Mikrowellengestützte Extraktion von phenolischen Verbindungen und Antioxidantien für kosmetische Anwendungen mit polyolbasierter Technologie

Heutzutage gibt es einen globalen Trend zum Umweltbewusstsein in der Schönheitsindustrie, was die Hersteller dazu veranlasst, sich auf grüne Technologien zur Extraktion von Pflanzenbestandteilen mit nachhaltigen Alternativen zu konzentrieren¹. In der Regel werden traditionelle Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol und Hexan verwendet, um pflanzliche phenolische Bestandteile und natürliche Antioxidantien zu extrahieren². Nichtsdestotrotz stellt das Vorhandensein von Lösungsmittelrückständen in Pflanzenextrakten ein potenzielles Risiko für die menschliche Gesundheit dar und führt zu Haut- und Augenreizungen³, insbesondere im Hinblick auf ihre beabsichtigte Anwendung in Kosmetika. Folglich ist es eine Herausforderung, solche Lösungsmittelrückstände aus den Extrakten zu entfernen, ein Prozess, der erhebliche Investitionen in Zeit, Energie und personelle Ressourcen erfordert⁴. In jüngster Zeit haben sich überhitztes Wasser, ionische Flüssigkeiten, tiefe eutektische Lösungsmittel und biobasierte Lösungsmittel als vielversprechende Ansätze für die Extraktion grüner Lösungsmittel herausgestellt⁵. Ihr Einsatz ist jedoch nach wie vor durch die Produkttrennung in wässrigen Prozessen begrenzt. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, erweist sich die Entwicklung gebrauchsfertiger Extrakte als praktikable Lösung⁶.

Polyole werden aufgrund ihrer guten Polarität und ihrer Fähigkeit, Feuchtigkeit aus der Umgebung zu speichern, häufig in kosmetischen Formulierungen als Feuchthaltemittel verwendet⁷. Darüber hinaus können Polyole wie Glycerin, Propylenglykol, Butylenglykol, Methylpropandiol, Isopentyldiol, Pentylenglykol, 1,2-Hexandiol und Hexylenglykol für Pflanzenextraktionen verwendet werden. Sie gelten als ungiftige, biologisch abbaubare, umweltfreundliche, nicht reaktive und sichere Lösungsmittel für den Einsatz in der Pflanzenextraktion⁸. Darüber hinaus können Polyole aufgrund ihres erhöhten Siedepunkts und ihrer Polarität der Hitze standhalten, die bei der mikrowellengestützten Extraktion (MAE) entsteht⁹. Diese Polyole sind von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) allgemein als sichere (GRAS) Chemikalien anerkannt. Im Gegensatz zu herkömmlichen Lösungsmitteln wie Ethanol oder Methanol, die aufgrund ihrer potenziell schädlichen Wirkungen möglicherweise eine rigorose Entfernung aus dem Extrakt erfordern, bieten Polyole den Vorteil, dass sie den Energie-, Zeit- und Kostenaufwand für Lösungsmittelentfernungsprozesse minimieren¹⁰. Dies rationalisiert nicht nur den Extraktionsprozess, sondern verbessert auch die Gesamteffizienz und Nachhaltigkeit der Extraktionsmethode. Frühere Untersuchungen haben Polyole wie Propylenglykol und Butylenglykol als Lösungsmittel bei der Extraktion von bioaktiven Verbindungen aus Camellia sinensis-Blüten ¹⁰ und Kaffeepulpe¹¹ verwendet, was ein erhebliches Potenzial für ihre Rolle als nachhaltige alternative Lösungsmittel im pflanzlichen Extraktionsprozess aufzeigt. Die kontinuierliche Entwicklung und Optimierung eines Polyol-Wasser-Lösungsmittel-Systems birgt daher das Potenzial für bedeutende Fortschritte in der grünen Chemie und in nachhaltigen industriellen Praktiken.

In der Regel werden bioaktive Verbindungen, die in Pflanzen vorkommen, als Sekundärmetaboliten synthetisiert. Diese Verbindungen können in drei Hauptgruppen eingeteilt werden: Terpene und Terpenoide, Alkaloide und phenolische Verbindungen¹². Verschiedene Extraktionsmethoden werden unter unterschiedlichen Bedingungen eingesetzt, um bestimmte bioaktive Verbindungen aus Pflanzen zu isolieren. Bioaktive Verbindungen aus pflanzlichem Material können entweder mit konventionellen oder nicht-konventionellen Techniken extrahiert werden. Zu den traditionellen Methoden gehören die Mazeration, die Refluxextraktion und die Hydrodestillation, während unkonventionelle Methoden aus der ultraschallgestützten Extraktion, der enzymgestützten Extraktion, der mikrowellengestützten Extraktion (MAE), der gepulsten elektrischen feldgestützten Extraktion, der überkritischen Flüssigkeitsextraktion und der Druckflüssigkeitsextraktion bestehen¹³. Diese unkonventionellen Methoden sollen die Sicherheit erhöhen, indem sie sicherere Lösungsmittel und Hilfsstoffe verwenden, die Energieeffizienz verbessern, die Degradation der bioaktiven Komponenten verhindern und die Umweltverschmutzung verringern¹⁴.

