Summary

Identifizierung ruhender Zellen in einem Zebrafisch-T-Zell-Modell für akute lymphatische Leukämie mittels Zellproliferationsfärbung

Published: July 19, 2024
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Summary

Wir verwendeten die Zellproliferationsfärbung, um ruhende Zellen im Zebrafisch-T-Modell für akute lymphatische Leukämie zu identifizieren. Die Färbung wird in nicht teilenden Zellen zurückgehalten und während der Zellproliferation reduziert, was die Selektion ruhender Zellen für die weitere Befragung ermöglicht. Dieses Protokoll bietet ein funktionales Werkzeug, um die Selbsterneuerung im Kontext der zellulären Ruhe zu untersuchen.

Abstract

Zelluläre Ruhe ist ein Zustand des Wachstumsstillstands oder der verlangsamten Proliferation, der bei normalen und Krebsstammzellen (CSCs) beschrieben wird. Quiescence kann CSCs vor antiproliferativen Chemotherapeutika schützen. In T-Zell-Mausmodellen für akute lymphatische Leukämie (T-ALL) mit patientenabgeleitetem Xenotransplantat (PDX) sind ruhende Zellen mit Behandlungsresistenz und Stammzellen assoziiert. Zellproliferationsfarbstoffe sind beliebte Werkzeuge zur Verfolgung der Zellteilung. Der Fluoreszenzfarbstoff ist kovalent in Amingruppen auf der Membran und Makromolekülen im Inneren der Zelle verankert. Dies ermöglicht die Verfolgung markierter Zellen für bis zu 10 Teilungen, die durch Durchflusszytometrie aufgelöst werden können.

Letztendlich haben Zellen mit den höchsten Proliferationsraten eine geringe Farbstoffretention, da sie bei jeder Zellteilung verdünnt wird, während ruhende, sich langsamer teilende Zellen die höchste Retention aufweisen. Die Verwendung von Zellproliferationsfarbstoffen zur Isolierung ruhender Zellen wurde in T-ALL-Mausmodellen optimiert und beschrieben. Ergänzend zu den bestehenden Mausmodellen bietet das rag2:Myc-abgeleitete Zebrafisch-T-ALL-Modell aufgrund der hohen Häufigkeit leukämischer Stammzellen (LSCs) und der Bequemlichkeit des Zebrafisches für groß angelegte Transplantationsexperimente einen hervorragenden Ort, um die Selbsterneuerung bei T-ALL zu untersuchen.

Hier beschreiben wir den Arbeitsablauf für die Färbung von Zebrafisch-T-ALL-Zellen mit einem Zellproliferationsfarbstoff, die Optimierung der Konzentration des Farbstoffs für Zebrafischzellen, die Passage erfolgreich gefärbter Zellen in vivo und die Entnahme von Zellen mit unterschiedlicher Farbstoffretention durch Sortierung von lebenden Zellen aus transplantierten Tieren. Angesichts des Fehlens gut etablierter Zelloberflächenhersteller für LSCs in T-ALL bietet dieser Ansatz ein funktionelles Mittel, um ruhende Zellen in vivo zu befragen. Für repräsentative Ergebnisse beschreiben wir die Transplantationseffizienz und die LSC-Häufigkeit von Zellen mit hoher und niedriger Farbstoffretention. Diese Methode kann helfen, zusätzliche Eigenschaften ruhender Zellen zu untersuchen, einschließlich des Wirkstoffansprechens, der Transkriptionsprofile und der Morphologie.

