werden, um die Pyroptose von anderen Arten des Zelltods, wie Apoptose und Nekrose, zu unterscheiden.

Pyroptose, eine entzündliche Art des programmierten Zelltods, die in erster Linie auf der D-ind…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Jue Liu für seine freundliche Unterstützung. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Key Research and Development Program of China (Nr. 2022YFD1800300), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32130105) und des Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (Nr. CARS-40), China.

Materials

5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) Corning Falcon 352052
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
Alexa Fluor 647 antibody labeling kits Thermo Fisher Scientific A20186
Anti-chGSDME-CT McAb SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) EU0228
Anti-chGSDME-NT McAb SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) EU0227
CellQuest software BD Biosciences
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 3100
Cryogenic Freezing Centrifuge Eppendorf 5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Gibco by Life Technologies C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F0193-500ML
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Flow Cytometry Staining Buffer Thermo Fisher Scientific 00-4222-26
Hemocytometer Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) YX-JSB52
IBDV Lx strain IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
Inverted Microscope Chongqing Photoelectric Instrument Company XDS-1B
Normal Mouse IgG Santa Cruz Biotechnology sc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS) M&C  Gene Technology CC017
Propidium Iodide(PI) Sigma-Aldrich P4170
Trypsin-EDTA, 0.25% M&C  Gene Technology CC008
Vortex Oscillator MIULAB MIX-28+

Referenzen

  1. He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
  2. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  3. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  4. Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9 (2022).
  5. De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
  6. Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
  7. Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
  8. Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526 (2022).
  9. Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
  10. Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
  11. Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
  12. Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724-e01819 (2020).
  13. Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
  14. Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
  15. Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
  16. Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
  17. Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Chang, H., Chen, Z., Gao, L., Cao, H., Wang, Y., Zheng, S. J. Examination of Pyroptosis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (207), e66912, doi:10.3791/66912 (2024).

View Video