Darüber hinaus gehört MAE zu den ausgereiften grünen Technologien zur Extraktion bioaktiver Verbindungen aus Pflanzen. Herkömmliche Extraktionsverfahren erfordern einen erheblichen Zeit- und Energieaufwand sowie hohe Temperaturen, die im Laufe der Zeit wärmeempfindliche bioaktive Verbindungen abbauen können¹³. Im Gegensatz zu herkömmlichen thermischen Extraktionen erleichtert MAE die Extraktion bioaktiver Verbindungen, indem es eine lokale Erwärmung innerhalb der Probe erzeugt, die Zellstrukturen aufbricht und den Stofftransport verbessert, wodurch die Effizienz der Verbindungsextraktion erhöht wird. Die Wärme wird aus dem Inneren der Pflanzenzellen durch Mikrowellen übertragen, die auf die Wassermoleküle in den Pflanzenbestandteilen^{einwirken 13}. Darüber hinaus hat MAE Fortschritte gemacht, um die Extraktion und Trennung von Wirkstoffen zu verbessern, die Produktausbeute zu erhöhen, die Extraktionseffizienz zu erhöhen, weniger Chemikalien zu benötigen und Zeit und Energie zu sparen, während gleichzeitig die Zerstörung bioaktiver Verbindungen verhindert^{wird 15}.

Diese Forschung konzentriert sich auf die Extraktion von pflanzlichen phenolischen Verbindungen und natürlichen Antioxidantien durch mikrowellengestützte Extraktion (MAE) unter Verwendung verschiedener Arten von Polyolen als Lösungsmittel. Es werden der Gesamtphenolgehalt (TPC), der Gesamtflavonoidgehalt (TFC) und die antioxidative Aktivität (DPPH, ABTS und FRAP) von MAE-Extrakten auf Polyolbasis bestimmt. Darüber hinaus wird polyolbasierte MAE mit MAE unter Verwendung herkömmlicher Lösungsmittel wie Wasser und Ethanol verglichen. Es wird erwartet, dass diese Forschung zur Entwicklung einer umweltverträglichen Extraktionstechnologie für natürliche Bestandteile beiträgt und die Nachhaltigkeit fördert, indem sie die Abhängigkeit von gefährlichen Chemikalien verringert, die Verarbeitungszeiten verkürzt und den Energieverbrauch bei der Rohstoffproduktion für potenzielle Anwendungen in der Kosmetikindustrie minimiert.

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Versuche

1. Vorbereitung von Pflanzenproben
   1. Frischen Kaffee Silberhaut (Coffea arabica) auffangen und bei 60 °C in einem Tabletttrockner für 72 h¹¹ trocknen.
   2. Den getrockneten Kaffee Silverskin (CS) mit einer Mühle zu einem feinen Pulver mahlen und zur weiteren Analyse bei Raumtemperatur lagern¹¹.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde frisches CS (C. arabica) aus Baan Doi Chang, Mae Suai District, Chiang Rai, Thailand, gesammelt. CS ist ein Nebenprodukt, das beim Schälen anfällt und bei dem die Pergamentschicht von getrockneten Kaffeebohnen entfernt wird, nachdem die Kirschen verarbeitet wurden, um die äußeren Fruchtschichten^{zu entfernen 16}.
2. Chemikalien
   1. Verwenden Sie chemische Reagenzien von analytischer Qualität, mit Ausnahme der Lösungsmittel im Experiment.
      HINWEIS: Im Experiment wurden Lösungsmittel in kosmetischer Qualität verwendet.
   2. Verwenden Sie die Lösungsmittel (Wasser, Ethanol, Glycerin, Propylenglykol, Butylenglykol, Hexylenglykol, Isopentyldiol, 1-2 Hexandiol, Pentylenglykol und Methylpropandiol) für die Extraktion von CS mit MAE.