Introduction

Adulte Stammzellen sind für die Regeneration differenzierter Zelltypen in einem bestimmten Organ verantwortlich und liegen überwiegend in einem ruhenden, sich nicht teilenden Zustand vor 1,2. So bleiben beispielsweise hämatopoetische Stammzellen (HSCs), die das Blut erhalten, weitgehend ruhig, und nur ein kleiner Teil gelangt in den Zellzyklus, um sich selbst zu erneuern oder zu differenzieren, um reife Blutbestandteile zu erzeugen3. In ähnlicher Weise besitzt bei Krebserkrankungen eine seltene Subpopulation von Zellen, die als Krebsstammzellen (CSCs) bezeichnet werden, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind für die langfristige Aufrechterhaltung der Malignität verantwortlich4. Krebsstammzellen existieren in vivo in einem Zustand der Ruhe oder des langsamen Wachstums, was es ihnen ermöglichen könnte, den antiproliferativen Krebsbehandlungen zu entkommen5, sich der Beseitigung durch das Immunsystem zu entziehen6, oxidativen Stress zu reduzieren und ihre DNA-Reparaturwegezu verbessern 7. Selbst eine geringe Anzahl von CSCs, die nach der Behandlung zurückbleiben, kann den Tumor möglicherweise wieder besiedeln, was zu einem Rückfall des Patienten führt8. Dementsprechend ist das Verständnis der zellulären Stille vielversprechend für die Identifizierung potenzieller Schwachstellen von CSCs und die Entwicklung neuer Wege, diese zu bekämpfen.

Zellproliferationsfarbstoffe wie der Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE)-Farbstoff und seine Derivate werden häufig verwendet, um die Häufigkeit von Zellteilungen zu verfolgen9. Der Farbstoff dringt in die Zellmembran ein und wird im Inneren der Zelle durch intrazelluläre Esterasen zu einem fluoreszierenden Produkt aktiviert. Die resultierende fluoreszierende Verbindung wird durch die kovalenten Amidbindungen, die zwischen der Succinimidyleinheit und den funktionellen Amingruppen intrazellulärer Proteine gebildet werden, in der Zelle zurückgehalten10. Bei jeder Zellteilung wird die fluoreszierende Verbindung gleichmäßig auf die beiden resultierenden Zellen aufgeteilt, was zu einer zweifachen Signalverdünnung führt. Dieser Farbstoff ermöglicht den Nachweis von bis zu 10 Zellteilungen durch durchflusszytometrische Analyse11.

Dieser Ansatz wurde bereits verwendet, um CSC-Populationen in vitro anzureichern, indem langsam zyklische Populationen von Zellen mit hoher Retention des Farbstoffs identifiziertwurden 11,12. Bei der T-ALL wurde CFSE verwendet, um das Tumorwachstum in vivo in patienteneigenen Xenotransplantaten bei Mäusen zu verfolgen. Nach der Zellmarkierung und einer dreiwöchigen Transplantation zeigte die Durchflusszytometrie-Analyse eine seltene Population von Zellen, die noch CFSE-Fluoreszenz behielten. Diese Population war bei Patienten mit Stammzellen, Behandlungsresistenz und hoher Ähnlichkeit mit schubverursachenden Zellen assoziiert13. Dementsprechend stellt dieser Farbstoff ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Leukämie-Stammzell-Phänotypen (LSC) bei T-ALL dar.

Ziel der Arbeit ist es, die Anwendung des Zellproliferationsfarbstoffs auf die Untersuchung der Stille in vivo mit Hilfe eines Zebrafisch-T-ALL-Modells auszuweiten. Insbesondere das rag2:Myc-getriebene Zebrafisch-T-ALL-Modell14 bietet aufgrund der hohen Häufigkeit von LSCs im Vergleich zu Mausmodellen und menschlichen Krankheiten15 einen hervorragenden Ort für die Untersuchung der Selbsterneuerung. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Zebrafischen groß angelegte Transplantationsstudien, die im Vergleich zu ihren Gegenstücken bei Mäusen mit wesentlich geringeren Pflege- und Wartungskosten durchgeführt werdenkönnen 16. Zebrafische eignen sich auch hervorragend für Live-Imaging-Anwendungen, da fluoreszenzmarkierte Tumorzellen mit einem einfachen Fluoreszenzmikroskop leicht betrachtet werden können, um die Rate der Tumorentwicklung abzuschätzen16.

