Wir verwendeten die Zellproliferationsfärbung, um ruhende Zellen im Zebrafisch-T-Modell für akute lymphatische Leukämie zu identifizieren. Die Färbung wird in nicht teilenden Zellen zurückgehalten und während der Zellproliferation reduziert, was die Selektion ruhender Zellen für die weitere Befragung ermöglicht. Dieses Protokoll bietet ein funktionales Werkzeug, um die Selbsterneuerung im Kontext der zellulären Ruhe zu untersuchen.
Zelluläre Ruhe ist ein Zustand des Wachstumsstillstands oder der verlangsamten Proliferation, der bei normalen und Krebsstammzellen (CSCs) beschrieben wird. Quiescence kann CSCs vor antiproliferativen Chemotherapeutika schützen. In T-Zell-Mausmodellen für akute lymphatische Leukämie (T-ALL) mit patientenabgeleitetem Xenotransplantat (PDX) sind ruhende Zellen mit Behandlungsresistenz und Stammzellen assoziiert. Zellproliferationsfarbstoffe sind beliebte Werkzeuge zur Verfolgung der Zellteilung. Der Fluoreszenzfarbstoff ist kovalent in Amingruppen auf der Membran und Makromolekülen im Inneren der Zelle verankert. Dies ermöglicht die Verfolgung markierter Zellen für bis zu 10 Teilungen, die durch Durchflusszytometrie aufgelöst werden können.
Letztendlich haben Zellen mit den höchsten Proliferationsraten eine geringe Farbstoffretention, da sie bei jeder Zellteilung verdünnt wird, während ruhende, sich langsamer teilende Zellen die höchste Retention aufweisen. Die Verwendung von Zellproliferationsfarbstoffen zur Isolierung ruhender Zellen wurde in T-ALL-Mausmodellen optimiert und beschrieben. Ergänzend zu den bestehenden Mausmodellen bietet das rag2:Myc-abgeleitete Zebrafisch-T-ALL-Modell aufgrund der hohen Häufigkeit leukämischer Stammzellen (LSCs) und der Bequemlichkeit des Zebrafisches für groß angelegte Transplantationsexperimente einen hervorragenden Ort, um die Selbsterneuerung bei T-ALL zu untersuchen.
Hier beschreiben wir den Arbeitsablauf für die Färbung von Zebrafisch-T-ALL-Zellen mit einem Zellproliferationsfarbstoff, die Optimierung der Konzentration des Farbstoffs für Zebrafischzellen, die Passage erfolgreich gefärbter Zellen in vivo und die Entnahme von Zellen mit unterschiedlicher Farbstoffretention durch Sortierung von lebenden Zellen aus transplantierten Tieren. Angesichts des Fehlens gut etablierter Zelloberflächenhersteller für LSCs in T-ALL bietet dieser Ansatz ein funktionelles Mittel, um ruhende Zellen in vivo zu befragen. Für repräsentative Ergebnisse beschreiben wir die Transplantationseffizienz und die LSC-Häufigkeit von Zellen mit hoher und niedriger Farbstoffretention. Diese Methode kann helfen, zusätzliche Eigenschaften ruhender Zellen zu untersuchen, einschließlich des Wirkstoffansprechens, der Transkriptionsprofile und der Morphologie.
Adulte Stammzellen sind für die Regeneration differenzierter Zelltypen in einem bestimmten Organ verantwortlich und liegen überwiegend in einem ruhenden, sich nicht teilenden Zustand vor 1,2. So bleiben beispielsweise hämatopoetische Stammzellen (HSCs), die das Blut erhalten, weitgehend ruhig, und nur ein kleiner Teil gelangt in den Zellzyklus, um sich selbst zu erneuern oder zu differenzieren, um reife Blutbestandteile zu erzeugen3. In ähnlicher Weise besitzt bei Krebserkrankungen eine seltene Subpopulation von Zellen, die als Krebsstammzellen (CSCs) bezeichnet werden, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind für die langfristige Aufrechterhaltung der Malignität verantwortlich4. Krebsstammzellen existieren in vivo in einem Zustand der Ruhe oder des langsamen Wachstums, was es ihnen ermöglichen könnte, den antiproliferativen Krebsbehandlungen zu entkommen5, sich der Beseitigung durch das Immunsystem zu entziehen6, oxidativen Stress zu reduzieren und ihre DNA-Reparaturwegezu verbessern 7. Selbst eine geringe Anzahl von CSCs, die nach der Behandlung zurückbleiben, kann den Tumor möglicherweise wieder besiedeln, was zu einem Rückfall des Patienten führt8. Dementsprechend ist das Verständnis der zellulären Stille vielversprechend für die Identifizierung potenzieller Schwachstellen von CSCs und die Entwicklung neuer Wege, diese zu bekämpfen.