2. Extraktionsprozess

1. Proben- und Lösungsmittelvorbereitung
   1. Bereiten Sie die Probe und die Lösungsmittel für das MAE-Verfahren gemäß einem zuvor berichteten Protokoll⁹ mit einigen Änderungen vor.
   2. Bereiten Sie jedes Lösungsmittel in einer Konzentration von 60 % vor, indem Sie 60 ml jedes Lösungsmittels mit destilliertem Wasser verdünnen und das Volumen für dreifache Extraktionen auf 100 ml einstellen.
      HINWEIS: Verwenden Sie 100% destilliertes Wasser für die Wasserextraktion.
   3. Wiegen Sie 0,67 g CS und mischen Sie es mit 20 mL jedes Extraktionslösungsmittels im Verhältnis 1:30 in einem Reaktionsbehälter (Abbildung 1A) für MAE.
      HINWEIS: Die maximale Fest-Flüssig-Menge für jedes Gefäß beträgt 2 g Probe und 20 ml Lösungsmittel.
   4. Fügen Sie jedem Gefäß einen magnetischen Rührstab hinzu, um eine gleichmäßige Verteilung der Hitze und des Lösungsmittels in der Probe zu gewährleisten, die Effizienz des Extraktionsprozesses zu verbessern und eine bessere Extraktionsausbeute zu fördern.
      HINWEIS: Wenn unpolare Lösungsmittel für den Extraktionsprozess verwendet werden, können Teflon-Rührstäbchen anstelle von magnetischen Rührstäbchen verwendet werden, um eine effektive Erwärmung durch das Mikrowellensystem zu gewährleisten.
   5. Verschließen Sie jedes Gefäß fest mit einem Spezialwerkzeug (Abbildung 2) und setzen Sie alle Gefäße in die MAE-Kammer ein (Abbildung 1B).
2. Einrichten des mikrowellengestützten Extraktionsinstruments und -verfahrens
   1. Führen Sie das Extraktionsverfahren gemäß dem Referenzprotokoll mit einigen Änderungen⁹ durch.
   2. Öffnen Sie den Monitorbildschirm, um die Methode einzurichten, indem Sie auf das Toolbox-Symbol in der oberen Leiste klicken und den SK eT-Rotor im Zubehörbereich auswählen (Abbildung 3A,B).
   3. Wählen Sie die Rührleistung der Rührstäbe aus, indem Sie auf den Rührerabschnitt klicken und 20 % eingeben (Abbildung 4A).
      HINWEIS: Die Rührleistung kann von 0 % bis 100 % gewählt werden.
   4. Klicken Sie auf den Türschlosssektor und stellen Sie ihn so ein, dass er bei Temperaturen über 80 °C aktiviert wird (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Diese Einstellung gewährleistet das automatische Schließen der Kammertür, wenn die Innentemperatur 80 °C überschreitet.
   5. Klicken Sie auf das Tabellensymbol in der oberen Leiste (Abbildung 5A) und stellen Sie den Temperaturgradienten (T1) auf eine Extraktionsdauer von 10 min, die Mikrowellenleistung auf 1800 W und die Temperatur auf 120 °C ein.
   6. Aktivieren Sie den Rührer, indem Sie auf die Schaltfläche des Rührers klicken, bis das grüne Licht erscheint.
   7. Stellen Sie die Gebläsedrehzahl auf Stufe 3 (maximal) ein (Abbildung 5B).
   8. Um die Extraktionszeit zu halten, wählen Sie die gewünschte Extraktionstemperatur (T2), indem Sie die Extraktionsdauer auf 15 Minuten, die Mikrowellenleistung auf 1800 W und die Temperatur auf 120 °C einstellen.
   9. Die Rühr- und Lüfterdrehzahl ist wie in den Abschnitten 2.2.6 und 2.2.7 angegeben einzustellen (Abbildung 5A,B).
      HINWEIS: Die maximale Temperatur und Mikrowellenleistung beträgt 260 °C und 1800 W.
   10. Stellen Sie die Kühlzeit ein, indem Sie auf die Kühlschaltfläche in der unteren linken Ecke des Bildschirms klicken und die Dauer von 10 Minuten auswählen (Abbildung 6).
   11. Speichern Sie die Methode, indem Sie auf das Speichersymbol in der oberen rechten Ecke des Bildschirms klicken (Abbildung 7A).
   12. Stellen Sie sicher, dass nach dem Speichern der Methodenbedingungen das Diagramm der Extraktionsbedingungen auf dem Bildschirm mit der Wiedergabeschaltfläche in der unteren rechten Ecke angezeigt wird (Abbildung 7B).
   13. Beginnen Sie den Extraktionsprozess, indem Sie die Anzahl der verwendeten Gefäße auswählen (Abbildung 7C).
       HINWEIS: Bis zu 15 Gefäße können in einer Extraktion verwendet werden, und wenn die gewünschte Anzahl von Gefäßen verwendet wird, stellen Sie sicher, dass die Gefäße in der Kammer ausgewogen platziert werden.
   14. Nach der Extraktion werden die Extrakte bei 4 °C, 9072 x g, 15 Minuten lang mit einer gekühlten Zentrifugenmaschine zentrifugiert.
   15. Sammeln Sie den Überstand mit einer 10-ml-Glaspipette (Abbildung 8) und lagern Sie ihn für weitere Untersuchungen bei -20 °C im Gefrierschrank.
       HINWEIS: Abhängig von der Partikelgröße und Dichte der Pflanzenreste benötigen die Extrakte längere Zentrifugationszeiten (20-30 min).