In diesem Protokoll beschreiben wir den Arbeitsablauf für die Färbung von T-ALL-Zellen von Zebrafischen mit Zellproliferationsfarbstoff, gefolgt von der in vivo Vermehrung von gefärbten Zellen in syngenen CG1-Zebrafischen. Bei der Entwicklung von Leukämie beschreiben wir die Sortierung der Zellen, die den Farbstoff zurückhielten, und ihre Verwendung für ein anschließendes Transplantationsexperiment zur Begrenzung der Verdünnung, um die Raten der LSC-Selbsterneuerung zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann für weitere Anwendungen erweitert werden, einschließlich des In-vivo-Wirkstoffscreenings potenzieller Verbindungen für das Targeting von ruhenden LSCs. Darüber hinaus können gesammelte Zellen für verschiedene nachgelagerte Analysen verwendet werden, wie z. B. Transkriptomisches Profiling, Proteomik und Metabolomik, was einzigartige Einblicke in das Verhalten ruhender LSCs bei T-ALL bietet.

Protocol

In diesem Protokoll verwenden wir GFP-markierte Zebrafisch-T-ALL-Zellen, die zuvor im CG1-Stamm erzeugt wurden und daher direkt in den syngenen CG1-Zebrafisch15 des Empfängers injiziert werden können. Kurz gesagt, Leukämie wurde durch DNA-Mikroinjektion von rag2:Myc und rag2:GFP in einzellige CG1-Zebrafischembryonen erzeugt. Die Tiere wurden ab 3 Wochen nach der Injektion mittels Fluoreszenzmikroskopie auf die Entwicklung von Leukämie überwa…

Representative Results

Wir folgten dem oben beschriebenen Protokoll, um Zellen zu sortieren, die den Zellproliferationsfarbstoff CT-FR beibehalten haben, und verwendeten sie für einen Limiting Dilution Assay (LDA) zur Abschätzung der LSC-Häufigkeit in den CT-FR High- und CT-FR Low-Populationen. Um das Gating für das Durchflusszytometrie-Experiment einzustellen, verwendeten wir zusätzlich zu den einfarbigen Kontrollen eine Kontrolle ohne Fluorophor (ohne Farbe ) (Abbildung 2A</…

Discussion

Es ist bekannt, dass LSCs resistent gegen konventionelle, antiproliferative Chemotherapien sind, und die Suche nach gezielten Therapien gegen diese Zellen ist vielversprechend, um das Auftreten von Rückfällen zu reduzieren und die Patientenprognose zu verbessern20. Frühere Forschungen beschrieben die Verwendung von fluoreszierenden Zellproliferationsfärbungen zur Identifizierung einer kleinen Population ruhender Zellen, die mit Arzneimittelresistenz und Stammz…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Finanzierung dieser Forschung erfolgte durch das National Cancer Institute (R37CA227656 to JSB). Diese Forschung wurde auch durch die gemeinsamen Ressourcen für Durchflusszytometrie und Immunüberwachung des Markey Cancer Center (P30CA177558) der University of Kentucky unterstützt.

Materials

26 G/2” micro-syringe Hamilton 87930 NA
35 µm filter cap FACS tubes Falcon 352235 NA
40 µm cell strainer CELLTREAT 229482 NA
96-well skirted PCR plate Thermo Fisher Scientific AB0800 NA
Cell sorter Sony Biotechnology SY3200 NA
CellTrace Far Red Thermo Fisher Scientific C34564 NA
Conical tubes VWR 10026-078 NA
DAPI Thermo Fisher Scientific 62248 NA
DMSO Sigma-Aldrich D4818 NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS) Caisson Labs 22110001 NA
Epifluorescence stereo microscope Nikon SMZ25 NA
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich 12306C NA
Fish system water N/A N/A 0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher Scientific C2171 NA
MS-222 Pentaire TRS-1 tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes Corning 07-202-011 NA
Razor blades American Line 66-0089 NA
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific T10282 NA

Referenzen

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Al-Hamaly, M. A., Chernyavskaya, Y., Blackburn, J. S. Identification of Quiescent Cells in a Zebrafish T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Model Using Cell Proliferation Staining . J. Vis. Exp. (209), e67059, doi:10.3791/67059 (2024).

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