Zellproliferationsfarbstoffe wie der Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE)-Farbstoff und seine Derivate werden häufig verwendet, um die Häufigkeit von Zellteilungen zu verfolgen9. Der Farbstoff dringt in die Zellmembran ein und wird im Inneren der Zelle durch intrazelluläre Esterasen zu einem fluoreszierenden Produkt aktiviert. Die resultierende fluoreszierende Verbindung wird durch die kovalenten Amidbindungen, die zwischen der Succinimidyleinheit und den funktionellen Amingruppen intrazellulärer Proteine gebildet werden, in der Zelle zurückgehalten10. Bei jeder Zellteilung wird die fluoreszierende Verbindung gleichmäßig auf die beiden resultierenden Zellen aufgeteilt, was zu einer zweifachen Signalverdünnung führt. Dieser Farbstoff ermöglicht den Nachweis von bis zu 10 Zellteilungen durch durchflusszytometrische Analyse11.
Dieser Ansatz wurde bereits verwendet, um CSC-Populationen in vitro anzureichern, indem langsam zyklische Populationen von Zellen mit hoher Retention des Farbstoffs identifiziertwurden 11,12. Bei der T-ALL wurde CFSE verwendet, um das Tumorwachstum in vivo in patienteneigenen Xenotransplantaten bei Mäusen zu verfolgen. Nach der Zellmarkierung und einer dreiwöchigen Transplantation zeigte die Durchflusszytometrie-Analyse eine seltene Population von Zellen, die noch CFSE-Fluoreszenz behielten. Diese Population war bei Patienten mit Stammzellen, Behandlungsresistenz und hoher Ähnlichkeit mit schubverursachenden Zellen assoziiert13. Dementsprechend stellt dieser Farbstoff ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Leukämie-Stammzell-Phänotypen (LSC) bei T-ALL dar.
Ziel der Arbeit ist es, die Anwendung des Zellproliferationsfarbstoffs auf die Untersuchung der Stille in vivo mit Hilfe eines Zebrafisch-T-ALL-Modells auszuweiten. Insbesondere das rag2:Myc-getriebene Zebrafisch-T-ALL-Modell14 bietet aufgrund der hohen Häufigkeit von LSCs im Vergleich zu Mausmodellen und menschlichen Krankheiten15 einen hervorragenden Ort für die Untersuchung der Selbsterneuerung. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Zebrafischen groß angelegte Transplantationsstudien, die im Vergleich zu ihren Gegenstücken bei Mäusen mit wesentlich geringeren Pflege- und Wartungskosten durchgeführt werdenkönnen 16. Zebrafische eignen sich auch hervorragend für Live-Imaging-Anwendungen, da fluoreszenzmarkierte Tumorzellen mit einem einfachen Fluoreszenzmikroskop leicht betrachtet werden können, um die Rate der Tumorentwicklung abzuschätzen16.
In diesem Protokoll beschreiben wir den Arbeitsablauf für die Färbung von T-ALL-Zellen von Zebrafischen mit Zellproliferationsfarbstoff, gefolgt von der in vivo Vermehrung von gefärbten Zellen in syngenen CG1-Zebrafischen. Bei der Entwicklung von Leukämie beschreiben wir die Sortierung der Zellen, die den Farbstoff zurückhielten, und ihre Verwendung für ein anschließendes Transplantationsexperiment zur Begrenzung der Verdünnung, um die Raten der LSC-Selbsterneuerung zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann für weitere Anwendungen erweitert werden, einschließlich des In-vivo-Wirkstoffscreenings potenzieller Verbindungen für das Targeting von ruhenden LSCs. Darüber hinaus können gesammelte Zellen für verschiedene nachgelagerte Analysen verwendet werden, wie z. B. Transkriptomisches Profiling, Proteomik und Metabolomik, was einzigartige Einblicke in das Verhalten ruhender LSCs bei T-ALL bietet.
Es ist bekannt, dass LSCs resistent gegen konventionelle, antiproliferative Chemotherapien sind, und die Suche nach gezielten Therapien gegen diese Zellen ist vielversprechend, um das Auftreten von Rückfällen zu reduzieren und die Patientenprognose zu verbessern20. Frühere Forschungen beschrieben die Verwendung von fluoreszierenden Zellproliferationsfärbungen zur Identifizierung einer kleinen Population ruhender Zellen, die mit Arzneimittelresistenz und Stammz…
The authors have nothing to disclose.
Die Finanzierung dieser Forschung erfolgte durch das National Cancer Institute (R37CA227656 to JSB). Diese Forschung wurde auch durch die gemeinsamen Ressourcen für Durchflusszytometrie und Immunüberwachung des Markey Cancer Center (P30CA177558) der University of Kentucky unterstützt.
26 G/2” micro-syringe | Hamilton | 87930 | NA |
35 µm filter cap FACS tubes | Falcon | 352235 | NA |
40 µm cell strainer | CELLTREAT | 229482 | NA |
96-well skirted PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB0800 | NA |
Cell sorter | Sony Biotechnology | SY3200 | NA |
CellTrace Far Red | Thermo Fisher Scientific | C34564 | NA |
Conical tubes | VWR | 10026-078 | NA |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | NA |
DMSO | Sigma-Aldrich | D4818 | NA |
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS) | Caisson Labs | 22110001 | NA |
Epifluorescence stereo microscope | Nikon | SMZ25 | NA |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | 12306C | NA |
Fish system water | N/A | N/A | 0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | C2171 | NA |
MS-222 | Pentaire | TRS-1 | tricaine mesylate, an anesthetic |
Petri dishes | Corning | 07-202-011 | NA |
Razor blades | American Line | 66-0089 | NA |
Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | NA |