3. Bestimmung von phenolischen Verbindungen

1. Bestimmung des Gesamtphenolgehalts
   1. Bestimmen Sie den Gesamtphenolgehalt der CS-Extrakte, indem Sie sich mit einigen Änderungen auf das Protokoll beziehen¹⁷.
   2. Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnung der Proben vor, indem Sie sie mit destilliertem Wasser verdünnen.
   3. Mischen Sie 10 μl der verdünnten Probe mit 20 μl unverdünntem Folin-Ciocalteu-Reagenz und lassen Sie sie 3 Minuten lang reagieren.
   4. Geben Sie anschließend 100 μl 7,5 %ige Na₂CO₃ -Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte zu der Mischung.
   5. Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen für den Gallussäure-Standardkonzentrationsbereich (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2) durch Verdünnen mit destilliertem Wasser vor.
   6. Mischen Sie sie mit 20 μl des Reagenzes von Folin-Ciocalteu und lassen Sie sie 3 Minuten lang reagieren.
   7. Geben Sie anschließend 100 μl 7,5 %ige Na₂CO₃ -Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte zu der Mischung.
   8. Inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.
   9. Messen Sie die Extinktion der Reaktionslösung bei 765 nm mit einem Mikroplatten-Reader (Abbildung 9A).
   10. Die Standardkalibrierungskurve wird anhand der Konzentrationen des Standards und der Extinktion bei 765 nm dargestellt (Abbildung 10A).
   11. Drücken Sie die Ergebnisse in mg Gallussäureäquivalent (GAE) pro g der Probe aus und berechnen Sie mit der folgenden Gleichung¹⁸:
       HINWEIS: mg Gallussäureäquivalent (GAE) pro g Probe = [((A₇₆₅ - c) / m)) in μg Gallussäureäquivalent × Gesamtvolumen in der Reaktionsvertiefung (ml) x Verdünnung × Gewicht der Trockenprobe (1 g) x Resultantisches Extraktvolumen (ml)] / [(Volumen der in jede Vertiefung gegebenen Probe (ml) x Tatsächliches Gewicht der Trockenprobe (g) × Umrechnungsfaktor von μg in mg (1000)]
       Dabei ist c = y-Schnittpunkt, m = Steigung
2. Bestimmung des Gesamtgehalts an Flavonoiden
   1. Bestimmen Sie den Gesamtflavonoidgehalt des CS-Extrakts gemäß dem Protokoll mit einigen Modifikationen¹⁷.
   2. Bereiten Sie eine 5-fache Verdünnung der Proben vor, indem Sie sie mit destilliertem Wasser verdünnen.
   3. 50 μl der verdünnten Probe auf 15 μl 5 % NaNO₂ geben und 5 min im Dunkeln inkubieren.
   4. Mischen Sie 15 μl 10%ige AlCl_3-Lösung mit der Reaktion und halten Sie sie 6 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   5. Geben Sie dann 100 μl 1 M NaOH-Lösung in die Reaktion und inkubieren Sie weitere 10 Minuten.
   6. Messen Sie die Extinktion des Gemisches bei 510 nm (Abbildung 9B).
   7. Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen des Quercetin-Standardbereichs vor (siehe Tabelle 3 und 4), indem Sie sie zu 15 μl 5 % NaNO₂ hinzufügen und 5 Minuten lang im Dunkeln inkubieren.
   8. 15 μl 10%ige AlCl_3-Lösung mit der Reaktion mischen und 6 min bei Raumtemperatur aufbewahren.
   9. Geben Sie 100 μl 1 M NaOH-Lösung in die Reaktion und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang.
   10. Bestimmen Sie die Extinktion des Standards bei 510 nm (Abbildung 9B).
   11. Die Standardkalibrierungskurve wird unter Verwendung der Konzentrationen des Standards und der Extinktion bei 510 nm dargestellt (Abbildung 10B).
   12. Die Ergebnisse werden in mg Quercetin-Äquivalent (QE) pro g der Probe ausgedrückt, berechnet nach Gleichung¹⁹ wie folgt:
       HINWEIS: mg Quercetin-Äquivalent (QE) pro g Probe = [((A₅₁₀ - c) / m)) in μg Quercetin-Äquivalent × Gesamtvolumen in der Reaktionsvertiefung (ml) x Verdünnung × Gewicht der Trockenprobe (1 g) x Resultierendes Extraktvolumen (ml)] / [(Volumen der in jede Vertiefung gegebenen Probe (ml) x Tatsächliches Gewicht der Trockenprobe (g) × Umrechnungsfaktor von μg in mg (1000)]
       Dabei ist c = y-Schnittpunkt, m = Steigung

4. Bestimmung der antioxidativen Aktivitäten

1. 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH) Radikalfänger-Assay
   1. Bestimmung der DPPH-Radikalfängeraktivität von CS-Extrakt gemäß dem Protokoll mit einigen Modifikationen¹⁷.
   2. Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnung der Proben vor, indem Sie sie mit destilliertem Wasser verdünnen.
   3. Mischen Sie 20 μl der verdünnten Proben mit 135 μl 0,1 mM DPPH-Lösung.
   4. Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen des Trolox-Standardkonzentrationsbereichs (siehe Tabelle 5 und 6) vor, indem Sie mit 135 μl 0,1 mM DPPH-Lösung mischen.
   5. Die Mischung im Dunkeln bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
   6. Messen Sie die Extinktion der Resultierenden bei 517 nm (Abbildung 9C).
   7. Die Standardkalibrierungskurve ist unter Verwendung der Konzentrationen des Standards und der %-Hemmung grafisch darzustellen (Abbildung 10C).
   8. Berechnen Sie die prozentuale Hemmung des DPPH-Assays wie folgt:
      % Hemmung = [(Absorption der Kontrolle − Absorption der Probe)/ Absorption der Kontrolle] × 100
   9. Die Ergebnisse werden in mg der Trolox-äquivalenten antioxidativen Kapazität pro g der Probe ausgedrückt, berechnet nach der folgenden Gleichung²⁰:
      HINWEIS: mg Trolox-Äquivalent (TE) pro g Probe = [((% Hemmung-c) / m) in μg Trolox-Äquivalent × Gesamtvolumen in der Reaktionsvertiefung (ml) x Verdünnung × Gewicht der Trockenprobe (1 g) x Resultantisches Extraktvolumen (mL)] / [(Volumen der in jede Vertiefung gegebenen Probe (mL) x Tatsächliches Gewicht der Trockenprobe (g) × Umrechnungsfaktor von μg in mg (1000)]
      Dabei ist c = y-Schnittpunkt, m = Steigung
2. 2,2′-Azino-Bis-3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS) Radikalfänger-Assay
   1. Bestimmen Sie die ABTS-Radikalfängeraktivität von CS-Extrakt unter Verwendung des Protokolls aus der Referenz mit einigen Modifikationen¹⁷.
   2. Die ABTS·+ Stammlösung wird durch Mischen von 7 mM ABTS und 2,45 mM Kaliumpersulfat (1:2) hergestellt und im Dunkeln bei Raumtemperatur 16 h inkubiert.
   3. Bereiten Sie die Arbeitslösung vor, indem Sie 5 mL ABTS·+ Stammlösung mit 100 mL deionisiertem Wasser mischen.
   4. Mischen Sie 160 μl ABTS·+ Arbeitslösung mit 10 μl der 10-fach verdünnten Probe oder des Trolox-Standards in unterschiedlichen Konzentrationen (siehe Tabelle 7 und Tabelle 8).
   5. Inkubieren Sie die Reaktion im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min.
   6. Die Extinktion des Gemisches bei 734 nm wird bestimmt (Abbildung 9D).
   7. Die Standardkalibrierungskurve ist unter Verwendung der Konzentrationen des Standards und der %-Hemmung darzustellen (Abbildung 10D).
   8. Berechnen Sie die prozentuale Hemmung des ABTS-Assays mit der folgenden Formel:
      % Hemmung = [(Absorption der Kontrolle - Absorption der Probe) / Absorption der Kontrolle] × 100.
      1. Drücken Sie die Ergebnisse in mg der Trolox-äquivalenten antioxidativen Kapazität pro g der Probe aus, berechnet nach der folgenden Gleichung²¹:
         HINWEIS: mg Trolox-Äquivalent (TE) pro g Probe = [((% Hemmung - c) / m)) in μg Trolox-Äquivalent × Gesamtvolumen in der Reaktionsvertiefung (ml) x Verdünnung × Gewicht der Trockenprobe (1 g) x Resultantisches Extraktvolumen (mL)] / [(Volumen der in jede Vertiefung gegebenen Probe (mL) x Tatsächliches Gewicht der Trockenprobe (g) × Umrechnungsfaktor von μg in mg (1000)]
         Dabei ist c = y-Schnittpunkt, m = Steigung
3. Eisen-reduzierender Antioxidans-Power-Assay (FRAP)
   1. Bestimmen Sie die eisenreduzierende antioxidative Aktivität von CS-Extrakt gemäß dem Protokoll mit einigen Modifikationen¹⁷.
   2. Bereiten Sie das FRAP-Reagenz unter Verwendung eines 30 mM Acetatpuffers bei einem pH 3,6 vor, der eine Mischung aus 10 mM TPTZ-Lösung in 40 mM HCl und 20 mM FeCl_{3.6H 2}O Lösung in einem Verhältnis von 10:1:1 ist.
   3. Geben Sie das FRAP-Reagenz bis zur Verwendung in eine braune Flasche.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das FRAP-Reagenz braun ist. Wenn das Reagenz durch Metallionen oder andere reaktive Verbindungen verunreinigt ist, färbt es sich violett und muss verworfen werden. Verwenden Sie nur frisch zubereitete Reagenzien.
   4. Bereiten Sie eine 5-fache Verdünnung der Proben vor, indem Sie sie mit destilliertem Wasser verdünnen.
   5. 10 μl der verdünnten Probe oder 20 μl FeSO_{4,7H 2}O in unterschiedlichen Standardkonzentrationen (Tabelle 9 und Tabelle 10) zu 180 μl der FRAP-Lösung geben.
   6. Inkubieren Sie die Reaktion 4 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   7. Bewerten Sie die Extinktion des Gemisches bei 593 nm (Abbildung 9E).
   8. Die Standardkalibrierungskurve wird unter Verwendung der Konzentrationen des Standards und der Extinktion bei 593 nm dargestellt (Abbildung 10E).
   9. Die Ergebnisse werden in mg FeSO₄ pro g der Probe ausgedrückt, berechnet nach der folgenden Gleichung²¹:
      HINWEIS: mg FeSO_{4-Äquivalent} (Fe (II) E) pro g Probe = [((A₅₉₃ - c) / m)) in μg FeSO_{4-Äquivalent} × Gesamtvolumen in der Reaktionsvertiefung (ml) x Verdünnung × Gewicht der Trockenprobe (1 g) x Resultierendes Extraktvolumen (mL)] / [(Volumen der in jede Vertiefung gegebenen Probe (ml) x Tatsächliches Gewicht der Trockenprobe (g) × Umrechnungsfaktor von μg in mg (1000)]
      Dabei ist c = y-Schnittpunkt, m = Steigung
4. Führen Sie alle Assays (TPC, TFC, DPPH, ABTS und FRAP) jeder Probe in dreifacher Ausfertigung durch. In dieser Studie wurde Wasser als Blindwert für die meisten Assays verwendet, mit Ausnahme von DPPH, bei dem Ethanol als Blindwert diente, um die Hintergrundabsorption zu adressieren.

5. Statistische Analyse

1. Verwenden Sie die SPSS-Software, um eine statistische Analyse der experimentellen Daten durchzuführen.
2. Führen Sie den Normalitätstest mit dem Shapiro-Wilk-Test durch.
3. Vergleichen Sie die bioaktiven Substanzen und antioxidativen Aktivitäten von MAE CS-Extrakten auf Polyolbasis und herkömmlichen MAE CS-Extrakten auf Lösungsmittelbasis unter Verwendung der Einweg-ANOVA mit den Mehrbereichstests von Duncan.
4. Drücken Sie alle Daten als Mittelwert ± SD (n = 3) aus und definieren Sie das Signifikanzniveau bei p < 0,05.

Einfluss von polyolen, Lösungsmitteln und herkömmlichen Lösungsmitteln auf den Gesamtphenolgehalt, den Gesamtflavonoidgehalt, DPPH, FRAP und ABTS-Antioxidationsassays
Die Polarität des Lösungsmittels sollte mit der der zielgerichteten Wirkstoffe kompatibel sein, um die Extraktionseffizienz von bioaktiven Substanzen aus Pflanzenzu verbessern 22. Es wurden Experimente mit verschiedenen Lösungsmitteln (Wasser, Ethanol, Glycerin, Propylenglykol, Butylenglykol, Methylpropandiol, Isopentyldiol, Pentylenglykol, 1,2-Hexandiol und Hexylenglykol) durchgeführt, um ihre Auswirkungen auf die bioaktiven Verbindungen und die antioxidativen Aktivitäten von MAE-Kaffee-Silberhautextrakt zu bewerten.

Einfluss von Polyolen, Lösemitteln und herkömmlichen Lösemitteln auf den Gesamtphenolgehalt
Der Gesamtphenolgehalt jeder Extraktion mit verschiedenen Lösungsmitteln wurde analysiert. Der höchste Phenolgehalt wurde in Proben mit wässrigem 1,2-Hexandiol (52,0 ± 3,0 mg GAE/g Probe) erzielt, während der niedrigste TPC in Proben mit Wasserextraktion (31,4 ± 4,3 mg GAE/g Probe) nachgewiesen wurde, und diese Werte unterschieden sich signifikant von denen aller anderen Bedingungen. Die Proben mit wässrigem Pentylenglykol ergaben den zweithöchsten TPC-Wert, gefolgt von Proben mit wässrigem Butylenglykol, Methylpropandiol und anderen Lösungsmittelsystemen (Abbildung 11A). Beim Vergleich von Proben mit herkömmlichen Lösungsmitteln (Wasser- und wässriges Ethanolsystem) und Proben mit polyolbasierten Lösungsmitteln können signifikante Unterschiede in den TPC-Werten beobachtet werden (p < 0,05).

Einfluss von Polyolen, Lösungsmitteln und herkömmlichen Lösungsmitteln auf den Gesamtgehalt an Flavonoiden
Der Gesamtgehalt an Flavonoiden jeder Extraktion mit verschiedenen Lösungsmitteln wurde analysiert. Der höchste Flavonoidgehalt wurde in Proben mit wässrigem 1,2-Hexandiol (20,0 ± 1,7 mg QE/g Probe) erzielt, was einen signifikanten Unterschied zu allen anderen Extrakten darstellt. Die Proben mit wässrigem Isopentydiol zeigten den niedrigsten TFC-Wert (8,8 ± 0,7 mg QE/g Probe), der sich nicht signifikant von wässrigem Methylpropandiol und wässrigen Ethanolextrakten unterschied. Darüber hinaus wurde der zweithöchste TFC-Wert in der Probe mit wässrigem Pentylenglykol gefunden, gefolgt von wässrigem Hexylenglykol, wässrigem Propylenglykol, wässrigem Butylenglykol und wässrigem Glycerin (Abbildung 11B).

Einfluss von Polyolen, Lösungsmitteln und herkömmlichen Lösungsmitteln auf antioxidative Assays
Die antioxidative Aktivität der Extrakte mit Polyolen und herkömmlichen Lösungsmitteln wurde mit DPPH-, ABTS- und FRAP-Assays bewertet. Der höchste Wert für den DPPH-Assay wurde in Proben mit wässrigem Hexylenglykol (13,6 ± 0,3 mg TE/g Probe) und der niedrigste in Proben mit wässrigem Ethanol (4,5 ± 0,2 mg GAE/g Probe) gemessen, und diese Werte unterschieden sich signifikant von anderen Extrakten (p < 0,05). Die zweithöchsten DPPH-Werte wurden in Proben mit wässrigem 1,2-Hexandiol beobachtet, gefolgt von wässrigem Pentylenglykol, wässrigem Methylpropandiol und anderen Lösungsmittelsystemen (Abbildung 11C).

Der höchste ABTS-Wert wurde in Proben mit wässrigem Pentylenglykol (8,2 ± 0,1 mg TE/g Probe) und der niedrigste in Proben mit Wasser (5,6 ± 0,04 mg GAE/g Probe) gemessen, wobei sich diese Werte signifikant von anderen Extrakten unterschieden (p < 0,05). Die zweithöchsten ABTS-Werte wurden in wässrigem Butylenglykol und wässrigem 1,2-Hexandiol nachgewiesen, gefolgt von Proben mit wässrigem Glycerin, wässrigem Methylpropandiol und anderen Lösungsmittelsystemen (Abbildung 11D).

Die höchsten FRAP-Werte wurden in Proben mit wässrigem Hexylenglykol (21,1 ± 1,3 mg Fe (II) E/g Probe und die niedrigsten in der Wasserextraktion (11,5 ± 0,2 Fe (II) E/g Probe) beobachtet, wobei sich diese Werte für die übrigen Lösungsmittel signifikant unterschieden (p < 0,05). Darüber hinaus wurden die zweithöchsten FRAP-Werte in Proben mit wässrigem Pentylenglykol gefunden, gefolgt von wässrigem Butylenglykol, wässrigem Glycerin und anderen Lösungsmittelsystemen (Abbildung 11E).

Beim Vergleich der antioxidativen Aktivitäten von Proben mit herkömmlichen Lösungsmitteln (Wasser und wässrigem Ethanol) zeigten diejenigen, die Polyole enthielten, in allen Antioxidans-Assays (DPPH, ABTS und FRAP) signifikant höhere antioxidative Aktivitäten (p < 0,05).

Abbildung 1: Reaktion in experimentellen Behältern und der MAE-Kammer. (A) Probe und Lösungsmittel werden vor der Extraktion in das weiße Zwischenschichtgefäß eines Teflonbehälters gegeben. (B) Jeder Behälter wird vor Beginn der Extraktion in die Mikrowellenkammer gestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Spezialwerkzeuge zum Verschließen der Reaktionsgefäße. Nach der Zugabe der Probe und des Lösungsmittels in den Teflonbehälter werden die Deckel auf die Oberseite des Behälters aufgesetzt, in den Gefäßhalter eingesetzt und mit den Werkzeugen fest verschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Extraktionsmethode. (A) Extraktionsmethode, die durch Eingabe des Methodenabschnitts erstellt wird. (B) Das SK eT-Zubehör wird für den MAE-Prozess verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Einstellung der Rührrate und der Türverriegelungsfunktion. (A) Die magnetischen Rührstäbchen in jedem Behälter können durch Auswahl der Rührleistung aktiviert werden. (B) Die Türverriegelungsfunktion begrenzt die Temperatur, so dass die Kammer nach der Extraktion geöffnet werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Festlegen der Extraktionsbedingungen. (A) Geben Sie das Tabellensymbol ein und stellen Sie die Extraktionsbedingungen wie Zeit, Temperatur und Mikrowellenleistung ein. (B) Öffnen Sie die Rührtaste und wählen Sie die Gebläsegeschwindigkeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Einstellen der Abkühlzeit. Anwendung der Abkühlzeit, um die Innentemperatur in der MAE-Kammer zu senken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Starten des Extraktionsprozesses. (A) Speichern der für die Extraktion erstellten Methode. (B) Klicken Sie auf das Wiedergabesymbol, um den Extraktionsvorgang zu starten. (C) Auswahl der Anzahl der Gefäße, mit denen die Extraktion gestartet werden soll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Bild des finalen Extrakts nach der Extraktion mittels MAE. Gewinnung des Überstands nach dem Zentrifugieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Die 96-Well-Platten zur Bestimmung der TPC-, TFC-, DPPH-Scavenging-Aktivität, der ABTS-Scavenging-Aktivität und des FRAP-Assays der Extrakte. (A) Bestimmung des TPC für die Gallussäure-Standardplatte aus einer Konzentration von 2,5-75 μg/ml und Probenextrakten. (B) Bestimmung des TFC für die Quercetin-Standardplatte aus Konzentrationen von 2,5-50 μg/ml und TFC-Assay zur Messung von Probenextrakten. (C) Bestimmung der DPPH-Scavenging-Aktivität für die Trolox-Standardplatte aus Konzentrationen von 0,25-12,5 μg/ml und die DPPH-Scavenging-Aktivitäts-Detektionsplatte von Probenextrakten. (D) Bestimmung der ABTS-Auffangaktivität für die Trolox-Standardplatte aus Konzentrationen von 0,25-5 μg/ml und die ABTS-Auffangplatte für Probenextrakte. (E) Bestimmung des FRAP-Assays für die FeSO-4-Standardplatte aus Konzentrationen von 0,25-10 μg/ml und der FRAP-Assay-Nachweisplatte für Probenextrakte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: Die Standard-Kalibrierkurven für die TPC-, TFC-, DPPH-Scavenging-Aktivität, ABTS-Scavenging-Aktivität und den FRAP-Assay. (A) Die Standardkurve zur Bestimmung von TPC, aufgetragen durch die Konzentrationen des Gallussäurestandards und die Extinktion bei A765. (B) Die Standardkurve zur Bestimmung der TFC, dargestellt durch die Konzentrationen des Quercetin-Standards und die Extinktion bei A510. (C) Die Standardkurve zur Bestimmung der DPPH-Scavenging-Aktivität, dargestellt durch die Konzentrationen des Trolox-Standards und die %-Hemmung. (D) Die Standardkurve zur Bestimmung der ABTS-Scavenging-Aktivität, dargestellt durch die Konzentrationen des Trolox-Standards und der prozentualen Hemmung. (E) Die Standardkurve für die Messung des FRAP-Assays, dargestellt durch die Konzentrationen des Eisensulfatstandards und die Extinktion bei A593. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: Die Wirkung von Lösungsmitteltypen auf die TPC-, TFC-, DPPH-Scavenging-Aktivität, die ABTS-Scavenging-Aktivität und den FRAP-Assay in der MAE von Kaffee-Silberhaut. (A) Die Wirkung von Lösungsmitteltypen auf den Gesamtphenolgehalt. (B) Die Wirkung von Lösungsmitteltypen auf den Gesamtgehalt an Flavonoiden. (C) Die Wirkung von Lösungsmitteltypen auf die DPPH-Scavenging-Aktivität. (D) Die Wirkung von Lösungsmitteltypen auf die ABTS-Scavenging-Aktivität. (E) Die Wirkung der Lösungsmitteltypen auf den FRAP-Assay. Die Werte werden als Mittelwert ± SD (n = 3) angegeben. Werte mit unterschiedlichen hochgestellten Buchstaben drücken eine statistisch signifikante Differenz aus (p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Vorbereitung der Gallussäure-Standardkurve. Vorbereitung des Standardkonzentrationsbereichs von 2,5-75 μg/ml in der 96-Well-Platte. B = leer, 1-7 = Anzahl der Vertiefungen auf der 96-Well-Platte. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Berechnung der endgültigen Konzentration von Gallussäurestandards. Vorbereitung des Standardkonzentrationsbereichs von 2,5-75 μg/ml. Die Endkonzentrationen (μg/ml) der Gallussäure werden entsprechend berechnet. Endkonzentration (μg/mL) = (Anfangskonzentration (mg/ ml) × Anfangsvolumen (μL) / Endvolumen (μL)) × (1000 μg/1 mg). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Vorbereitung der Quercetin-Standardkurve. Vorbereitung des Standardkonzentrationsbereichs von 2,5-50 μg/ml in der 96-Well-Platte. B = leer, 1-7 = Anzahl der Vertiefungen auf der 96-Well-Platte. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Tabelle zur Berechnung der endgültigen Konzentration für Quercetin-Standards. Vorbereitung des Standardkonzentrationsbereichs von 2,5-50 μg/ml. Die Endkonzentrationen (μg/ml) von Quercetin werden entsprechend berechnet. Endkonzentration (μg/ml) = (Anfangskonzentration (mg/ml) × Anfangsvolumen (μL) / Endvolumen (μL)) × (1000 μg/1 mg). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Vorbereitung der Trolox-Standardkurve im Konzentrationsbereich von 0,25-12,5 μg/ml. Vorbereitung des Standardkonzentrationsbereichs von 0,25-12,5 μg/ml in der 96-Well-Platte. B = leer, C = Kontrolle, 1-7 = Anzahl der Vertiefungen auf der 96-Well-Platte. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 6: Abschließende Konzentrationsberechnung der Trolox-Standards für den DPPH-Assay. Vorbereitung des Standardkonzentrationsbereichs von 0,25-12,5 μg/ml einschließlich der Endkonzentrationen (μg/ml) von Trolox. Endkonzentration (μg/ml) = (Anfangskonzentration (mg/ml) × Anfangsvolumen (μL) / Endvolumen (μL)) × (1000 μg/1 mg). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 7: Vorbereitung der Trolox-Standardkurve im Konzentrationsbereich von 0,25-5 μg/ml. Vorbereitung des Standardkonzentrationsbereichs von 0,25 bis 5 μg/ml in der 96-Well-Platte. B = leer, C = Kontrolle, 1-7 = Anzahl der Vertiefungen auf der 96-Well-Platte. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 8: Abschließende Konzentrationsberechnung der Trolox-Standards für den ABTS-Assay. Vorbereitung des Standardkonzentrationsbereichs von 0,25-5 μg/ml, einschließlich der Endkonzentrationen (μg/ml) von Trolox. Endkonzentration (μg/ml) = (Anfangskonzentration (mg/ml) × Anfangsvolumen (μL) / Endvolumen (μL)) × (1000 μg/1 mg). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 9: Tabelle zur Berechnung der endgültigen Konzentration für die FeSO-4-Normen. Vorbereitung der Zubereitung eines Standardkonzentrationsbereichs von 2,5-100 μg/ml, einschließlich der Endkonzentrationen (μg/ml) von FeSO4. Endkonzentration (μg/ml) = (Anfangskonzentration (mg/ml) × Anfangsvolumen (μL) / Endvolumen (μL)) × (1000 μg/1 mg). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 10: Vorbereitung der FeSO4-Standardkurve . Vorbereitung des Standardkonzentrationsbereichs von 0,25-10 μg/ml in der 96-Well-Platte. B = leer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.